基于非病毒体内电穿孔技术的染色体工程及修复效果评估：以小鼠子宫上皮细胞为例

《PLOS One》：Non-viral in vivo electroporation-based chromosomal engineering and repair assessment in the murine uterine epithelium

　　摘要
CRISPR/Cas系统产生的染色体重排对于研究基因组结构和修复机制非常有价值。然而，大多数体内方法依赖于病毒载体，这些载体需要专门的生产过程、长时间的核酸酶表达以及较高的生物安全防护要求。在这里，我们将Cas9核糖核蛋白（RNP）电穿孔技术应用于小鼠子宫内膜，作为一种简单、非病毒性的体细胞染色体工程策略。该方法成功地在多个位点诱导了定义明确的染色体重排，并利用配对gRNA和单链寡脱氧核苷酸（ssODN）供体实现了大规模倒位修复的分子评估（57.8 Mb）。虽然在整体子宫DNA中检测到重组等位基因的频率较低——这与上皮细胞限制性递送和体细胞嵌合现象一致——但高深度全基因组测序（WGS）和PCR技术提供了精确接合点形成的核苷酸级确认。我们的发现表明，CRISPR RNP的子宫电穿孔是一种可行的、快速的方法，可用于体内评估工程化的染色体重排，提供了一个无病毒干扰的体细胞DNA修复结果分析平台。

引言
染色体异常，特别是倒位和易位，主要发生在体细胞组织中，在癌症的发生和发展中起着核心作用。这些重排可以通过失调癌基因和肿瘤抑制基因来改变基因表达并促进肿瘤发生[1,2]。尽管较为罕见，但生殖细胞中的重排也可能发生，通过破坏对正常生理功能至关重要的基因而导致不孕或遗传性疾病[3–6]。理解这些异常的形成和修复机制至关重要，而成簇规律间隔回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统已成为建模和研究这些事件的广泛使用的工具[7,8]。CRISPR/Cas系统已被成功用于生成具有特定染色体异常的模型生物[9–11]，对阐明疾病机制做出了重要贡献。最近，先进的引导编辑技术，如使用野生型Cas9（WT-PE）的引导编辑和引导编辑核酸酶介导的易位和倒位（PETI），在培养的人类细胞中表现出高精度[12,13]。然而，尽管在体外取得了这些进展，但在体内直接诱导体细胞组织中的定义明确的染色体重排仍然具有技术挑战性。目前用于诱导染色体重排的体内方法通常依赖于病毒载体（例如AAV、慢病毒）。虽然这些方法在递送方面有效，但存在货物大小限制、免疫原性和长时间核酸酶表达等问题。核酸酶的持续表达可能导致反复切割和脱靶效应，这可能会掩盖原始DNA修复结果的分析。因此，需要非病毒性的替代方案，以实现短暂表达和适合体细胞组织的“清洁”递送方式。我们的目标是建立一个简单且可控的非病毒平台，用于诱导和评估定义明确的染色体重排，作为强大病毒系统的补充。

介绍
染色体异常，尤其是倒位和易位，主要发生在体细胞组织中，在那里它们在癌症的发生和发展中起核心作用。这些重排可以通过失调癌基因和肿瘤抑制基因来改变基因表达并促进肿瘤发生[1,2]。尽管较少见，但生殖细胞中的重排也可能发生，通过破坏对正常生理功能至关重要的基因而导致不孕或遗传性疾病[3–6]。理解这些异常的形成和修复机制至关重要，而成簇规律间隔回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统已成为建模和研究这些事件的广泛使用的工具[7,8]。CRISPR/Cas系统已被成功用于生成具有特定染色体异常的模型生物[9–11]，对阐明疾病机制做出了重要贡献。最近，先进的引导编辑技术，如使用野生型Cas9（WT-PE）的引导编辑和引导编辑核酸酶介导的易位和倒位（PETI），在培养的人类细胞中表现出高精度[12,13]。然而，尽管在体外取得了这些进展，但在体内直接诱导体细胞组织中的定义明确的染色体重排仍然具有技术挑战性。目前用于诱导染色体重排的体内方法通常依赖于病毒载体（例如AAV、慢病毒）。虽然这些方法在递送方面有效，但存在货物大小限制、免疫原性和长时间核酸酶表达等问题。核酸酶的持续表达可能导致反复切割和脱靶效应，这可能会掩盖原始DNA修复结果的分析。因此，需要非病毒性的替代方案，以实现短暂表达和适合体细胞组织的“清洁”递送方式。我们之前已经证明了通过将CRISPR RNP递送到受精小鼠胚胎中可以诱导复杂的染色体重排[14]。然而，基于胚胎的方法的广泛应用受到关于人类胚胎编辑的伦理法规和使用受精卵的技术限制[15]。除此之外，关于体细胞组织中DNA修复的准确性仍是一个关键问题。在我们之前涉及Recql5突变的小鼠胚胎研究中，我们观察到修复过程经常涉及基于复制的复杂机制，如微同源性介导的断裂诱导复制（MMBIR）和模板切换（FoSTeS），导致意外的结构改变[16]。目前尚不清楚野生型体细胞组织中的目标染色体断裂是通过类似的易出错机制还是通过精确的连接来修复的。这需要开发一个体细胞验证系统来严格评估修复结果。在这项研究中，我们扩展了染色体工程的范围，使用体内电穿孔作为概念验证，将其应用于体细胞器官组织。我们采用了Kobayashi等人开发的CRISPR RNP电穿孔方法[17]，并检验了其诱导定义明确的染色体重排的能力。尽管输卵管上皮已广泛用于通过输卵管内电穿孔进行基因组编辑[18,19]，但在这里我们关注的是小鼠子宫内膜——这种组织经常携带倒位和易位[20]。重要的是，我们利用这一系统来评估体细胞DNA修复的准确性，特别是研究在体细胞背景下大规模倒位修复过程中是否会出现FoSTeS/MMBIR特征。我们的发现表明，体内电穿孔是一种可行的、无病毒的策略，可用于在子宫内膜中生成和评估工程化的染色体重排。

材料与方法
实验动物
使用了野生型（WT）小鼠（C57BL/6NCrSlc；日本SLC，静冈）和携带In(6)1J倒位的小鼠（C3H/HeJJcl；CLEA Japan，东京）。选择8周龄或以上的性成熟雌性小鼠进行实验。所有动物都在控制的环境条件下饲养，温度保持在22±2°C，湿度保持在50±10%，光照/黑暗周期为12/12小时。所有动物实验均获得了中部大学动物护理和使用委员会的批准（许可编号#202410012；爱知县Kasugai），并遵守相关指南。

CRISPR RNP和单链寡脱氧核苷酸（ssODN）的制备
CRISPR引导RNA（gRNAs）是使用CHOPCHOP（http://chopchop.cbu.uib.no/；S1表）设计的[21]。CRISPR RNP复合物使用Alt-R S.p. Cas9核酸酶3NLS（Integrated DNA Technologies，美国爱荷华州Coralville）和定制设计的gRNA组装而成，该gRNA包括CRISPR RNA（crRNA）和激活CRISPR RNA（tracrRNA）双链（Integrated DNA Technologies）。在无核酸酶的双链缓冲液中重新悬浮至最终浓度4,000 ng/μL后，将crRNA和tracrRNA以等摩尔比混合，在95°C下加热10分钟，然后逐渐冷却至25°C以促进双链形成。随后将crRNA:tracrRNA双链与Alt-R S.p. Cas9核酸酶3NLS在25°C下孵育10分钟以组装RNP复合物。具体浓度见下文：小鼠子宫内膜的体内基因组编辑。

随后，由Eurofins Genomics（东京，日本）合成ssODNs，以促进两个DNA序列的无缝连接，确保接合点位于预测切割位点的中心，这些切割位点位于PAM序列3 bp范围内（S2表）。此外，ssODNs的5′和3′末端通过两个连续的磷硫酯（*）连接进行修饰，以提高HDR效率[22]（S2表）。

小鼠子宫内膜的体内基因组编辑
处于发情后期或间情期的雌性小鼠接受了Kobayashi等人描述的改良版本的体内基因组编辑[17]。该程序针对子宫内膜，在出生后进行；因此，基因组编辑试剂不会进入卵巢，卵细胞保持未编辑状态。选择这些阶段是因为在发情后期和间情期，子宫角较长、柔软且壁较厚，便于进行子宫内操作。相比之下，在发情期，子宫壁薄、几乎透明、充满液体且膨胀，使得手术操作更加困难且重复性较差[23]。为了生成复杂的CCRs，使用了以下CRISPR溶液：520 ng/μL Alt-R S.p. Cas9核酸酶3NLS，30 μM crRNA:tracrRNA双链，针对三个设计的接合位点（Hmga2–Wif1、Hmga2–Rassf3和Wif1–Rassf3），每个接合位点对应158 ng/μL ssODN，以及0.02% Fast Green FCF（Wako，大阪，日本）标记物，稀释在Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州Waltham）中。为了生成染色体倒位和易位，使用了以下CRISPR溶液：520 ng/μL Alt-R S.p. Cas9核酸酶3NLS，30 μM crRNA:tracrRNA双链，针对倒位的两个侧翼位点（同一染色体上的左右切割位点）和每个易位位点的特定断裂点，每个目标位点对应158 ng/μL ssODN，以及0.02% Fast Green FCF（Wako）标记物，稀释在Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific）中。通过相同的电穿孔条件，分别递送带有或不带有ssODNs的CRISPR/Cas9 RNP进行比较实验。每种条件在2-3次独立试验中进行了测试，以确保可重复性。在电穿孔之前，雌性小鼠用medetomidine（0.75 mg/kg，Nippon Zenyaku Kogyo，福岛）、midazolam（4 mg/kg；Sandoz，东京）和butorphanol（5 mg/kg；Meiji Seika Pharma，东京）的混合物进行麻醉。使用垂直毛细管拉拔器（NARISHIGE，东京，日本）拉制玻璃微吸管，以创建适合微注射的细尖毛细管。使用剪刀将每个毛细管的尖端斜切至0.5毫米长度，以便试剂顺畅流动。然后将切好的毛细管通过硅胶管连接到注射器中，并填充CRISPR溶液以确保完全装载试剂。填充完成后，将毛细管固定在支架上。然后使用准备的玻璃微吸管和FemtoJet 4i微注射器（Eppendorf，德国汉堡）通过子宫输卵管连接将CRISPR溶液（2 μL）注入子宫腔。注射参数如下：注射压力（pi）= 100 hPa，注射持续时间（ti）= 手动，补偿压力（pc）= 10 hPa。为防止试剂回流，用止血夹（Natsume Seisakusho，东京，日本）夹住靠近卵巢的输卵管。使用止血夹（Natsume Seisakusho）将子宫夹在宫颈侧，以防止泄漏。注射后，用镊子电极（LF650P5；BEX，东京，日本）夹住子宫角，并使用CUY21EDIT II电穿孔仪（BEX）进行电穿孔。调整电极方向，并施加三组额外的电脉冲。使用的电穿孔参数如下：主要大脉冲（PLP）：20 V，30.0 ms脉冲持续时间，50.0 ms脉冲间隔，3次脉冲，10%衰减（±脉冲方向）。次要衰减脉冲（Pd）：10 V，50.0 ms脉冲持续时间，50.0 ms脉冲间隔，3次脉冲，40%衰减（±脉冲方向）。电穿孔后，重新定位子宫角，并缝合切口。为了逆转medetomidine的效果，术后腹腔注射atipamezole盐酸盐（0.75 mg/kg，Nippon Zenyaku Kogyo，福岛）。手术后，将小鼠放置在保持38°C的加热垫上过夜，以支持恢复并减少术后痛苦，符合3Rs原则。所有基因组编辑实验共使用了50只小鼠。在实验结束时（电穿孔后≥7天），通过颈椎脱位处死小鼠。

荧光示踪剂递送和组织处理以实现空间定位
为了评估电穿孔物质的空间分布，使用上述相同的微注射和电穿孔程序将Dextran-Tetramethylrhodamine（TMR；3,000 MW，阴离子，赖氨酸可固定；2 μg/μL）注入子宫腔。电穿孔后1小时处死三只小鼠，并在弱光下解剖子宫角。组织在室温下的4% paraformaldehyde（PBS，pH 7.4）中固定48小时，然后在PBS中洗涤一次60分钟，再在70%乙醇中洗涤两次（每次60分钟）。固定后的组织脱水、石蜡包埋，并切成5–7 μm厚的切片；切片由Morphotechnology Co., Ltd.（日本札幌）制备。切片在室温下用DAPI（Invitrogen，美国加州Carlsbad）染色1分钟，短暂冲洗在PBS中，然后安装。使用NanoZoomer虚拟切片扫描仪（Hamamatsu Photonics，日本Hamamatsu）和dextran TMR及DAPI滤光片集获取荧光图像。

CRISPR/Cas9工程小鼠的分析
为了筛查CRISPR/Cas9诱导的突变，使用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen，德国Hilden）从编辑小鼠的子宫角中提取基因组DNA，并使用EmeraldAmp PCR Master Mix（Takara Bio，日本滋贺）进行聚合酶链反应（PCR）扩增。在解剖过程中，整个子宫角被切除，而不分离组织层。从整个厚度的子宫组织中提取基因组DNA，包括上皮层（电穿孔的主要目标）以及下层的基质和肌肉层，这些层预计不会被转染。选择这种全器官方法是为了减少由于体内电穿孔的区域依赖性变异性可能导致的潜在采样偏差。通过避免仅收集高度或低度编辑的区域，我们旨在确保观察到的结果准确反映空间平均效应，同时接受非目标基质组织导致的信号稀释的权衡。对于嵌套PCR，第一轮包括在98°C下变性40圈10秒，60°C下退火30秒，72°C下延伸1分钟，然后在10°C下无限期保持。第二轮PCR包括15个循环：在98°C下变性10秒，在63°C下退火30秒，在72°C下延伸30秒，最后在10°C下无限期保持。所得的PCR产物使用NucleoSpin Gel和PCR Cleanup Kit（Takara Bio）进行纯化，并克隆到pTAC-1载体（Biodynamics，东京，日本）中。使用Sanger测序（Eurofins Genomics）确定单个克隆序列。为了最小化细菌繁殖过程中发生重组事件的可能性，将PCR产物克隆到TA载体中，并转化到化学感受态的大肠杆菌（DH5α）中，在分离质粒之前有最短的培养时间。在不同动物的多个独立克隆中一致观察到重组接头，这降低了它们作为细菌伪影的可能性。所有用于基因分型的PCR引物列在S3表中。为了评估染色体重排，每个子宫样本分析四个克隆，使用特定于断点的引物集进行克隆PCR。如果至少有一个克隆包含相应的连接，则认为样本在给定接头上呈阳性。根据断点接头的序列特征对修复结果进行分类。当使用单链寡脱氧核苷酸（ssODN）供体并且修复接头与供体模板序列完全匹配时，该事件被归类为同源定向修复（HDR）。然而，在某些情况下，这也可能反映了Cas9生成的末端的准确重新连接，而没有进行末端处理。缺乏序列同源性的接头被归类为NHEJ，而包含两个碱基对（bp）或更多微同源性序列的接头被归类为MMEJ，这与公认的定义一致[24]。从电穿孔的子宫角中提取总基因组DNA，使用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen，Hilden，德国）按照制造商的协议进行。使用TruSeq Nano DNA Library Prep Kit（Illumina，San Diego，CA，美国）制备文库，并由Macrogen Japan Inc.（东京，日本）在Illumina NovaSeq6000平台上进行测序，生成150 bp的双端读取（每个样本大约90 Gb）。使用标准流程将测序读取与GRCm38/mm10小鼠参考基因组对齐，以生成BAM文件。为了在预期的位点检测结构变异，使用samtools v1.22.1 [25]查询BAM文件中的候选区域。在以预测断点为中心的±2 Mb窗口内检查候选区域。如果至少有一个克隆包含相应的连接，则认为样本在给定接头上呈阳性。根据断点接头的序列特征对修复结果进行分类。当使用单链寡脱氧核苷酸（ssODN）供体并且修复接头与供体模板序列完全匹配时，该事件被归类为同源定向修复（HDR）。然而，在某些情况下，这也可能反映了Cas9生成的末端的准确重新连接，而没有进行末端处理。缺乏序列同源性的接头被归类为NHEJ，而包含两个碱基对（bp）或更多微同源性序列的接头被归类为MMEJ，这与公认的定义一致[24]。为了获得大量子宫组织中支持接头的读取的最低定量估计，我们通过将不一致的双端读取（PE-support）数量除以相应±2 Mb窗口内的正确配对读取数量（PPmean）来计算每个位点的明显编辑频率。这个简单的比率（PE-support/PPmean）反映了测序组织中重排等位基因的相对丰度，而不假设克隆结构或纯度。本文报告的WGS数据已存入日本DNA数据库序列读取档案（https://ddbj.nig.ac.jp/search/entry/bioproject/PRJDB37706）。

在小鼠子宫上皮中，我们采用了Kobayashi等人[17]开发的CRISPR RNP电穿孔方法，以研究诱导定义的染色体重排的可行性（图1A）。CRISPR RNPs与设计用于桥接预测断点并指导修复预指定接头的单链寡脱氧核苷酸（ssODNs）共同注射。通过微注射器将混合物引入子宫腔，以最小化机械应力和泄漏，然后电穿孔进入上皮细胞。包含ssODNs有助于通过同源定向修复（HDR）促进精确的接头形成，使我们能够评估供体模板是否有助于在染色体断点处实现准确的连接。

为了验证试剂递送的空间分布，我们在体内电穿孔过程中引入了一种荧光葡聚糖示踪剂。子宫组织的石蜡切片显示，荧光信号仅限于电穿孔区域（EP）的上皮组织中，而在未电穿孔区域（Non-EP，宫颈侧）未检测到信号，尽管两个区域都充满了注射的溶液（图1B）。这证实了葡聚糖的摄取依赖于电穿孔，并支持了组织内镶嵌编辑的预期，这与之前使用这种方法的研究结果一致[17]。作为初步验证目标，我们选择了小鼠10号染色体上的一个1.1-Mb区域，该区域包含高移动性组AT-hook 2（Hmga2）、Wnt抑制因子1（Wif1）和Ras关联结构域家族成员3（Rassf3）基因。这个位点与人类12号染色体具有同源配置[27]（图2A），并且在我们之前的基于胚胎的研究中已被靶向[14]。同时使用三个切割位点是有意设计的，以模拟多断点CCR，并评估我们的电穿孔平台是否能够在体细胞环境中处理这种复杂性。术后第7天，从整个子宫组织中提取基因组DNA，并通过聚合酶链反应（PCR）和Sanger测序评估染色体重排的诱导情况。

在体内电穿孔的基础上，我们在小鼠子宫中进行了染色体工程（图1）。(A) 实验工作流程。麻醉后的雌性小鼠（>8周大）接受CRISPR–Cas9 RNP的子宫内注射，有时加入ssODN供体（2 μL），然后对子宫角进行电穿孔。电穿孔后≥7天收集基因组DNA进行PCR和Sanger测序。(B) 电穿孔材料的分布。葡聚糖（红色）与Cas9–RNP一起递送。Non-EP，未电穿孔区域（宫颈侧）；EP，电穿孔区域（卵巢侧）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。箭头指示宫颈端。

为了验证基因组编辑结果之前的试剂递送空间分布，我们在体内电穿孔过程中引入了一种荧光葡聚糖示踪剂。子宫组织的石蜡切片显示，荧光信号仅限于电穿孔区域（EP）的上皮组织中，而在未电穿孔区域（Non-EP，宫颈侧）未检测到信号，尽管两个区域都充满了注射的溶液（图1B）。这证实了葡聚糖的摄取依赖于电穿孔，并支持了组织内镶嵌编辑的预期，这与之前使用这种方法的研究结果一致[17]。作为初步验证目标，我们选择了小鼠10号染色体上的一个1.1-Mb区域，该区域包含高移动性组AT-hook 2（Hmga2）、Wnt抑制因子1（Wif1）和Ras关联结构域家族成员3（Rassf3）基因。这个位点与人类12号染色体具有同源配置[27]（图2A），并且在我们之前的基于胚胎的研究中已被靶向[14]。同时使用三个切割位点是有意设计的，以模拟多断点CCR，并评估我们的电穿孔平台是否能够在体细胞环境中处理这种复杂性。术后第7天，从整个子宫组织中提取基因组DNA，并通过聚合酶链反应（PCR）和Sanger测序评估染色体重排的诱导情况。

在三个断点上，无论是在ssODN(+)还是ssODN(?)条件下，都检测到了相似频率的染色体重排。在ssODN(+)组中，Hmga2–Wif1位点有4/8（50%）的样本观察到精确接头，Hmga2–Rassf3位点有4/5（80%），Wif1–Rassf3位点有4/7（57.1%）（图2B，2C；S1A图；S1文件）。相比之下，ssODN(?)组观察到精确接头的比例略低：分别为2/4（50%），4/7（57%）和2/6（33%）（图2B，2C；S1A图）。这些结果表明，虽然添加ssODNs并没有增加重排的总体检测率，但它提高了特定位点上精确接头的比例。重要的是，非精确接头仅表现为小缺失（从一个到几十个碱基对不等）或简单插入，没有观察到复杂的插入或缺失（图2B）。鉴于ssODNs在引导精确连接方面的实用性，所有后续实验中始终包含ssODNs。

接下来，我们评估了诱导染色体间易位的可行性，即两个不同染色体之间的片段交换。为了选择稳健的目标位点，我们关注位于X染色体上的功能性基因间重复RNA元件（Firre）基因。Firre位点通过与其他染色体上的调控区域的三维空间相互作用在核组织中起核心作用[28]（图3A）。在这项研究中，我们选择Firre相互作用区域作为分子基准；它们已知的空间接近性使它们成为测试我们方法诱导染色体间事件能力的理想候选者，而不是为了研究它们的生物学功能本身。因此，我们没有评估这些修改的功能后果，将此类分析留待未来的研究。

为了诱导小鼠子宫上皮中的染色体间易位，我们首先评估了诱导易位的可行性。为了选择稳健的目标位点，我们关注位于X染色体上的Firre基因。Firre位点在核组织中通过与其他染色体的三维空间相互作用在基因激活中起核心作用[28]（图3A）。在这项研究中，我们选择Firre相互作用区域作为分子基准；它们已知的空间接近性使它们成为测试我们方法诱导染色体间事件能力的理想候选者，而不是为了研究它们的生物学功能本身。因此，我们没有评估这些修改的功能后果，将此类分析留待未来的研究。

我们设计了实验来诱导染色体间易位，即两个不同染色体之间的片段交换。为了选择稳健的目标位点，我们关注位于X染色体上的Firre基因。Firre位点在核组织中通过与其他染色体的三维空间相互作用在基因激活中起核心作用[28]（图3A）。在这项研究中，我们选择Firre相互作用区域作为分子基准；它们已知的空间接近性使它们成为测试我们方法诱导染色体间事件能力的理想候选者，而不是为了研究它们的生物学功能本身。因此，我们没有评估这些修改的功能后果，将此类分析留待未来的研究。

我们设计了实验来诱导染色体间易位，即染色体9上的真核翻译延长因子1 alpha 1（Eef1a1）邻域位点（Eef1a1N）与染色体15上的激活转录因子4（Atf4）邻域位点（Atf4N）之间的易位，这两个位点都已知与Firre区域有接触。此外，我们还针对染色体2上的yippee like 4（Ypel4）邻域位点（Ypel4N）与染色体15上的Atf4N之间的易位，基于它们之前描述的核接近性（图3A，3C）。术后第7天，通过PCR在子宫样本中成功检测到了预测的易位接头（图3B，3D，3E；S1B图；S2文件）。这些结果表明，可以使用这种基于电穿孔的方法在体内生成染色体间重排。

在证明了靶向重排的诱导后，我们接下来利用一个大规模的结构变异来研究体细胞染色体修复的局限性和保真度。我们选择了染色体6上的In(6)1J倒位作为具有挑战性的模型底物。这个倒位大约跨越57.8 Mb（约占染色体6的40%）[29–31]，提供了一个独特的机会来评估体细胞是否能够精确地重新连接相隔数百万碱基对的染色体末端。虽然In(6)1J与骨骼表型相关[30]，但我们在这里关注其基因组结构，以评估靶向逆转过程中形成的修复接头的分子特征。在两个断点附近设计了引导RNA，并共同递送了与野生型基因组序列对应的ssODNs，以指导和分析修复的精确性（图4A）。在左侧断点，修复用的ssODN模板基于野生型序列，但也包含了protospacer相邻基序（PAM）和与In(6)1J基因组中的Cas9靶点匹配的上游核苷酸。由于修复过程中protospacer序列引入了错配，预计在恢复位置的Cas9活性将显著降低，从而最小化了重新切割的风险[32,33]。尽管RNAPs降解相对较快，但瞬时递送进一步通过限制额外切割发生的持续时间来降低重新切割的风险。

为了评估小鼠子宫上皮中57.8-Mb倒位In(6)1J逆转过程中的修复保真度，我们首先证明了靶向重排的诱导。接下来，我们利用一个大规模的结构变异来研究体细胞染色体修复的局限性和保真度。我们选择了染色体6上的In(6)1J倒位作为具有挑战性的模型底物。这个倒位大约跨越57.8 Mb（约占染色体6的40%）[29–31]，提供了一个独特的机会来评估体细胞是否能够精确地重新连接相隔数百万碱基对的染色体末端。虽然In(6)1J与骨骼表型相关[30]，但我们在这里关注其基因组结构，以评估靶向逆转过程中形成的修复接头的分子特征。在左侧断点，修复用的ssODN模板基于野生型序列，但也包含了protospacer相邻基序（PAM）和与In(6)1J基因组中的Cas9靶点匹配的上游核苷酸。由于修复过程中protospacer序列引入了错配，预计在恢复位置的Cas9活性将显著降低，从而最小化了重新切割的风险[32,33]。尽管RNAPs降解相对较快，但瞬时递送进一步通过限制额外切割发生的持续时间来降低重新切割的风险。

为了评估小鼠子宫上皮中57.8-Mb倒位In(6)1J逆转过程中的修复保真度，我们首先证明了靶向重排的诱导。接下来，我们利用一个大规模的结构变异来研究体细胞染色体修复的局限性和保真度。我们选择了染色体6上的In(6)1J倒位作为具有挑战性的模型底物。这个倒位大约跨越57.8 Mb（约占染色体6的40%）[29–31]，提供了一个独特的机会来评估体细胞是否能够精确地重新连接相隔数百万碱基对的染色体末端。虽然In(6)1J与骨骼表型相关[30]，但我们在这里关注其基因组结构，以评估靶向逆转过程中形成的修复接头的分子特征。在左侧断点，修复用的ssODN模板基于野生型序列，但也包含了protospacer相邻基序（PAM）和与In(6)1J基因组中的Cas9靶点匹配的上游核苷酸。由于修复过程中protospacer序列引入了错配，预计在恢复位置的Cas9活性将显著降低，从而最小化了重新切割的风险[32,33]。尽管RNAPs降解相对较快，但瞬时递送进一步通过限制额外切割发生的持续时间来降低重新切割的风险。箭头标记了Cas9切割位点；方框或阴影部分表示微同源性或修复区域；小写字母表示插入或缺失；下划线表示PAM序列。PAM（Protospacer Adjacent Motif）；dsDNA（双链DNA）；Pred（Predicted Sequence）。(C) 在有或没有单链寡核苷酸（ssODN）的情况下，In(6)1J在子宫上皮中的修复效率。精确的连接点表示与ssODN一致的连接；重排是指所有能够连接目标位点的连接。

序列分析显示，原始基因组配置可以得到恢复，使我们能够评估连接的准确性（图4B、4C）。在ssODN(+)条件下，左侧断点的2个测序扩增子中有1个显示出精确的修复，右侧断点的4个中有3个显示出精确的修复。相比之下，虽然在ssODN(?)实验中检测到了断点的桥接，但缺乏与供体模板相同的精确序列修复（图4B、4C；S1C图；S3文件）。尽管经过序列验证的克隆数量有限，但在ssODN(?)实验中完全缺乏精确的连接点，这表明提供ssODN可以引导修复机制在这些远距离断点处进行精确的连接。成功检测和表征了这57.8 Mb的重排事件，证明了我们的体内电穿孔平台能够捕捉和解析超长距离染色体相互作用的分子结果。据我们所知，这是对哺乳动物体细胞组织中目标最大的染色体重排之一进行表征的例子，为评估广泛结构变异的修复准确性提供了基准。

为了进一步评估我们体内电穿孔方法的适用性和修复准确性，我们针对了与疾病相关的其他基因位点。具体来说，我们尝试诱导核受体共激活因子2（Ncoa2）与乳腺癌相关基因Greb1之间的致癌易位，以及酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白epsilon（Ywhae）与NUT家族成员2（Nutm2）之间的易位。这两种融合都是子宫肉瘤的驱动因素，代表了验证我们系统多功能性的临床相关目标（图5A、5C）[34,35]。

至关重要的是，为了严格测试复杂的修复错误，我们还重新检查了之前在我们基于胚胎的研究中报告的一个7.67 Mb的倒位[14]（S2A图）。在Recql5突变胚胎中，这个位点表现出“染色体重合样”事件，其特征是广泛的结构改变——如局部复制和三倍体——这些改变是由基于复制的机制（如叉式停滞和模板切换（FoSTeS）或微同源性介导的断裂诱导复制（MMBIR）引起的。针对这个“易发生MMBIR”的位点，我们能够直接评估野生型体细胞是否通过类似的复杂机制或更简单的机制修复DNA双链断裂（DSB）。在所有测试的位点中，预测的重排连接点都通过PCR成功检测到（图5B、5D、5E；S1D图；S2B、S2C图；S4文件）。最值得注意的是，序列分析显示这些连接点没有通常与FoSTeS/MMBIR相关的复杂特征，如扩展的微同源性或局部拷贝数增加。这表明，与Recql5突变胚胎中观察到的混乱修复不同，通过这种方法在体细胞子宫上皮细胞中的修复结果主要由简单的连接事件定义，没有复杂的结构错误。关于致癌融合，尽管基因组融合事件成功生成，但在短暂的观察期间没有观察到明显的肿瘤。由于肿瘤形成通常需要较长的潜伏期、二次突变或较高的克隆负担[36]，我们在这里将分析限制在重排的分子验证上。

为了获得我们方法诱导的染色体重排的分子数据，我们对编辑后的子宫组织进行了全基因组测序（WGS）（Illumina NovaSeq6000，双端150 bp，每个样本约90 Gb）。分析这种大量组织的一个主要挑战是信号的稀释：基因组DNA是从整个子宫中提取的，而CRISPR RNP的递送仅在上皮层空间受限（图1B）。因此，大量的未编辑的间质和肌层DNA稀释了变异等位基因的频率，低于Manta等自动化结构变异检测工具的默认阈值[37]。为了解决这个问题，我们使用samtools和Integrative Genomics Viewer（IGV）在预测位点周围的±2 Mb窗口内进行了针对性的手动检查。通过这种集中分析，我们识别出了桥接预期染色体的不一致读对。例如，我们检测到了4对连接chr15和chr2（Ypel4N–Atf4N）、6对连接chr1和chr12（Ncoa2–Greb1）以及3对连接chr11和chr13（Ywhae–Nutm2）的读对（S4和S5表）。这些读对的分析确认了目标染色体之间的结构连接。大多数这些嵌合读对的映射质量（MAPQ）得分为60——这是对齐器分配的最大值——表明它们在基因组中的独特位置。重要的是，这些对跨越了预期的融合点：对于每个识别的对，一个读段映射到第一个染色体上的切割位点两侧的序列，而其配对读段映射到第二个染色体上的相应区域。这种特定的桥接配置提供了两个不同位点已经物理连接的分子证据。我们进一步通过将不一致的双端读段与正确配对的读段进行比较，估计了重排等位基因在大量DNA文库中的相对丰度。这些读对的明显丰度始终较低，大约在3.4×10^-6到6.7×10^-6之间（0.00034–0.00067%；S6表）。这个频率与体细胞嵌合性的预期以及整个器官组织的稀释是一致的。代表性的IGV截图（图6）可视化了这些跨断点的双端连接。结合嵌套PCR和Sanger测序结果，这些WGS数据为CRISPR/Cas9在子宫组织中诱导的染色体易位提供了分子支持。尽管在大量样本中很少见，但这些特定连接读段的识别支持了我们基于体内电穿孔方法的有效性。

通过使用CRISPR RNP电穿孔，我们研究了在小鼠子宫上皮中诱导染色体间易位和修复57.8 Mb倒位的可行性。这项研究证明了瞬态、无病毒的基因组编辑可以在体内重建或解决大规模染色体异常的概念。尽管由于体细胞嵌合性的固有限制，编辑效率仍然较低，但我们的发现表明，非病毒方法可以通过提供一个化学定义的平台来补充现有技术，用于研究染色体重排的机制。与目前体内递送的金标准——慢病毒或AAV基系统[11,38]相比，电穿孔避免了载体的生产和长时间的Cas9表达。我们承认，我们当前方法的编辑频率显著低于病毒载体，并且需要显微外科手术。然而，与引入整合/载体复杂性的病毒方法不同，我们的RNP方法提供了“组成简单性”和短暂的编辑窗口。因此，我们不是将其作为高效率的临床替代方案提出，而是将其作为一种简化的实验策略，适用于特定情境——例如修复结果的机制分析——在这些情境中，优先考虑没有病毒整合的“干净”基因组背景。除了避免病毒整合外，使用瞬态RNP递送还提供了几个额外的优势，与慢病毒或质粒基系统相比。具体来说，Cas9活性的有限持续时间大大减少了脱靶编辑的积累，并降低了与长时间核酸酶表达相关的灾难性基因组事件的风险，如染色体断裂、大规模缺失、非整倍体、p53介导的致癌细胞富集以及外源序列（包括病毒序列、质粒和逆转录转座子）的整合[39]。为了检测和表征这些罕见事件，我们战略性地使用了高深度短读长全基因组测序。尽管长读长测序对于结构相位分析有利，但我们选择了短读长测序，以确保识别罕见体细胞等位基因所需的超深度覆盖（10^-6），并提供验证连接准确性的核苷酸级分辨率。高质量的不一致读对桥接了预期的位点（例如Ypel4–Atf4；图6），确认了预期的重排确实发生了。我们还承认，针对CRISPR切割位点周围区域的目标深度测序，包括基于扩增子的方法，将提高检测罕见或复杂修复结果的敏感性，例如在编辑位点整合逆转录转座子[40]。这样的方法可以在未来旨在更全面表征编辑结果的研究中补充WGS。低等位基因丰度（大约3.4×10^-6–6.7×10^-6）反映了未编辑间质组织对编辑上皮细胞的显著稀释。鉴于这种稀有性和事件的非选择性，这些重排很可能代表单等位基因（杂合）修饰，有效地模拟了早期体细胞肿瘤发生中常见的随机“首次打击”情景。这些值表明，当前的效率限制了该方法在需要敏感分子检测的应用中的实用性，而不是那些需要高水平组织修饰的应用。我们的序列分析突出了该系统在体细胞背景下评估修复准确性的潜力。我们观察到通过精确修复恢复的连接点，以及显示出NHEJ/MMEJ特征的连接点。与我们在Recql5突变胚胎中的观察不同，这些体细胞中不存在复杂的结构错误，表明这些细胞的修复特征不同。因此，尽管事件频率较低，但从体内样本中检索核苷酸级信息的能力证明了这种方法在排除病毒递送的干扰因素的情况下分析修复途径的价值。我们承认，虽然Sanger测序对于单个连接序列的核苷酸级验证是足够的，但在表征编辑结果的完整谱型和频率方面存在固有局限性。基于NGS的扩增子测序将提供关于缺失分布和精确连接频率的更全面的定量信息。未来的研究将需要采用这些方法来全面表征每个目标位点的修复结果。我们还认识到细胞遗传学可视化的局限性。尽管FISH和核型分析是可视化重排的标准方法，但由于子宫上皮的低增殖指数和编辑细胞的稀有性，获得有信息量的中期分裂片在本次研究中是不切实际的。因此，我们优先选择了WGS和PCR，它们提供了评估修复准确性所需的核苷酸级分辨率——这是标准细胞遗传学方法无法提供的信息。未来的改进，如使用荧光标记的Cas9进行FACS分离，将有助于实现逐个细胞的直接评估。总之，这项研究证明了使用CRISPR RNP电穿孔进行体细胞染色体工程的基本可行性。57.8 Mb倒位的修改突显了模拟大规模基因组缺陷的潜力。尽管需要大幅提高效率才能更广泛地应用，但我们的工作为未来旨在将结构变化与生理相关、非病毒环境中的修复机制联系起来的研究提供了基础。