在代谢物MALDI质谱成像技术的指导下，对燕麦籽粒进行了组织分辨的蛋白质组学表征

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Tissue-resolved proteomic characterization of oat grains guided by metabolite MALDI mass spectrometry imaging

　　摘要：尽管人们对燕麦在营养强化和功能性作物改良等应用方面的兴趣日益增加，但其在细胞和蛋白质组水平上的代谢结构仍然知之甚少。在本研究中，我们采用了基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）技术来绘制燕麦籽粒组织中的代谢物分布图，并明确代谢物定位的主要区域。这些富含代谢物的区域，尤其是麸皮、胚乳和胚，随后被分离出来进行蛋白质组学分析，共检测到大约3700种蛋白质。基因本体分析突出了与每个区域相关的高特异性功能和生物过程。进一步研究关键蛋白质后发现，胚中富含能量生成、翻译和抗逆性等核心细胞功能，胚乳中富含营养物质储存功能，而麸皮则具有中等的功能特征。这些发现为了解燕麦籽粒内部的代谢功能空间组织提供了新的见解，并表明需要进一步探索这些子区域，以更深入地理解燕麦的代谢结构。

图形摘要：该图像的替代文本可能是通过人工智能生成的。

引言：燕麦（Avena sativa L.）是最受欢迎的食物作物之一，在全球产量排名中位列第七（https://www.fao.org/faostat/en/，访问日期：2026年1月22日）。与其他谷物相比，燕麦具有独特的营养成分，其特点是高油含量和可溶性纤维含量[1, 2]。燕麦中的醇溶蛋白（avenins）与小麦和大麦中的麸质蛋白类似，但几乎不引起乳糜泻免疫反应[3]。此外，燕麦富含阿魏蒽酰胺（avenanthramides），这是一种具有抗炎和抗氧化特性的酚类化合物，与减肥、改善心血管健康和降低血液胆固醇水平有关[4,5,6,7]。随着对更健康、更可持续和植物性食品来源的需求增加[8]，燕麦因其营养价值、可持续性和低过敏性而在消费者和食品工业中越来越受欢迎。去除外壳后，燕麦的可食用部分主要由胚乳和胚组成。胚是最内层的部分，是发芽过程的起点；而胚乳是最大的淀粉组织，作为养分库支持幼苗的生长和发育[9]。这两个部分可以进一步划分为不同的组织和细胞类型，胚乳周围包裹着富含营养的麸皮层（亚糊粉层、糊粉层和外种皮层），胚则包含盾片、胚芽和胚根[10]。尽管这种分化在不同谷物物种中高度保守，但籽粒内的营养分布可能有所不同[11]。例如，脂质主要积累在大麦和小麦的胚中，而在燕麦中则较多地存在于胚乳和糊粉层[12,13,14]。因此，谷物的代谢结构具有物种特异性，不能将一种谷物的研究结果普遍应用于其他种类。了解每种组织类型的生理或功能作用有助于设计针对作物改良的基因改造策略。过表达一种燕麦胚乳特异性的WRINKLED1转录因子同源物可使小麦胚乳中的油积累量增加九倍，而小麦通常在胚中储存油脂[15]。另一项研究表明，在玉米胚乳中表达玉米胚WRINKLED1同源物并未显著增加油含量，这突显了基因工程对不同组织的特异性反应[16]。蛋白质组学已被广泛用于表征谷物中的蛋白质谱型，特别是小麦，包括研究不同籽粒组分[17, 18]。在燕麦研究中，蛋白质组学也被用于探究营养代谢，这得益于已注释的燕麦基因组和翻译后的肽序列数据库[3, 19, 20]。然而，这些研究大多针对整个籽粒进行，可能掩盖了组织特异性的蛋白质调控。迄今为止，关于燕麦主要籽粒组分间蛋白质组变化的了解仍然有限。虽然可以通过传统的组织学染色方法区分燕麦籽粒的各个部分，但这些方法主要反映的是结构和形态特征，而非功能性的生化异质性。质谱成像技术，尤其是基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI），能够直接可视化原位的代谢物分布，揭示仅凭组织学特征难以察觉的代谢区室化和分析物异质性。将MALDI-MSI应用于植物和谷物组织的研究表明，不同组织类型的代谢物和脂质具有明显的定位模式，反映了超越可见解剖结构的潜在生化过程[21]。尽管经过组织内胰蛋白酶消化后的MALDI-MSI可以提供空间分辨的肽信息，但这种方法需要酶消化和多个样品制备步骤，可能导致肽的位移并降低空间精度，尤其是在富含淀粉和脂质的籽粒组织中[14]。此外，基于MALDI-MSI的蛋白质组学方法通常比基于LC-MS/MS的自下而上工作流程具有较低的蛋白质组覆盖率和深度，后者受益于离子的分离和肽识别的提高[22]。相比之下，以代谢物为导向的MALDI-MSI无需酶预处理即可直接分析内源性小分子和脂质，保留了原始的分子分布，为无监督分割提供了可靠的空间信息[23]。利用代谢物MSI指导区域划分，为定义功能相关的组织域提供了科学严谨、数据驱动的框架，随后可以精确切割这些区域进行深入的定量LC-MS/MS蛋白质组学分析。这种整合工作流程结合了代谢物MSI和LC-MS/MS蛋白质组学的互补优势，将内在的代谢组织与全面的蛋白质表征相结合，实现对燕麦籽粒生物学的组织解析理解。

方法：
**植物材料与化学品**
成熟的燕麦籽粒由南澳大利亚研究与发展研究所（SARDI）提供。明胶（#G2500）、二硫苏糖醇（DTT）、碳酸氢铵、Tris、氯化钠（NaCl）、尿素、2-氯乙酰胺和十二烷基硫酸钠（SDS）均从澳大利亚的Merck公司购买。α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA，#8201344）从德国的Bruker Daltonics公司购买。胰蛋白酶Gold（#V5280）从澳大利亚的Promega公司购买。LC-MS级甲酸和乙腈（ACN）从澳大利亚的ChemSupply公司购买。

**燕麦组织切片**
燕麦籽粒的切片按照先前建立的方案进行，稍作修改[14]。将燕麦籽粒嵌入10%的明胶（w/v）中，并在-20°C的冰冻切片机中切成20-μm厚的切片（Leica，德国）。切片固定在氧化铟锡（ITO）涂层载玻片上（Bruker Daltonics，德国），并储存在-80°C下用于MALDI-MSI实验；或储存在聚萘酸乙二醇酯（PEN）膜载玻片上（Leica，德国）用于蛋白质组学分析，每个样本重复三次。

**基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）**
切片在真空环境中解冻30分钟，然后使用iMatrixSpray系统（瑞士）将10 mg/mL的HCCA（在50% ACN（w/v）中加入100 mM NaCl）沉积到燕麦切片上，具体操作参数参见先前报道[20]。加入钠盐以提高中性脂质和代谢物的检测效率[14]。MALDI-MSI数据采集使用timsTOF fleX质谱仪（Bruker Daltonics）进行，通过timsControl（版本3.0.21，Bruker Daltonics）和FlexImaging（版本7.0，Bruker Daltonics）在正离子模式下以20 μm分辨率采集，仪器设置详见表S1。离子分布图像使用SCiLS Lab（版本2023a Pro，SCiLS，Bruker Daltonics）生成。数据通过均方根方法归一化到99%的四分位数，并进行了弱去噪处理。MALDI-MSI数据集在METASPACE（https://metaspace2020.org）中处理[24]。选择CoreMetabolome数据库进行m/z特征注释，质量容忍度为3 ppm，假发现率（FDR）低于10%。数据集进一步进行了处理，以去除植物中不存在的代谢物。

**蛋白质组学分析样品制备**
通过MALDI-MSI数据的无监督分割识别出的各个生物重复样本的组分（麸皮、胚乳和胚）在放大镜下用手术刀切割并转移到0.5-mL的Protein LoBind管中（Eppendorf，澳大利亚）。样品在组织制备当天进行蛋白质组学分析。蛋白质提取时，向切割组织中加入100 μL的4% SDS、100 mM Tris和1 mM DTT。混合液在95°C下涡旋加热5分钟，然后超声波处理15分钟，再煮沸15分钟，随后在20,000 × g下离心10分钟。收集上清液，并用4:1体积的冷冻醋酮在-20°C下沉淀蛋白质。离心后弃去上清液，蛋白质沉淀物重新溶解在6 μL的8 M尿素中，加入50 mM碳酸氢铵。蛋白质浓度使用Bradford法（Bio-Rad，美国）测定。对10 μg蛋白质提取物进行还原和烷基化处理，首先加入DTT（最终浓度110 mM）处理1小时，然后加入2-氯乙酰胺（最终浓度125 mM）处理30分钟。样品稀释至1.6 M尿素溶液中，加入50 mM碳酸氢铵并在37°C下与200 ng胰蛋白酶Gold共孵育过夜。为抑制进一步反应，用甲酸将pH调整至2，并使用C18 ZipTip?移液头（Merck，澳大利亚）进行肽清洗，然后在50°C的真空离心机中干燥。肽重新溶解在20 μL的0.1%甲酸水中，用于LC-MS/MS分析。

**液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析**
肽的LC-MS/MS分析在ACQUITY UPLC M-Class系统（Waters，美国）上进行，与ZenoTOF 7600质谱仪（SCIEX，新加坡）连接。原始数据使用SCIEX OS（版本3.1.0）采集。肽（相当于500 ng）以2.4 μL/min的流速加载到1.5 μm 100? Reprosil Saphir C18 200μm ID × 150 mm柱子上（#AR1-45143，PremierLCMS，加拿大），柱子加热至40°C。肽在梯度条件下分离：3–25%的流动相B（0.1%甲酸在ACN中）持续40分钟，然后是90%流动相B的清洗步骤3分钟，以及3%流动相B的平衡步骤7分钟。Zeno SWATH采集方案（64个可变大小窗口，覆盖400–750 m/z的前体质量范围），MS/MS积累时间为13 ms。喷雾电压设定为5000 V，离子源气体1和2分别为20和15 psi，帘幕气体为35 psi，碰撞气体（CAD）为7 psi，源温度为150°C。

**蛋白质组数据处理、分析与可视化**
原始LC-MS/MS数据使用Spectronaut?（版本19.7.250203，Biognosys，瑞士）和directDIA+?工作流程及默认参数进行分析（酶，胰蛋白酶/P；固定修饰，羰氨甲基（C）；可变修饰，乙酰（蛋白质N端）和氧化（M）；假发现率，1%）。MS/MS数据与一个内部FASTA数据库进行了比对，该数据库包含了从Avena sativa – OT3098 v2基因组组装（PepsiCo，https://wheat.pw.usda.gov/jb?data=/ggds/oat-ot3098v2-pepsico）的基因注释中预测的蛋白质序列，包含257,893条记录。差异表达的蛋白质仅根据MS2水平的数量进行筛选，对数2倍变化阈值设为1，调整后的p值阈值小于0.05。变化倍数通过RStudio生成的火山图进行可视化。进行了主成分分析（PCA）并用Spectronaut?进行可视化，功能富集分析在gProfiler上进行，以Avena sativa OT3098作为参考生物体。热图使用MetaboAnalyst 6.0或Heatmapper2[25]生成。条形图和点图使用GraphPad Prism（版本10.0.2，美国波士顿）生成，统计显著性通过ANOVA评估。

通过对燕麦谷粒进行MALDI-MSI分析，揭示了代谢物积累的主要区域。为了在蛋白质组学分析之前手动提取主要区域，首先进行了MALDI-MSI分析，以可视化小分子代谢物（图1A）和脂质（图1B）在燕麦组织切片中的分布。MALDI-MSI数据的无监督分割突出了具有独特代谢物特征的明确区域，主要对应于种皮、糊粉层、胚乳和胚（图1A, B）。进一步的分割揭示了外层谷粒内部的更细微结构异质性，在两个数据集中观察到了类似的趋势（图S1）。MALDI-MSI分析获得了93种暂时注释的代谢物和脂质（表S2）。

通过对燕麦谷粒组织的代谢物MALDI-MSI分析，我们可以识别出主要的代谢物积累区域。首先使用MALDI-MSI技术对小分子代谢物（图1A）和脂质（图1B）在燕麦组织切片中的分布进行了可视化，并叠加了无监督分割图。种皮、糊粉层和亚糊粉层被归类为麸皮层。对于C类糖的钠加合物、D类氨基酸、E类脂肪酸、F类磷脂酰胆碱、G类二酰甘油和H类三酰甘油的离子分布图像，使用METASPACE进行了暂时性注释。离子强度从低（蓝色）到高（黄色）不等。m/z为365.10、543.13和689.20的离子，被标注为糖类的钠加合物，主要位于种皮和胚中（图1C）。对于氨基酸，甲硫氨酸在整个切片中普遍存在，而缬氨酸[M+Na]+（m/z 140.06）和脯氨酸[M+H]+（m/z 116.07）显示出与糖类相似的分布模式（图1D）。游离脂肪酸，如十八碳烯酸（m/z 283.26）、二十二碳二烯酸（m/z 309.27）和二十碳三烯酸（m/z 307.26），仅在胚中检测到，特别是在盾片中（图1E）。与先前的报告[20]类似，磷脂酰胆碱（m/z 756.55、780.55和805.44）在谷粒的所有区域都有观察到，每种物质都表现出不同的积累模式（图1F）。甘油脂类，如二酰甘油（m/z 617.51、639.49和641.51）和三酰甘油（m/z 855.74、881.75和903.74），在胚乳中富集，后者在糊粉层中的信号更强（图1G, H）。

基于MALDI-MSI数据，我们选择了三个感兴趣的区域进行蛋白质组学分析，即胚乳、麸皮和胚（图2A），因为技术限制无法进一步分离单独的麸皮成分（果皮、种皮、糊粉层和亚糊粉层）。蛋白质组学分析在麸皮中识别出11,434个肽，在胚乳中识别出14,558个肽，而在胚中数量最多，为26,886个（图2B）。这分别对应于麸皮中的1704个蛋白质组、胚乳中的1985个蛋白质组和胚中的3402个蛋白质组（图2C）。所有三种组织类型的中位数变异系数（% CV）范围从11.5%到17.3%，表明了定量结果的重复性（图2D）。PCA清楚地分离出了麸皮、胚乳和胚的部分，第一个主成分解释了它们蛋白质谱中高达70%的变化（图2E）。在三种不同的组织类型中，共识别出3742个独特的蛋白质组，其中43个仅存在于麸皮中，212个存在于胚乳中，1511个存在于胚中（图2F）。基因本体分析显示，胚中富集了与翻译活性相关的蛋白质，麸皮中富集了与小分子代谢相关的蛋白质，胚乳中富集了与催化活性相关的蛋白质（图2G）。

接下来，我们通过差异丰度分析进一步研究了燕麦麸皮、胚乳和胚之间的蛋白质组变化，候选蛋白质的变化倍数阈值至少为2（log2 ≥ 1）。比较胚和胚乳发现，780种蛋白质在胚中上调，而363种蛋白质在胚乳中上调（图3A）。在胚中上调的蛋白质主要与能量生成和翻译有关，而在胚乳中上调的蛋白质则参与碳水化合物和氨基酸代谢（图3A）。在麸皮与胚乳的比较中，共识别出466个候选蛋白质，其中368个在麸皮中上调，98个在胚乳中上调（图3B）。与小分子代谢和有氧呼吸相关的术语在麸皮中的上调蛋白质中富集，而在胚乳中的蛋白质则与碳水化合物调节有关，如糖原（或葡聚糖）代谢、蔗糖代谢和糖酵解（图3B）。最后，比较麸皮和胚发现，313种蛋白质在麸皮中上调，与碳水化合物和小分子代谢相关；619种蛋白质在胚中上调，与RNA处理和能量生成相关（图3C）。

通过差异丰度分析，我们进一步研究了三种组织类型中蛋白质的变化。火山图（左）和条形图（右）显示了通过基因本体学富集的生物过程，这些蛋白质在A胚与胚乳、B麸皮与胚乳、C麸皮与胚之间差异表达。差异丰度分析突出了在多个组织比较中参与能量生成和翻译过程的蛋白质的富集。为了解决这些模式，我们研究了这些蛋白质及其亚基或isoforms的组织特异性表达（图4）。与能量代谢相关的蛋白质，如ATP合成酶、丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶，在胚中通常表现出更高的丰度，在麸皮中则处于中等水平。观察到丙酮酸激酶的isoform特异性丰度模式，因为不同的isoforms在三种组织类型中表现出差异丰度。参与真核生物翻译机制的蛋白质也表现出相似的丰度模式，包括多聚腺苷酸结合蛋白、剪接因子、前mRNA处理因子、核糖体RNA甲基转移酶以及与核糖体生物发生和生产相关的蛋白质。这些蛋白质的富集表明胚中的翻译能力增强。此外，参与反应性羰基化合物解毒的酶乳酰谷胱甘肽裂解酶在胚中更为丰富，这与胚作为代谢活跃区域的作用相符。

接下来，我们检查了与关键作物定量特征（如淀粉、油脂和蛋白质含量）相关的蛋白质的丰度，以进一步了解代谢产出的协调性。固碳酶核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶（RuBisCo）仅在胚中检测到。其他光合作用酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和醛缩酶（ALDO）在胚乳中的丰度显著高于麸皮和胚。相比之下，将葡萄糖底物磷酸化为葡萄糖-6-磷酸的己酮糖激酶（HXK）在胚乳中的丰度较低（图5A）。淀粉合成酶，如葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶大亚基（AGP LSU）和小亚基（AGP SSU）、淀粉合成酶（SS）和葡聚糖分支酶（GBE），在胚乳中最为丰富，其次是麸皮和胚（图5B）。参与脂肪酸合成的酶，包括乙酰-CoA羧化酶2（ACC2）、3-氧酰-酰基-载体-蛋白（ACP）合成酶（KAS）、3-酮酰-ACP还原酶（KAR）和烯酰-ACP还原酶（ENR）也表现出类似的趋势（图5C）。参与下游酰基修饰和三酰甘油组装的酶在各个组织中的差异不大，除了甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT），在胚中的丰度显著较低（图5D）。在种子结构和储存蛋白方面，油质蛋白和vicilin样蛋白在胚乳中的丰度最低，而球蛋白和avenins在麸皮和胚中的丰度显著高于胚（图5E）。我们还研究了avenanthramide合成途径中酶的组织特异性丰度。肉桂酸4-羟化酶（C4H）和苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）表现出对比模式，C4H在胚乳中的丰度最低，而PAL在这一组织中的表达最高（图5F）。羟基肉桂酰-CoA：羟基邻氨基苯甲酸N-羟基酰基转移酶（HHT），这种关键的avenanthramide合成酶在胚中的丰度相对于麸皮和胚显著较低（图5F）。

由于在三种组织类型中观察到了宏量营养素合成相关蛋白质的差异丰度，我们研究了它们与MALDI-MSI衍生的代谢物分布的对应关系。胚中糖的积累与RuBisCO的独特检测结果一致。相比之下，淀粉合成酶的丰度与糖相关代谢物呈负相关（图6A）。氨基酸，作为蛋白质的构建块，在胚中也富集，并且与储存蛋白的定位呈负相关（图6B）。在脂质代谢中，麸皮和胚乳中二酰甘油和三酰甘油的积累与这些组织中脂肪酸合成酶的更高丰度呈正相关。与糖和氨基酸类似，脂肪酸在胚中富集（图6C）。这些结果支持胚乳和麸皮作为主要宏量营养素储存库的角色，而胚则积累代谢可及的分子。

先前的研究使用了非靶向的MALDI-MSI技术来分析哺乳动物或植物组织中的代谢物、脂质或肽，以确定后续蛋白质组学实验感兴趣的区域[26,27,28,29,30,31,32,33,34]，为更深入的分子研究提供了空间生物学背景。到目前为止，这种方法尚未应用于谷物颗粒，因为谷物的组织高度分化，细胞类型适应了特定的功能[35, 36]。在这项研究中，我们首先通过非靶向MALDI-MSI技术分析了燕麦谷物组织中的代谢特征，以确定后续蛋白质组学分析的感兴趣区域。发现麸皮、胚乳和胚组织之间的蛋白质组成有显著差异。我们的发现一致地强调了胚作为一个发育活跃的区域，在能量代谢、翻译能力和保护机制方面具有增强作用，胚乳作为储存库，而麸皮作为一个具有代谢和储存双重功能的中间组织。我们研究了支持作物质量特征的蛋白质和酶，特别是那些与营养含量和分配相关的酶。

燕麦的特点是含有相对较高的油脂含量，这引起了相当大的研究兴趣，因为它对谷物加工和最终用途质量有影响[37,38,39]。游离脂肪酸仅在盾片中检测到。相比之下，ACC2和下游脂肪酸合成酶的水平升高表明胚乳中从头脂质合成的调控强烈，表明脂质中间体在组织间的分配存在差异。参与磷脂生物合成的LPAAT和LPCT在所有组织类型中都普遍存在，这与麸皮、胚乳和胚中广泛检测到磷脂的事实一致。值得注意的是，将麸皮层作为独立的部分进行分离后，发现了GPAT（甘油酰辅酶A还原酶）在不同组织中的显著差异，这种模式在之前仅比较胚乳和胚胎部分的研究中并未观察到[20]。PDAT（磷脂酰胆碱转移酶）通过将酰基链从磷脂酰胆碱转移到二酰甘油上来催化三酰甘油的生成，在胚胎中的含量最少，这进一步证实了麸皮和胚乳中磷脂转化速率更高，从而形成更多的油脂[40]。油酸蛋白负责稳定以油体形式存在的三酰甘油，在胚乳中的含量最少，这与油体在燕麦中倾向于融合成更大结构的报道一致，而高含量的油酸蛋白会阻碍这一过程[41]。麸皮中较高的油酸蛋白含量可能有助于增强胚乳层内油脂的稳定性和保留，这与我们在MALDI-MSI数据中观察到的三酰甘油信号增强相吻合。这些观察结果强调了高分辨率、基于组织的分析在准确解读代谢途径调控方面的重要性。

关键的光合酶，包括RuBisCo（核酮糖-1,5-二磷酸合酶）、GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）和ALDO（醛缩醇还原酶），在籽粒发育过程中通常会下调，因为新碳固定的需求减少，代谢活动转向养分积累[19]。有趣的是，虽然与其他部分相比，我们在胚乳中观察到GAPDH和ALDO的含量仍然较高，但作为主要碳固定酶的RuBisCo并未在该组织中被检测到。我们推测这可能是由于随着种子成熟，胚乳不再进行活跃的碳固定；而胚乳中RuBisCo的存在可能有助于种子萌发期间的快速代谢激活[42]。这一点还通过MALDI-MSI显示的胚乳中糖分的积累得到了进一步支持。相比之下，hexokinase（己糖激酶）的含量较低，而胚乳中淀粉合成酶的含量较高，表明其代谢偏向于淀粉积累[35]。另一方面，主要的种子储存蛋白如球蛋白和avenins在麸皮和胚乳中的含量较高。相比之下，作为蛋白质基本构建块的氨基酸在胚胎中的含量最多，其次是麸皮。这些观察结果进一步强调了胚乳作为主要储存组织的高合成能力，同时突出了胚胎作为代谢活跃区域而非大分子储存场所的角色。

通过将我们的发现与小麦进行比较（小麦是一种其蛋白质组和代谢组已经被广泛研究的模式作物），我们发现了一些共同的分子特征。例如，MALDI-MSI显示整个小麦结构中都积累了甲硫氨酸，在胚胎中积累了缬氨酸，在胚乳和麸皮中都积累了糖分，这与我们在燕麦中的观察结果一致[43]。针对细胞类型的小麦代谢组研究显示，在淀粉质胚乳中糖分和氨基酸的含量下降，但在整个籽粒发育过程中胚乳中的积累量增加[18]。这与另一项研究报道的成熟小麦籽粒中胚乳中麸质蛋白含量较高的情况相符[17]。亚胚乳层的分离揭示了与胚乳和胚乳组织不同的蛋白质组谱型，突显了 cereal 穗粒结构内的复杂分子异质性[17, 44]。通过MALDI-MSI分析，我们区分出了种皮、胚乳/亚胚乳层、胚乳和胚胎等主要部分。值得注意的是，在这些主要区域内还观察到了额外的差异，表明存在进一步的亚区域特化。尽管在毫米级尺度上进行分离可能会导致不同组织之间的交叉污染，但观察到的区域间蛋白质组差异表明这种方法足以捕捉到主要籽粒组成部分的广泛分子异质性。正如本研究所证明的，特定蛋白质异构体的表达可能依赖于组织，了解它们的空间分布对于制定作物改良的最佳育种策略至关重要。然而，要解析细胞类型的特异性蛋白质组变异，需要更精细的空间分辨率。不过，未来结合激光捕获微解剖技术可能能够实现特定细胞类型的靶向分离，从而对燕麦籽粒进行更精细的空间分辨蛋白质组分析[45]。

除了大量营养素外，燕麦还含有一组独特的酚类生物碱——avenanthramides，由于其抗炎、抗氧化和止痒特性，常用于化妆品产品[6, 46]。在这里，我们展示了参与avenanthramide合成酶的组织特异性含量。虽然C4H和PAL参与avenanthramide的生物合成，但它们也广泛参与黄酮类化合物的生物合成途径[47]；因此，它们的含量可能直接反映了avenanthramide的积累情况。另一方面，HHT（氢化氢醌）是avenanthramide生物合成的关键酶，因此可以更特异地标志avenanthramide的产生[48]。我们观察到胚乳中的HHT含量低于麸皮和胚胎，这证实了它们在外层籽粒中的积累以及它们在燕麦抵御生物胁迫中的作用[49, 50]。未来可以通过靶向MALDI-MSI实验来可视化avenanthramide的积累情况，以进一步了解这些独特化合物的分子调控机制。

总体而言，这项研究为将空间代谢组学与基于组织的蛋白质组学相结合提供了概念验证，用于 cereal 穗粒的生物特征分析。我们证明了燕麦籽粒的不同部分具有不同的蛋白质谱型，反映了它们各自的生化功能。这项工作为理解 cereal 穗粒内部的代谢能力和养分分配的空间组织提供了框架，对于改进作物以改变籽粒组成和增强抗逆性具有指导意义。重要的是，这些观察结果反映了蛋白质含量的差异，应将其视为相关性的指标，而非直接反映代谢流或途径活性的指标。尽管 RuBisCo在胚胎中的富集或hexokinase含量的变化表明了潜在的功能特化，但如果没有补充的代谢组学或通量平衡分析，无法直接得出关于代谢活性的结论。未来可以探索多种改进方法。我们建议结合激光捕获微解剖技术来分离细胞类型的组织进行更精细的研究。这种方法也应扩展到代谢活跃的发育中的籽粒，以深入了解动态的代谢途径调控。特征注释也可以通过结合MS/MS验证或离子迁移率分离来改进，以区分等位分子[14]。此外，整合代谢流分析将有助于验证代谢产物的积累，并加强蛋白质组变化与燕麦籽粒中代谢结果之间的联系。

结论：燕麦籽粒是高度分区的种子，每个组织都承担着不同的生物学功能。这是通过代谢物MALDI-MSI技术验证的，该技术可以将离子信号分类到不同的区域。随后对这些区域的蛋白质组分析揭示了明显的功能特化：胚胎中的核心细胞功能主要负责能量产生、翻译和抗逆保护，而养分合成和储存途径则在胚乳和麸皮中更为丰富。这些发现强调了在研究特定途径或蛋白质时进行组织特异性蛋白质组分析的必要性，因为整体籽粒蛋白质组学可能会掩盖组织间的特异性调控。这项研究为未来探索 cereal 穗粒的代谢结构提供了概念验证，为作物改良开辟了新途径。