通过选择性磷硫酰烷基化方法，实现寡核苷酸的非离子对反相液相色谱分析

《Journal of Chromatography A》：Ion-pair-free reversed-phase liquid chromatographic profiling of oligonucleotides through selective phosphorothioate alkylation

　　

作者：Quang-Dong Bui、Tien-Anh Duong、Daniel E?er、Bart Noten、Tiny Deschrijver、Sebastiaan Eeltink

比利时布鲁塞尔自由大学（VUB）化学工程系，布鲁塞尔1050

摘要

磷硫酸酯（PS）寡核苷酸通常含有关键杂质，包括磷酸二酯键和较短变体。由于这些物质的结构相似性很高，如果不添加离子配对剂，很难通过反相液相色谱法进行分离。在这项研究中，我们探讨了一种针对硫原子的选择性烷基化策略，从而能够区分具有不同数量PS修饰的寡核苷酸，进而利用无离子配对的RPLC方法进行全面的杂质分析。传统的寡核苷酸表现出明显的“开-关”保留机制，而烷基化处理后这种机制减弱了。通过使用两个串联的150毫米色谱柱并在柱温为5°C的条件下，实现了含有多个PS修饰的寡核苷酸的非对映体分离。对于含有三个和四个PS修饰的寡核苷酸序列，分别有6个和11个非对映体能够被分离出来。

引言

寡核苷酸（ONs）最近作为基于基因的治疗方法进入制药市场，用于治疗多种罕见疾病，通过选择性抑制功能异常的基因表达[[1], [2], [3]]。从结构上看，ONs由核苷酸链组成，具有核糖-磷酸骨架和核碱基，形成单链或双链结构。磷硫酸酯（PS）修饰是指将磷酸基团中的一个非桥接氧原子替换为硫原子，这种修饰通常用于提高ON的稳定性、生物利用度和细胞摄取[4]。PS ON的合成采用固相合成方法，通过循环偶联反应依次添加每个核苷酸，然后在特定位置对磷酸基团进行硫化。如果硫化步骤不完全，可能会产生结构相关的磷酸二酯杂质（PO），这些杂质与目标产物仅在不同位置的硫和氧原子上有所差异[5,6]。当引入PS修饰时，磷酸基团成为手性中心，每个位置会产生两种非对映体（R_p和S_p构型[7,8]），从而导致序列产生2ⁿ种不同的非对映体，这大大增加了样品的复杂性。

传统的离子配对反相液相色谱（IP-RPLC）用于ON的表征时，通常使用烷胺作为离子配对试剂，这些试剂容易残留在LC-MS系统中，需要复杂的清洗程序。此外，通常用于增强MS信号强度的氟化醇可能会形成全氟和多氟烷基化合物[9]。使用C₁₈柱的无离子配对RPLC通常不适合寡核苷酸的表征，因为其选择性有限，无法充分区分主要产物和结构相似的杂质。特别是PS和PO杂质，它们仅通过硫原子替换氧原子而有所不同，但具有几乎相同的疏水性[10]。虽然已经探索了使用其他固定相（例如基于苯的相）的方法，但这些方法通常无法达到与传统的IP-RPLC方法相同的分离效果[11]。亲水相互作用液相色谱（HILIC）作为一种无离子配对的替代方法也受到了越来越多的关注，尽管在某些条件下MS灵敏度可能仍然有限[12,13]。总体而言，这些最新发展反映了人们对无离子配对色谱策略的兴趣日益增加，以克服离子配对试剂带来的限制。

可以通过在PS连接处的亲核硫原子上附着疏水标签来调节PS ON的疏水性。最近关于PS ON烷基化的研究主要集中在提高治疗活性方面，引入了荧光标签和亲和标记[14,15]。在这项研究中，我们评估了针对磷硫酸酯基团的选择性烷基化反应的效率。然后通过无离子配对的RPLC方法评估了烷基化产物的保留机制。最后，优化了HPLC方法用于ON标记物的表征，使其能够与相应的关键杂质分离，并进一步实现非对映体的分离。本研究评估了PS烷基化作为无离子配对RPLC寡核苷酸表征策略的潜力，包括杂质分析和非对映体分离。

章节摘录

化学品和材料

碳酸氢铵（AmBC）、溴化苄基和N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙酸钠从Sigma-Aldrich（德国Steinheim）购买；乙腈（MeCN，HPLC超梯度质量）和乙醇（HPLC级）从Biosolve（荷兰Valkenswaard）购买；碘化钾（KI）从Merck Group（德国Dampstadt）购买；去离子水（≤ 0.055 μS）使用Milli-Q系统（Millipore，法国Molsheim）自制。治疗性2’修饰RNA序列

磷硫酸酯烷基化：反应设计

PS烷基化使用溴化苄基作为亲电烷基化剂，在KI作为碘化物促进剂的存在下进行，反应方案见图1。从机制上看，碘化物首先通过Finkelstein型卤素交换将溴化苄基转化为更具反应性的苄基碘化物（步骤1），从而促进后续的烷基化步骤[18]。然后磷硫酸酯基团的硫原子通过S_N2途径在苄基碳上进行亲核攻击

结论

在这项研究中，我们证明了结合选择性PS烷基化的高分辨率无离子配对RPLC方法可用于PS-ONs的杂质分析和非对映体表征。烷基化反应在1小时内完成，使用KI作为催化剂，随着PS修饰位点数量的增加，ON的疏水性系统性增强。在较低柱温下，非对映体的分离能力显著提高

CRediT作者声明

Quang-Dong Bui：概念构思、研究方法、撰写——初稿；Tien-Anh Duong：分析和审稿；Daniel E?er：分析和审稿；Bart Noten：质谱分析和审稿；Tiny Deschrijver：审稿与编辑、监督；Sebastiaan Eeltink：概念构思、撰写——审稿与编辑、资金获取、监督。

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利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢创新与创业机构（VLAIO）提供的资助（项目编号HBC.2021.1125）。我们还要感谢Flanders生物技术研究所（VIB，比利时布鲁塞尔1050）的Van-Son Nguyen博士提供的技术支持，以及布鲁塞尔自由大学（VUB）化学工程系的Ken Broeckhoven博士在ONs保留机制方面提供的宝贵建议。