利用解吸电喷雾离子化高分辨率质谱成像（DESI-MSI）技术直接分析唐代慕容志墓中的丝质染料 钱宇、 张峰、 吕文超、 王妍、 钟雷、 顾文婷、 刘俊梅、 刘新燕、 徐东辉 以及 艾娜西 （共2位作者）

《Separations》：Direct Analysis of Silk Dyes from the Murong Zhi Tomb from the Tang Dynasty Using Desorption Electrospray Ionization High-Resolution Mass-Spectrometry Imaging (DESI-MSI) Qian Yu, Feng Zhang, Wenchao Lv, Yan Wang, Lei Zhong, Wenting Gu, Junmei Liu, Xinyan Liu, Donghui Xu and Nasi Ai + 2 authors

　　摘要
在古代纺织品中识别染料对于研究其来源和科学保护至关重要。然而，由于这些文物的极高价值，必须使用非破坏性分析技术。为了建立一种非破坏性、原位、准确且快速的识别古代丝绸织物样本中天然染料的方法，我们采用了解吸电喷雾电离高分辨质谱成像（DESI-MSI）技术。通过优化关键仪器参数——包括样品预处理方法、DESI喷雾溶剂组成和DESI加热传输线（HTL）温度——我们确定了最佳的质谱成像条件。获得最高质谱离子峰信号强度和最佳成像质量的最佳条件如下：使用双面胶带进行样品预处理；喷雾溶剂由甲醇（100%，v/v）和0.1%甲酸以及0.1 μg/mL的亮氨酸内啡肽组成；HTL温度为400°C。G42丝绸织物样本中的特征化合物被成功分离出来。根据主要成分的特征质量电荷比，该化合物初步被鉴定为小檗碱。这一结果通过串联质谱成像和串联质谱进一步验证，并最终通过与参考标准质谱的比较得到确认。因此，样本中染料的来源被确定为阿穆尔软木树。实验证明了DESI-MSI方法在珍贵纺织品非破坏性分析中的适用性和准确性。这项工作强调了使用此类非破坏性技术的迫切需求，以支持高价值、难以接触或易碎丝绸文物的识别，并指导这些文物的历史追踪和保护。

1. 引言
纺织品中的天然染料是重要的文化价值和技术知识载体[1]，对染料成分的分析对于历史研究具有重要意义[2]。古代纺织品中的染色技术主要基于植物染料，这些染料种类繁多且历史悠久。随着染色技术逐渐系统化和成熟，出现了一个全面而有结构的颜色系统，为古代文明中的纺织品奠定了重要基础[3]。红色、蓝色和黄色是古代植物染料中最重要的三种颜色。然而，由于地理环境和文化传统的差异，不同地区使用的植物染料类型也有所不同。在古埃及、希腊和中世纪欧洲，红色染料主要来自茜草[4,5]，而胭脂红则用于中美洲和南美洲[6]，红花则在中国、日本和埃及广泛使用[7,8,9]。此外，古代地中海地区还使用了龙血树和红藻等染料植物[10]。在蓝色染料中，靛蓝的使用历史最为悠久，在印度、中国和欧洲广泛传播[11]，其使用可以追溯到公元前3000年，当时已经用于纺织品染色，其发酵、氧化和还原的技术一直传承至今[12]。北非和中东地区生长着印度蓝[13]。姜黄（Curcuma longa）是欧洲、东亚和南亚等地区的主要黄色染料来源[8]。在中欧和西欧，焊料常被用作黄色染料，而在东亚，则更多使用宝塔花和阿穆尔软木树[14]。古代植物染料的贸易和传播主要通过陆地丝绸之路和海上丝绸之路等关键路线进行[15]。这些路线不仅促进了商品交换，还推动了文化和技术的传播。
染料鉴定对文物的保护、历史研究和文化传承具有重要意义。在保护和修复层面，分析染料的来源、染色过程以及老化程度可以为制定科学保护计划和实施精确的文物修复提供关键依据，有效避免对文物的二次损害[16]。在历史和文化研究层面，染料的类型和工艺特征可以直接反映古代社会的技术水平、文化交流和贸易往来[17,18,19,20,21]，并提供关于纺织品年代测定和来源追溯的重要证据[16,18,22]。此外，染料还具有象征意义和艺术内涵[23]。在技术分析和工艺研究层面，现代检测技术（如高效液相色谱法（HPLC）、光谱技术和质谱法（MS）的应用加深了我们对复杂古代染色过程的理解[24]。在文化传承层面，染料鉴定有助于恢复失传的传统染色技术，并为传统工艺的复兴提供科学依据[25]。此外，相关测试数据还可用于建立专业的染料数据库，为后续的研究和保护工作奠定基础[26]。
目前，古代纺织染料的鉴定已经发展成为一个结合色谱法、光谱法和质谱法的多维方法体系。在这些方法中，高效液相色谱法（HPLC）因其高分离效率而常与质谱法（MS）结合使用，广泛应用于茜草等复杂天然染料成分的定性和定量分析[27]。虽然这种方法能够准确识别分子结构，但需要对文物进行破坏性取样。对于具有重大价值的艺术品来说，保护其完整性始终是首要考虑的因素。这一需求推动了非侵入性分析技术的发展，这些技术越来越多地应用于色素研究[28]。光谱技术以其非破坏性测试能力而闻名：如光纤反射光谱法（FORS）和荧光光谱法（FS）可以直接分析文物的表面，但它们容易受到弱信号和荧光干扰的影响。表面增强拉曼光谱法（SERS）具有高灵敏度，但难以区分混合染料成分[29]。解吸电喷雾电离质谱法（DESI-MS）是一种环境友好、开放式的软电离质谱技术，具有样品预处理简单、实验程序简便、分析速度快、信息直观等优点，同时还具有高特异性、高灵敏度、高通量、无需标记、原位分析能力和环保特性[30,31]。目前，该技术已广泛应用于指纹成像[32]、法医鉴定[33,34]、毒物和药物检测[35,36]、癌症诊断和治疗、生物医学、药物分析、食品安全、动植物生理学、材料表征等领域[37,38,39,40,41,42,43]。鉴于历史文物的突出文化价值，这类研究往往受到样本量小、易碎性和避免破坏性取样的限制[28,43]。DESI-MS分析技术在研究易碎文物方面显示出良好的应用前景，因为它具有原位分析能力。然而，关于该技术用于识别古代纺织品中染料的报道仍然较少，这激发了本研究。本文介绍了DESI-MS在鉴定从中国唐朝慕容志墓中出土的丝绸织物中天然染料的应用，并展示了成像实验的初步结果。

2. 材料与方法
2.1. 试剂
溶剂和材料
G42丝绸织物样本（G42）是一小块（1 cm2）棕黄色的丝绸织物，自然从一件袍子的内衬上脱落。它出土于中国甘肃省武威市天柱县茶山村唐朝慕容志墓（M1）的墓主右侧。自发现以来，该样本未经任何处理就被保存了下来。该样本由甘肃省有机文物降解机制与保护技术研究项目提供。H2O、CH3OH和CH3CN（LC-MS等级）购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市的ThermoFisher Scientific公司。亮氨酸内啡肽和小檗碱购自美国马萨诸塞州波士顿的TargetMol Chemicals Inc.公司。双面胶带和定制盖玻片（76 mm × 26 mm）在当地购买。

2.2. 仪器
DESI-MSI分析是在一个包含DESI XS源（Waters，马萨诸塞州米尔福德市）（图1）、Q-TOF/MS（XevoMRT，Waters）和溶剂输送系统（ACQUITY UPLC M-Class μBSM，Waters）的平台上进行的。
图1. DESI XS源的照片。

2.3. DESI-MS分析
使用DESI XS-XevoMRT质谱仪（Waters，马萨诸塞州米尔福德市）检测G42丝绸织物样本的分布。将大约1 cm2的G42丝绸织物样本用双面胶带固定在76 mm × 26 mm的玻璃载玻片上，并置于DESI离子源的平台上。数据以正/负DESI电离模式和全扫描MS检测方式获得。工作参数如下：毛细管电压设置为0.5 kV（负模式）和0.7 kV（正模式）；质量范围为m/z 50–1200；收集角为10°；喷雾角度为70°；喷雾器与表面距离为1.0 mm；像素大小为30 μm × 30 μm；扫描速率为20 Hz；N2压力为0.9 bar；源温度和加热传输线（HTL）温度分别保持在150°C和400°C。喷雾溶剂由含有0.1%甲酸和100 ppb亮氨酸内啡肽（用于实时校正质谱信号的添加剂）的甲醇组成，流速为2 μL/min。为了鉴定化合物，对MS/MS谱中的每个峰的详细信息进行了扫描。共提取了1000个离子以生成MSI（HDI v1.9，Waters）。通过MassLynx软件（v4.2，Waters）确定了离子的元素组成。

3. 结果
3.1. 丝绸织物样本的制备
在制备DESI样本时，应注意确保样本的稳定性，以保证目标分析物的重复性和灵敏度。固定是实现这一目标的关键步骤[41]。因此，为了保持样本的原始状态并获得更好的成像结果，需要对样本进行非破坏性固定，固定方法的选择对信号强度和成像质量有重要影响。在本实验中，比较了两种不同固定方法对成像信号的影响。测试中使用了两种固定工具：定制盖玻片（图2a）和双面胶带（图2b），选择了信号强度更高的固定工具。如图2c,d所示，双面胶带的成像信号强度高于定制盖玻片（颜色越亮，信号强度越高）。因此，本实验选择使用双面胶带作为固定方法。

3.2. 优化DESI-MS成像分析
DESI高度依赖于多种参数，这些参数涉及仪器、几何和化学方面，其中一个参数的微小变化往往会导致其他所有参数的相应变化。优化喷雾溶剂、加热传输线（HTL）温度、EDC模式等参数可以提高检测灵敏度、减少背景干扰并显著提高电离效率。

3.2.1. 喷雾溶剂的优化
流动相对于实现快速空间靶向检测至关重要[44]。喷雾溶剂的性质会影响分析物的电离效率。我们根据古代G42丝绸织物样本的目标，优化了四种不同类型的喷雾溶剂（表1 A–D），并对丝绸织物样本进行了高空间分辨率的质谱分析。质谱成像图中的颜色差异反映了组成物质的质谱强度。颜色越亮，信号强度越高。研究结果表明，当使用含有0.1%甲酸和0.1 μg/mL亮氨酸脑啡肽的甲醇（体积比为100%）作为喷雾溶剂时，质谱成像信号最强（图3a），并且在质量电荷比为336.1239时质量峰强度最大（图3b）。因此，这种溶剂组合被选为本实验中样品的最佳喷雾溶剂。同时，可以初步推断该化合物为小檗碱。这些结果表明，质谱成像可用于确定G42丝织物样本的分布和半定量分析。表1列出了喷雾溶剂配方。图3：(a) 四种不同喷雾溶剂对通过DESI-MS分析的G42丝织物样本质谱成像图的影响。A–D对应表1；(b) 四种不同喷雾溶剂对通过DESI-MS分析的G42丝织物样本质谱峰信号的影响。A–D对应表1。

3.2.2 加热传输线（HTL）温度的优化
在DESI中，HTL的温度是一个需要根据特定分析物进行优化的参数。通过优化HTL温度，可以增强待测分析物的质谱信号强度。本研究以G42丝织物样本为研究对象，以小檗碱为目标优化HTL温度。我们设置了五种不同的温度等级（100°C、200°C、300°C、400°C、500°C），并对丝织物样本进行了高空间分辨率的质谱分析。结果显示，当温度为400°C时，红色区域的质谱成像信号最强（图4a），质量峰强度最大（图4b）。因此，我们确定400°C的HTL温度是分析G42丝织物样本中化合物的最佳条件。

3.3 使用DESI-MS/MS验证丝织物样本中的染料化合物
在优化的实验条件下，比较并分析了G42丝织物样本中特征化合物的一级和二级质谱图，数据通过HDI v1.9软件处理，获得了化合物的一级质谱图像（图5a）、二级质谱图像（图5b–d）以及相应的二级质谱（图5e），从而进一步验证该物质为小檗碱。同时，对化合物中七个高信号强度碎片离子的基本信息进行分析（表2），发现所有碎片离子的质量精度均在1 ppm以内，这充分证明了该鉴定方法的可靠性。

3.4 通过使用小檗碱标准物确认丝织物样本中的染料化合物
为了确认小檗碱是G42丝织物样本中的成分，比较了小檗碱标准物的DESI-MS/MS质谱图像与样本中的小檗碱质谱图像（图7）。结果表明，它们的二级质谱完全相同。因此，可以确认该成分确实是小檗碱。小檗碱是阿穆尔软木树的主要染色成分，在中国古代常被用作天然黄色染料[46]。小檗碱是一种季铵生物碱，具有特征性的黄绿色荧光。通过煮沸阿穆尔软木树可以提取小檗碱。作为一种阳离子染料，它与丝绸和羊毛等纤维上的负电荷基团发生静电作用，形成稳定的键合，赋予纤维黄色。这一过程是古代染色技术的重要组成部分，并在中国历史文献中有详细记载。因此，可以推断从唐代慕容志墓中出土的G42丝织物样本中的染料来源于阿穆尔软木树，这也与样本观察到的颜色一致。

4. 讨论
古代丝绸织物中染料的分析是一项高度复杂且多学科的任务。由于古代织物的珍贵性、脆弱性和化学复杂性，分析过程面临一系列独特且重大的挑战。DESI-MSI技术的引入使得古代丝绸中染料的分析更加直观和高效。这种原位方法的应用特别适用于那些经过保护处理且无法取样研究的丝绸织物。DESI-MSI能够可视化织物上染料的空间分布，识别主要染料化合物，并分析图案化织物，从而有助于我们理解古代纺织染色技术和染料分布特性。通过优化参数，DESI-MSI可以显著提高质谱和成像信号的强度，从而提高分析效率和准确性，使鉴定结果更加可靠。在本研究中，采用了DESI-MSI技术，并通过优化测试参数，鉴定出从慕容志墓出土的G42黄色古代丝织物样本中的主要染料成分是小檗碱。这一成分与古代文献中记录的阿穆尔软木树的主要成分一致，也符合样本的颜色。因此，可以推断样本中的染料来源于阿穆尔软木树。

然而，使用DESI-MSI分析纺织品中的天然染料仍面临一些挑战。例如，在样品固定步骤中，常用的双面胶带方法可能会引入聚合物背景信号和挥发干扰。为了减轻这些风险，需要选择低挥发性和低聚合物含量的双面胶带，并进行空白背景测试以评估信号干扰。或者，可以考虑开发专门为纺织品设计的新固定设备。关于媒染剂的使用，它们可能会降低离子化效率并导致样品降解，引起化学性质变化，以及天然染料的低水溶性导致低脱附效率，因此必须评估不同喷雾溶剂系统与DESI检测天然染料之间的兼容性。其他可行的方法包括探索非传统溶剂以增强离子化效果，或优化关键仪器参数以提高分析的准确性和适用性。这些方法可以显著增强信号强度和检测灵敏度，最终提高分析的准确性、全面性和适用性。未来的研究将致力于将DESI-MSI应用于更复杂的系统和未知分析物，并通过整合历史学、化学和材料科学等领域的知识来加强跨学科合作。这将扩展这种方法在复杂染料分析中的应用，增强其综合识别能力，并促进古代丝绸染料研究的进一步发展。

5. 结论
在本研究中，我们开发了一种优化的解吸电喷雾电离质谱成像（DESI-MSI）方法，并建立了相应的可视化分析工作流程，用于非破坏性地检测古代丝绸织物中的天然染料。通过确定关键实验参数——使用双面胶带进行样品固定；采用最佳DESI喷雾溶剂（体积比为100%的甲醇，添加0.1%甲酸和0.1 μg/mL亮氨酸脑啡肽）；并将加热传输线（HTL）温度设置为400°C——我们显著提高了质谱成像和质谱中的信号强度。经过这些优化后，化合物被有效分离。根据丝样本中主要成分的特征质量电荷比，初步鉴定出该化合物为小檗碱，并通过串联质谱成像进一步验证。此外，使用DESI-MS/MS EDC模式使质谱信号强度增加了六倍，显著提高了识别的可靠性。最后，通过与参考标准的串联质谱对比确认了该化合物为小檗碱。该化合物与古代文献中记录的阿穆尔软木树的主要成分一致，也与样本的颜色相匹配。因此，可以推断样本中的染料来源于阿穆尔软木树。优化的DESI-MSI方法成功地应用于古代丝绸织物中天然染料的分析，证明了其适用性和准确性。在整个分析过程中，样品仅用双面胶带轻轻固定，分析完成后可以轻松去除，然后可以直接存档或用于其他补充分析。这项技术可以支持珍贵、难以获取或脆弱的丝绸文物的鉴定和保护。