WGS（全基因组测序）技术帮助识别了林奇综合征（Lynch syndrome, LS）患者，并在泰国南部发现了一个携带MSH2相关基因突变导致林奇综合征的大家族

《PLOS One》：WGS identifies Lynch syndrome (LS) patients and uncovers a large family with MSH2-related LS in Southern Thailand

　　摘要
本研究旨在调查符合修订后的Bethesda指南的泰国南部结直肠癌（CRC）患者及其他与LS相关的癌症患者中的Lynch综合征（LS）相关种系变异。共有132名疑似LS的受试者接受了全基因组测序（WGS）。在26名参与者中（占20%），发现了11个种系变异，包括致病性变异（PVs）、可能致病性变异（LPVs）和意义不明的潜在变异（VUSs）这些DNA错配修复（MMR）基因的变异。其中，6个PVs/LPVs/VUSs位于MLH1基因，3个位于MSH2基因，2个位于PMS2基因。值得注意的是，在10名具有共同祖先的受试者中检测到了MSH2基因的c.1237C > T变异。随后对56名亲属进行的目标测序发现了额外的15名携带者，其中4人已经发展为CRC或壶腹癌，另外2人在结肠镜检查中发现了息肉。成本效益分析（BCR）表明，对于所有高风险亲属来说，基因检测比内镜监测更具成本效益。尽管我们的队列在临床上是富集的，并不能反映泰国南部LS的流行情况，但这些发现突显了高风险家庭中LS的显著负担，并强调了在临床实践中纳入基因筛查、咨询和定制监测策略的重要性。

引言
结直肠癌（CRC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一[1]。在泰国这个东南亚国家，CRC是唯一在男女中发病率均呈上升趋势的癌症，在女性中排名第二，在男性中排名第三，每年新增病例超过10,000例[2,3]。根据遗传学和病因学因素，CRC通常被分为散发型、家族型和遗传型。散发型CRC约占病例的80%，没有明确的遗传证据。相比之下，约20%的CRC患者有家族史，表明存在显著的遗传倾向。然而，高达6%的病例表现出单基因遗传模式，这是由于与遗传性CRC相关的癌症驱动基因中的高度渗透性种系突变[4,5]。Lynch综合征（LS），以前称为遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）（MIM#120435），是最常见的癌症易感综合征，也是最常见的遗传性CRC形式。LS是由DNA错配修复（MMR）基因中的杂合致病性变异（PV）引起的，包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2基因，或者是EPCAM基因5'区域的缺失，导致MSH2的表观遗传沉默。大多数与LS相关的PVs（82%）位于MLH1和MSH2基因，这两个基因是LS最重要的易感基因，而MSH6和PMS2基因占较少比例（18%[6]。尽管LS主要导致遗传性CRC和子宫内膜癌（EC），但它还与广泛的结肠外肿瘤谱系相关，包括卵巢癌、皮肤癌、尿路上皮癌、小肠癌、前列腺癌和胃癌[5,7,8]。到70岁时，CRC和任何癌症的累积终生风险分别约为34%和36%[9]。LS肿瘤的特征是由于体细胞第二次打击导致MMR蛋白丢失和微卫星不稳定性（MSI）[10]。这些参数 routinely 用于疑似LS病例的肿瘤筛查，在一些西方国家，被推荐为所有CRC和EC患者的标准诊断部分[11]。根据修订后的Bethesda指南（RBG）和/或Amsterdam Criteria II（ACII）[13]，临床怀疑LS时需要进行基因检测[12]。识别出LS患者可以进一步进行风险分层、早期癌症检测和实施针对性监测策略，最终降低CRC相关的发病率和死亡率[14]。在西方人群中，LS是最常见的遗传性（单基因）CRC综合征，占所有CRC的2–3%[15–17]。该人群中与LS相关的种系PVs/LPVs的患病率为1:300–1:500[18–20]。然而，在泰国，尚无标准化的遗传性癌症筛查程序，且大多数研究并未专门针对遗传性癌症[21]，因此LS的患病率仍不清楚。如果没有系统的筛查或基因检测计划，许多病例可能会被漏诊，导致实际LS患病率被低估，尽管其概率估计与其他具有相似遗传背景的人群相当。全球基因组医学时代不断进步，泰国于2020年启动了国家基因组计划。因此，为了有效管理患者及其家庭，需要在基因组学和精准医学的各个方面进行全面准备，如基础设施、劳动力培训、伦理框架等[22,23]。本研究的首要目标是识别参与泰国国家基因组计划的疑似LS患者的种系PVs/LPVs。有趣的是，我们在132名患者中发现了10名携带相同的MSH2变异，并证实他们具有意想不到的祖先关系。随后，我们对家庭成员进行了基因咨询和检测，在56名亲属中发现了15名携带相同的MSH2变异。这一发现强调了基因咨询和种系PVs/LPVs筛查在早期识别高风险个体中的关键作用。这些策略对于个性化癌症预防、指导资源分配以及制定国家健康政策以减轻遗传性CRC的社会经济影响至关重要。

材料与方法
患者和样本
本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并得到了泰国宋卡王子大学（PSU）医学院人类研究伦理委员会（HREC）（REC.64-223-10-1；批准日期：2022年1月5日）和乌汶拉差他尼癌症医院（URCH）伦理委员会（EC 013/2021；批准日期：2021年10月20日）的批准。参与者招募时间为2022年1月29日至2023年12月29日。由于需要访问临床数据、家族史和组织病理学信息，作者WW、NS和PS能够在数据收集期间和之后访问相关信息。所有患者和招募的家庭成员都被告知他们被纳入了研究注册，并在基因咨询过程中获得了书面同意书。本文中的个体已书面同意公开这些病例细节。对于18岁及以上的参与者，直接获得了书面同意书；对于18岁以下的参与者，从其父母或法定监护人处获得了书面同意书，并获得了参与者本人的书面同意。所有未成年人在咨询过程中都有父母或监护人的陪同，并提供了解释研究目的的信息函。
最初，共招募了132名在2001年10月至2023年12月期间在宋卡纳林德医院或乌汶拉差他尼癌症医院诊断和治疗过的患有家族性CRC和/或EC的患者，以及伴有或不伴有其他与LS相关的癌症的患者。他们符合RBG的至少一个标准：癌症发现时年龄小于50岁，和/或在任何年龄患有同时性/异时性CRC或其他与LS相关的肿瘤，和/或有一级或二级亲属在年轻时被诊断出CRC或LS相关肿瘤[12]。他们的组织病理学信息，如诊断年龄、肿瘤位置、分期、组织学分级、类型和转移情况，从医院信息系统（HIS）中收集。

DNA提取
从外周血淋巴细胞中提取基因组DNA，使用的是GeneJET Genomic DNA Purification Kit（Thermo Scientific，立陶宛），按照制造商的说明进行操作。提取的DNA使用Nanodrop One荧光分光光度计（Thermo Scientific，美国）进行质量鉴定和定量，并在4°C下保存待用。

FFPE组织中的DNA提取
肿瘤DNA从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的组织中使用QIAamp Tissue Kit或Relia Prep FFPE gDNA Miniprep System（Promega）根据制造商的建议进行提取。DNA浓度使用Nanodrop One荧光分光光度计（Thermo Scientific，美国）测量，并在4°C下保存。

MLH1、PMS2、MSH2和MSH6蛋白的免疫组化染色
使用小鼠单克隆MLH1、MSH2、MSH6和PMS2抗体（Abcam，美国）对DNA错配修复（MMR）蛋白进行免疫组化（IHC）染色。肿瘤细胞核中这些蛋白的表达定义为阳性染色；正常蛋白质表达定义为结肠癌细胞中存在核染色；癌细胞中染色缺失而正常结肠上皮细胞核中同时存在阳性染色则表明蛋白质表达缺失。

微卫星分析
使用自动化Idylla? MSI测试原型试剂盒进行微卫星不稳定性（MSI）分析，使用七个微卫星标记物（ACVR2A、BTBD7、DIDO1、MRE11、RYR3、SEC31A和SULF2）。按照制造商的协议，从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的组织样本中获取10-μm厚的切片，覆盖面积为100–200 mm2。每个切片至少包含20%的肿瘤细胞。然后将准备好的组织切片放入样品盒中，再按照先前建立的方法插入仪器[24]。Idylla? Console软件分析结果并生成微卫星状态报告，分为微卫星稳定（MSS）或微卫星不稳定（MSI）。

全基因组测序和生物信息学流程
132名疑似LS患者的 peripheral blood lymphocytes 中提取的基因组DNA在DNBSEQ-T7平台（MGI Tech Co.）上进行了全基因组测序（WGS）。使用MGI MGIEasy FS PCR-Free DNA Library Prep Set准备DNA文库。将Q20 > 90% 和 Q30 > 80% 的读段（>100 bp）使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）与GRCh38比对[25]。使用SAMtools和GATK进行质量控制，要求映射率≥90%、唯一映射≥85%、平均深度>30x、≥20x的碱基超过90%、≥10x的碱基超过95%。在LS相关基因中（EPCAM（NM_002354.3）、MSH2（NM_000251.3）、MSH6（NM_000179.3）、MLH1（NM_000249.4）和PMS2（NM_000535.7），平均深度为38x，目标区域覆盖率为86–96%，支持高可信度变异调用（S1表）。根据GATK4.0最佳实践调用短变异（SNPs和INDELs[26]。使用Picard工具标记重复序列，随后进行碱基质量校正（BQSR）和基于indels的局部重新对齐。使用GATK HaplotypeCaller调用变异，并使用VQSR/VariantFiltration进行过滤。使用Ensembl Variant Effect Predictor（VEP）build 113 [27] 和dbNSFP 4.9a [28]、gnomAD v 4.1 [29] 对高质量变异进行注释。根据2015年ACMG/AMP指南，将变异分类为致病性（P）、可能致病性（LP）、意义不明的潜在变异（VUS）、可能良性（LB）或良性（B）[31]。通过泰国变异注释和优先级平台（v@pp）（https://vapp.genomicsthailand.com/）可以获取样本级别的注释变异信息，该平台提供了直接链接到GeneCards、OMIM、GeneReviews、gnomAD和VarSome等知识库的途径。结构变异（SVs）使用Manta [32]从BAM文件中调用，并使用AnnotSV [33]进行注释。我们重点关注EPCAM、MSH2、MSH6、MLH1和PMS2基因，并根据2015年ACMG/AMP指南按致病性（P > LP > VUS）进行分类。所有变异都与InSiGHT、ClinVar和gnomAD数据库进行了交叉参考。对于有前景的VUS，使用in-silico工具（包括PolyPhen-2、Mutation Taster、SpliceAI和Priors）评估致病性。我们进一步应用了预先打印的ClinGen InSiGHT Hereditary Colorectal Cancer/Polyposis Variant Curation Expert Panel（VCEP）v 1.0.0规范来细化变异分类。

MSH2 c.1237C > T基因分型研究
使用GeneJET Genomic DNA Purification kit（Thermo Scientific，立陶宛）从家庭成员的外周血白细胞中提取基因组DNA，并按照制造商的说明进行操作。DNA样本在?20°C下保存待用。引物使用Primer3web版本4.1.0（https://primer3.ut.ee/）设计；正向和反向引物的序列分别为5′-AAGATGCAGAATTGAGGCAGA-3′和5′-GGACAGCACATTGCCAAGTA-3′，预期PCR产物大小为242 bp。按照标准协议进行PCR：PCR混合物包含10 μl的2X PCR SuperMix（Bio-Helix Co. Ltd.）、每条引物1 μl（10 μM）、8 μl的蒸馏水和1 μl的DNA模板，每反应总体积为20 μl。反应在C1000 Thermal Cycler（BioRad Laboratories，美国）中进行，初始条件为95°C变性5分钟，然后是5个循环的95°C变性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸1分钟，最后72°C延伸5分钟。扩增后，通过1.5%琼脂糖凝胶和RedSafe?核酸染色溶液（iNtRON Biotechnology）进行凝胶电泳可视化每个PCR产物。PCR产物使用NucleoSpin Gel和PCR Clean-up Kit（Macherey-Nagel GmbH and Co. KG，德国Düren）进行纯化。纯化的PCR产物在Macrogen Co. Ltd.（韩国首尔）采用Sanger方法进行了双向测序。为了检测肿瘤DNA中的BRAF V600E和KRAS G12D变异，我们按照上述标准协议进行了PCR和直接测序。使用2X PCR SuperMix（Bio-Helix Co., Ltd.）以及引物BRAF正向5’-TGCTTGCTCTGATAGGAAAATG-3’和反向5’-AGCATCTCAGGGCCAAAAAT-3’，和/或引物KRAS正向5’-TTAACCTTATGTGTGACATGT TCTAA-3’和反向5’-AGAATGGTCCTGCACCAGTAA-3’扩增了包含外显子15的228 bp BRAF片段和包含外显子1的225 bp KRAS片段。PCR产物使用Purelink? Genomic DNA Mini kit（Invitrogen）进行纯化，然后提交给Macrogen公司进行测序服务。

对携带MSH2 PV的家族成员进行筛查和分离分析，使用KING软件[34]进行血统关系（IBD）分析以确定这些患者之间的亲缘关系。为携带MMR PV/LPV的家族成员提供遗传咨询。如果高风险亲属同意，也进行基因检测，无论他们是否有癌症病史。特别是对于携带MSH2 c.1237C > T的家族成员，我们通过电话联系他们并邀请他们到医院进行面谈以获取他们的家族史。他们的临床数据从医院信息系统（HIS）中获取。在面谈后创建了详细的家族史和家系图，以查看PV的分离情况是否与LS相关的癌症一致。

由于队列数量较少，粗略的渗透率计算方法是将患有任何LS相关癌症的携带者所占比例除以总的携带者数量。为了获得更精确的估计值，使用AI辅助计算（ChatGPT，OpenAI）结合10年年龄间隔的精算生命表分析，按照先前建立的遗传癌症风险估计方法[35–37]进行计算。随后为男性和女性分别生成了性别分层生命表，并计算了区间特定的概率、生存函数和累积风险[35–37]。

成本效益分析是一种用于评估项目、政策或投资是否值得的方法。它将所有预期成本（货币和非货币）与所有预期效益进行比较，通常是在一段时间内，以确定效益是否超过成本。成本效益分析首先明确项目的范围和目标。接下来，识别所有潜在的成本和效益，包括直接成本、间接成本、有形成本和无形成本。然后通常使用财务代理值将这些成本和效益量化。由于货币随时间有不同的价值，因此使用折现率将未来的成本和效益折算为现值。为了评估经济可行性，计算诸如效益成本比（BCR）之类的决策标准。最后，根据效益是否超过成本得出结论并提出建议。用于判断效益是否超过成本的关键指标如下：效益成本比（BCR）：效益的现值与成本的现值之比。如果BCR > 1，则项目在经济上是合理的；如果BCR < 1，则成本超过了效益。

### 结果
#### 132例疑似林奇综合征患者的临床病理资料
研究共招募了132例疑似林奇综合征（LS）患者（56例男性和76例女性），他们在2001年至2023年间在宋卡王子大学和乌汶拉差他尼癌症医院被诊断为结直肠癌（CRC）和/或子宫内膜癌（EC）以及其他与癌症相关的LS。发病年龄在16至93岁之间，平均年龄为52岁。所有患者都符合RBG [12]标准，但只有59例（45%）符合ACII [13]标准。虽然大多数患者（92%）发展为CRC，伴有或不伴有结肠外癌症（平均年龄52岁），但少数患者（8%）发展为EC，伴有或不伴有结肠外癌症（平均年龄50岁）。61例（46%）年龄在50岁以下，31例（24%）年龄在50至59岁之间，29例（22%）在60至69岁之间被诊断，11例（8%）在70岁以上被诊断（表1）。

#### 微卫星状态和DNA MMR蛋白免疫组化染色分析
在132例疑似LS患者中的61例进行了微卫星不稳定性和（MSI）检测。其中18例表现为MSI-High（MSI-H），43例为MSS。在18例MSI-H病例中，8例显示出MLH1和PMS2的表达缺失，5例显示出MSH2和MSH6的表达缺失。对于剩下的5例MSI-H患者，无法获得MMR IHC染色结果。在43例MSS病例中，对8例进行了MMR蛋白的IHC染色，所有病例均显示四种MMR蛋白的表达正常，与其MSS状态一致（表2）。

#### 132例疑似LS患者中DNA MMR基因的种系致病变异和潜在致病变异的鉴定
对MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和EPCAM的分析在23例疑似LS患者中发现了8个PV/LPV；MLH1中有5个变异（11例患者），MSH2中有2个变异（11例患者），PMS2中有1个变异（1例患者）。此外，在MMR基因中还检测到3个有前景的VUS（表3）。总共26例患者携带PV/LPV或有前景的VUS。其中，12例携带MLH1变异的患者年龄在23至65岁之间（平均年龄±标准差：49.0 ± 12.5岁），12例携带MSH2变异的患者年龄在23至71岁之间（平均年龄±标准差：44.5 ± 12.2岁），2例携带PMS2变异的患者年龄分别为47岁和65岁（平均年龄56岁）。在MSH6或EPCAM中未检测到PV/LPV或有前景的VUS。

#### 三个有前景的VUS
在三个有前景的VUS中，MLH1 c.1883T > C; p.Leu628Ser出现在一名患者（GN065）中，该患者在65岁和68岁时分别发展为十二指肠癌和CRC。病理学研究表明MLH1和PMS2的表达缺失，BRAF V600E为阴性。参考其家族史，他的三个兄弟分别在30岁、40岁和50岁时发展为CRC，均已去世。此外，他母亲的另一个兄弟也发展为CRC（年龄未知），也已去世。这个VUS不在gnomAD数据库中记录。它在InSiGHT中记录了一次，在ClinVar中记录了一次；其中一个记录在一名LS患者中，另一个的表型未知。由于无法验证该变异与疾病的分离情况，目前的证据不足以将其归类为PV/LPV，尽管病理发现和家族史支持可能的关联。

#### MSH2 c.923_937del; p.Arg308_Phe313delinsIle
在一名41岁和47岁时分别发展为早期CRC和EC的女性患者（GN048）中检测到，该患者具有MSI-H和MSH2及MSH6的表达缺失。这个VUS不在gnomAD、ClinVar和 ClinVar数据库中记录，但在ClinGen InSiGHT Hereditary Colorectal Cancer/Polyposis VCEP MMR规范中被归类为VUS，因为仅凭框内长度变化不足以将其为LPV分类。

#### MSH2 c.4dup; p.Glu2GlyfsTer4
在一个男性患者（GN053）中检测到这个移码变异，该患者在65岁和70岁时分别发展为直肠癌和前列腺癌。这个种系变异不在gnomAD和ClinVar数据库中记录，但在InSiGHT数据库中记录了一次，在一名乳腺癌患者中记录过[38]。Franklin是一种在线变异分类工具（https://franklin.genoox.com/clinical-db/home），基于2015年的ACMG/AMP指南[31]，将这个变异分类为LPV（PVS1, PM2）。根据Franklin的分类标准，我们基于以下原因将其分类为PV：1）它是一个移码变异，导致蛋白质长度改变（PM4）；2）该基因的功能丧失是已知的疾病机制（PVS1）；3）它不在gnomAD（人群数据库）中记录（PM2）。

#### 携带MLH1 PV/LPV的患者的临床病理特征
在MLH1 PV/LPV携带者中，大多数（92%）发展为CRC，其中8%伴有结肠外肿瘤。相比之下，在MSH2 PV/LPV携带者中，CRC和结肠外癌症的发生频率相当（表3）。使用Manta检测到结构变异（SVs），并使用AnnotSV进行注释（S2表）。在111例患者中观察到MSH2的一个79 bp缺失（47例杂合子，64例纯合子），在另一例患者中观察到另一个80 bp缺失。在MLH1中，两名患者中检测到一个56 bp缺失。所有缺失都是内含子的，并被分类为VUS。

#### 携带MSH2 c.1237C > T, p.Gln413Ter患者的家族史和家系分析
在我们的研究中，MSH2 c.1237C > T PV是最常见的发现。IBD分析显示携带此变异的七名患者之间存在遗传相关性。具体来说，GN085和GN007被鉴定为亲子对，GN012和GN013为全同胞，GN097和GN360也为全同胞。GN073被确定为GN097和GN360的二级亲属（S3表）。我们联系了这些患者及其家族成员。根据遗传咨询，我们确定这七名患者都来自Phatthalung省，并且他们共享共同的祖先（I.1和I.2）（图1）。患者GN027的姓氏与个体I.2相同。他的祖父出生于Phatthalung，他模糊记得自己是这个大家庭的表亲，但无法确定具体是父亲一方还是母亲一方的亲戚。同样，患者GN064报告她的祖先最初居住在Phatthalung，但在她的曾祖父母或曾曾祖父母那一代迁移到了Songkhla。相比之下，患者GN197与这个大家庭没有可识别的联系。他的家族成员中没有人患有癌症。他们的祖先也不居住在Phatthalung，而是来自Songkhla。

#### 10例携带MSH2 c.1237C > T, p.Gln413Ter的患者的病理学研究
在十名患者中，六名（4名男性和2名女性）分别在23岁、30岁、46岁、47岁和70岁时发展为CRC，四名女性患者在35岁、45岁和47岁时发展为EC（平均年龄±标准差：44.8 ± 13.4岁）。四名患者具有MSI-H，而另外六名的微卫星状态未知（表3）。

#### MSH2 c.1237C > T, p.Gln413Ter的致病性分类
MSH2 c.1237C > T, p.Gln413Ter已在InSiGHT数据库中被三次报告为PV（1例LS，2例未知），并在ClinVar中被六次报告为PV（5个PV，1个LPV）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/variation/218030/）。其中三个PV是在LS中发现的，而其他三个报告没有提供患者的具体情况。MSH2 c.1237C > T, p.Gln413Ter未在gnomAD数据库中记录。

#### 对携带MSH2 c.1237C > T的家族成员进行种系变异筛查
经过面谈和遗传咨询后，我们收集了56名家族成员的静脉血以分析MSH2 c.1237C > T变异（图1）。通过测序，我们在15名成员（27%）（5名女性，10名男性）中检测到MSH2 c.1237C > T。携带者的年龄在13至84岁之间（平均年龄±标准差：44 ± 14.6岁）。回顾病史发现，一名男性（GN109）在73岁时发展为壶腹癌，两名成员（一名女性GN415和一名男性GN498）分别在33岁和52岁时发展为CRC。在监控项目期间，我们发现一名55岁男性患有早期结直肠癌（CRC），并在另外两名家庭成员（年龄分别为34岁和58岁）中发现了息肉。其余九名家庭成员中，包括5名男性和4名女性（年龄在34至65岁之间，平均±标准差为47±12.5岁），目前均身体健康。然而，这名13岁的男孩（GN637）尚未接受结肠镜检查。针对患者GN027的调查显示，他隐约记得自己是主要家族的表亲，MSH2基因测序结果显示他继承了来自其携带者母亲GN028（49岁）的MSH2基因c.1237C>T突变。该突变很可能来自他的外祖母，她于59岁时被诊断出患有CRC，并将此突变传给了她的儿子GN498，后者在52岁时患上了直肠癌。

在25名MSH2基因携带者中（包括10名患者和15名家庭成员），有14人被诊断出患有结直肠癌（CRC）、子宫内膜癌（EC）或Vater壶腹癌。其中两人有息肉，其余九人在监测时仍身体健康。因此，该突变的渗透率为56%。通过将个体按年龄分组，计算了他们随时间发展成CRC或EC的累积风险。结果显示，CRC或EC的累积风险随年龄增长而稳步增加：20-29岁组为30%，40-49岁组为63%，60-69岁组为100%。这表明数据集中几乎所有患CRC或EC的个体都是在60多岁时被诊断出来的。此外，女性的累积风险高于男性：女性在50-59岁时累积风险即可达到100%，而男性则在60-69岁时达到100%。

根据标准临床指南，这10名患者及其56名家庭成员需要每年进行一次内镜检查。根据家族性腺瘤性息肉病（FAP）模型，我们估计到25岁时每人平均需要进行5次内镜检查。假设每次检查费用为2,300泰铢，总内镜检查费用为759,000泰铢（约23,000美元）。基因检测费用为10名患者每人490,000泰铢，56名家庭成员的靶向突变检测费用为每人11,200泰铢，总计501,200泰铢。基因检测相比内镜检查可节省34%的费用（257,800泰铢）。此外，基因检测还通过早期发现和预防带来了间接收益：避免了晚期CRC的治疗费用（包括两次息肉切除、一次早期CRC治疗和两次晚期CRC治疗）。息肉切除费用因息肉大小和治疗方式而异，平均费用为20,000泰铢；早期CRC治疗费用约为每人400,000泰铢；晚期CRC治疗费用平均为每人500,000泰铢（包括手术、化疗和住院费用，最低为1,000,000泰铢）。这些间接收益总计1,440,000泰铢（43,600美元）。由于这些收益和费用发生在同一时期，因此无需对其进行现值折现。成本效益比（BCR）为3.39，计算方法是将直接收益（257,800泰铢）与间接收益（1,440,000泰铢）除以基因检测费用（501,200泰铢）。

种系致病突变占遗传性CRC的5%，其中3%导致林奇综合征（LS）。本研究主要旨在识别疑似林奇综合征患者的致病突变，以便区分LS与其他家族性CRC。我们招募了132名临床疑似林奇综合征患者，所有患者至少符合修订后的贝塞斯达指南（RBG）的一个标准，但只有45%符合更严格的阿姆斯特丹标准II（ACII）。先前研究强调，ACII具有更高的特异性，更适合检测LS，而RBG具有高灵敏度，因此更适合作为进一步分子检测的筛选工具。尽管所有患者至少符合RBG的一个标准，但我们仅在中20%的患者中检测到了MLH1、MSH2和PMS2的种系突变或潜在突变（PV/LPV）。这一检出率低于一些早期研究，但高于基于人群的估计。由于我们的样本量有限且具有临床选择性，结果不能反映泰国南部林奇综合征的普遍程度。需要在更大规模的人群中进行研究，以明确其在泰国的真实发病率，并确定RBG或其他策略在该背景下是否提供了最佳的灵敏度和特异性平衡。

除了识别与LS相关的癌症外，这些检测还提供了预后和治疗信息：MSI-H/dMMR CRC患者的生存率更高，可能从免疫检查点抑制剂中受益。尽管高收入国家已有成熟的林奇综合征诊断指南，但在泰国的实施仍受到经济限制和医院资源不足的影响。外科医生和遗传咨询师的短缺，以及50岁开始进行CRC筛查的惯例，进一步阻碍了早期检测。鉴于诊断和预防服务的成本高昂且有限，使用RBG和/或ACII进行仔细评估仍然是资源有限环境中识别LS高风险个体的最有效策略。虽然MLH1种系突变是LS最常见的突变类型，但本研究中发现MLH1携带者和MSH2携带者的数量相等（各占46%），其余8%携带PMS2突变。我们未在MSH6和EPCAM基因中检测到任何种系突变或潜在突变，这是由于这些基因的已知低发病率。根据以往报告，癌症的平均发病年龄通常≤45岁，而我们的研究显示平均发病年龄为52岁，与De la Chapelle等人的研究结果一致，他们发现LS可在50岁以上的人群中检出。我们的数据表明，EC的发病年龄（平均48岁）低于CRC（平均52岁）。按年龄分组分析显示，大多数患者（70%）在60岁之前被诊断出癌症，而只有8%在70岁之后发病。我们还观察到特定的基因模式：MLH1突变携带者平均在50岁发病，而MSH2突变携带者平均在44岁发病。此外，MSH2携带者中肠外恶性肿瘤的比例更高（42%），CRC比例较低（分别为33%和92%）。这些发现与先前的研究一致，表明MSH2突变与更高的肠外癌症负担相关。在携带DNA MMR基因突变的LS患者中，右侧和左侧CRC的发病率没有差异。Baran等人之前报告称，近端（右侧）结肠肿瘤与DNA MMR通路相关，而远端（左侧）结肠肿瘤与染色体不稳定通路相关。然而，在我们的研究中，超过70%的LS患者患有左侧肿瘤。无论肿瘤位置如何，平均发病年龄没有差异。我们的数据表明，在我们的患者群体中，肿瘤侧别可能不是区分LS相关CRC的特征。

在132名疑似LS患者中，13人患有EC。其中两人同时患有EC和OC，三人同时患有EC和CRC，八人仅患有EC。我们在六名EC患者中检测到了MMR基因的突变或潜在突变（46%），这一比例高于泰国队列的先前研究，后者估计EC患者中LS的发病率约为35%。这可能反映了转诊标准、人群特征或研究纳入的多重癌症类型的差异。在一个家族中发现的MSH2 c.1237T>C突变的渗透率为56%。先前研究报告称，LS患者中CRC和EC的渗透率差异较大，范围为30-80%。由于癌症风险随年龄增加，年轻患者的实际渗透率可能被低估。此外，监测期间在两名患者中发现了息肉，如果未能及时干预，这些病变可能会进展为CRC，进一步表明实际渗透率可能更高。这一观察结果与文献一致，表明LS的渗透率较高，某些研究中甚至高达85%。在我们的研究中，CRC或EC的累积风险随年龄增长而增加，MSH2突变携带者中的女性风险高于男性。这一模式与先前研究不同，后者报告男性风险更高。女性的早期发病可能反映了EC的贡献，因为EC通常在较年轻时出现。这些观察结果强调了早期筛查的重要性，特别是对于50岁以下的女性，而对于男性携带者则可能需要长期监测。由于泰国缺乏常规的遗传性癌症筛查，许多病例可能直到晚期才被诊断出来，导致疾病发病率被低估。建立全面的基因检测和监测指南有助于早期发现并改善高风险个体的临床结果。长期随访对于准确评估终身癌症风险至关重要。泰国南部紧密联系的社区结构便于重建详细的家族谱系，从而可以追溯六代人的遗传情况。这种人口结构有助于追踪遗传模式，并招募可能需要遗传咨询和针对性筛查的高风险亲属。

与之前的研究一致，我们在一个泰国南部家族性腺瘤性息肉病（FAP）家族中发现了APC基因的种系突变，并确认了其致病性。这些发现进一步强调了共分离分析在验证突变和指导临床决策中的价值。将遗传咨询纳入公共卫生计划对于提高人们对遗传性癌症的认识、促进早期检测和鼓励预防措施至关重要。对于遗传性CRC而言尤其重要，因为其渗透率较高，早期干预可以显著降低癌症发病率。我们的研究表明，将基因检测整合到林奇综合征管理中具有显著的经济价值。通过将患者识别和亲属级联检测与泰国的相关费用数据相结合，我们证明了基因检测的成本效益比（BCR=3.39）。考虑到实施群体检测预计可以将每例基因检测的成本降低约60%（估计每位受试者约为20,000泰铢），这一策略可以带来显著的直接成本优势，与基于内镜的监测方法相比，成本可降低约72%。由此计算出的成本效益比（BCR）为9.41，意味着每投入1泰铢，可以通过避免监测和治疗支出获得9.41泰铢的回报。我们的研究结果证明了这项检测投资的成本效益，尤其是在与未受影响个体进行不必要的内镜检查相关费用相比时更为合理。简而言之，家庭成员中高风险个体的数量越多，该检测的成本效益就越显著。此外，这一发现也与之前在泰国乳腺癌患者及其家属中的研究结果一致，这些研究促成了2022年的国家健康福利计划的出台[49,67]。因此，我们强调遗传咨询对于预防遗传性癌症的重要性，并认为政府将受益于将其纳入国家福利政策中。

结论：遗传性结直肠癌表现出明显的遗传模式和高发病率。通过“泰国基因组计划”，在一个大型本地队列中发现了种系致病变异。遗传咨询和分离分析证实了这些变异患者具有共同的祖先背景。预测性检测有助于识别高风险家庭成员，从而促进针对性的癌症预防工作。这项针对疑似林奇综合征（Lynch syndrome）患者的首批研究之一，证明了基于家族的遗传咨询在癌症预防中的有效性，并为制定风险适应型监测策略提供了依据。研究结果强调了将遗传咨询和监测纳入常规护理的必要性，并支持在泰国推行全国范围内的基因检测政策。

**支持信息与致谢**
我们衷心感谢所有患者及其家属对这项研究的配合。同时，我们也感谢泰国宋卡王子大学医学院外科部门以及乌汶叻差塔尼癌症医院的所有医生、护士和卫生专业人员为我们的研究所做的贡献。我们非常感谢泰国“泰国基因组癌症计划”在实验室工作和行政支持方面所提供的帮助。此外，我们也感谢泰国清迈大学医学院的研究管理部和国际事务办公室在提高手稿语言质量方面所做出的努力。我们还要特别感谢德国波恩大学人类遗传学研究所的Stefan Aretz教授提出的宝贵意见。

**参考文献**