设计并优化了一种Cu-MOF@氧化石墨烯纳米酶，用于现场检测肌氨酸（sarcosine）和过氧化氢（H2O2）的颜色反应方法

《RSC Advances》：Design and optimization of a Cu-MOF@graphene oxide nanozyme for point-of-care colorimetric determination of sarcosine and H2O2

　　前列腺癌是全球肿瘤相关死亡的主要原因之一，因此迫切需要可靠的生物标志物来实现早期、准确和特异性的诊断。肌氨酸（sarcosine）是甘氨酸（glycine）的代谢副产物，已被视为前列腺癌进展的潜在生物标志物，但其低生理浓度以及来自复杂生物基质的干扰使得其检测在分析上具有挑战性。在这项研究中，通过溶剂热法合成了基于铜的金属-有机框架（Cu-MOF@GO），并将其用作高活性的类过氧化物酶纳米酶，用于过氧化氢（hydrogen peroxide）和肌氨酸的比色检测。Cu-MOF成功锚定在氧化石墨烯（graphene oxide, GO）表面，提供了极大的表面积（1476.8 m2/g）和丰富的催化位点，这一点通过FTIR、SEM-EDX、BET和XRD分析得到了结构与表面特性的确认。为了优化催化效率，采用了半分数中心复合设计（Central Composite Design, CCD）方法，使得对过氧化氢（浓度范围0.5–1000 μM，检测限为0.15 μM）和肌氨酸（浓度范围0.5–250 μM，检测限为0.16 μM）的线性响应具有极好的相关性系数（R2 > 0.999）。该方法还展示了使用基于智能手机的RGB颜色检测进行便携式分析的强大潜力，在加标血清样本中显示出高精度和回收率。这项工作提出了一种计算指导的方法来设计具有增强催化活性的纳米酶，提供了一种低成本、快速、线性范围广、高灵敏度和对肌氨酸具有独特选择性的传感器，使其在便携式和即时护理（point-of-care）前列腺癌筛查应用中具有前景。

1. 引言

前列腺癌是一个关键的全球健康危机，每年有超过130万新病例被诊断出来。它仍然是男性中最常见的恶性肿瘤，并被归类为全球癌症相关死亡的第二大原因。因此，需要一种特定、敏感且准确的方法来帮助早期诊断并防止数百万人的死亡。为此开发了前列腺特异性抗原（PSA）筛查测试。然而，许多患者在PSA分析中得到了假阳性或假阴性的结果。在研究与前列腺癌相关的代谢生物标志物中，肌氨酸（Sar，C3H7NO2）因其参与肿瘤生长和转移而受到广泛关注。肌氨酸是一种天然存在的非蛋白质生成氨基酸，由甘氨酸产生，也是胆碱的代谢物，主要存在于骨骼肌和前列腺组织中。在健康个体中，血清肌氨酸水平通常约为1.4 ± 0.6 μM，而在前列腺癌患者中为2–10 μM。高水平的肌氨酸与前列腺癌的起始和进展有关，其在组织、尿液或血浆等生物样本中的测定被认为是一种有前景的疾病诊断和监测生物标志物。测定肌氨酸面临的挑战包括健康个体中的微量浓度以及生物基质和其他氨基酸的干扰。因此，一种特定且高度敏感的方法将为这种重要生物标志物的分析提供完美的解决方案。文献中报道了许多测定肌氨酸的方法，包括色谱法、荧光光谱法、毛细管电泳法、电化学方法等。色谱法在分离方面表现出色，但需要昂贵的设备、溶剂和操作技能。荧光光谱法灵敏度高，但在大多数情况下需要衍生化处理和复杂的样品制备以去除干扰，且设备成本也较高。电化学方法无需样品制备，但灵敏度和选择性较低。比色法提供了简单、廉价、直接且易于应用的方法，这些方法已经为人所知数十年。已经有多种比色方法被报道用于测定肌氨酸和H2O2。然而，这些方法的线性范围狭窄，灵敏度和选择性较低。仍然需要一种简单、易于使用、成本效益高、特异性强且高度敏感的方法来分析肌氨酸，以解决前列腺癌早期诊断困难的问题。天然酶具有优异的催化效率，可以在温和条件下广泛用于各种比色测定；然而，它们的实际应用受到内在不稳定性、高成本和对环境因素敏感性的显著限制。为了克服这些挑战，最近的研究致力于开发具有酶活性的先进催化剂和功能材料，以提供比传统基于酶的传感器更敏感、稳定和经济的替代品。纳米材料由于其独特的表面积与体积比而具有多种应用。相应地，金属纳米结构和碳依赖性纳米材料（特别是MOFs）由于其独特的物理化学性质和可调结构而成为非常有前途的候选者。在MOFs中，类酶的催化行为源于与有机配体配位的氧化还原活性金属中心，这大大促进了反应过程中的电子转移。MOFs（金属-有机框架）因其结构和催化性质而类似于酶。它们具有多孔结构，为催化提供了高表面积，金属中心作为活性位点，类似于酶的活性位点。MOFs根据其孔径和金属中心对某些底物具有选择性，类似于酶对底物的选择性。MOFs可以像酶一样加速化学反应，包括氧化、水解和还原，其金属离子作为路易斯酸（Lewis acids）发挥作用。金属中心促进了通常与生物系统相关的反应。此外，多种催化机制，如氢键、电子转移和底物结合，使MOFs能够模拟酶的行为并高效催化反应。在各种MOFs中，基于铜的系统显示出显著的类过氧化物酶活性。MOF结构中均匀分布的活性位点允许在催化过程中与底物密切相互作用，从而实现出色的催化性能和高效的H2O2还原。氧化石墨烯是一种强度高、柔韧性好、亲水性强的材料，具有高表面积和中等电导率。将Cu-MOF与氧化石墨烯结合使用，可以增加表面积和孔隙率，并提高短期和长期的稳定性。本研究介绍了一种新型的Cu-MOF@GO纳米酶，专门用于过氧化氢（H2O2）和前列腺癌生物标志物肌氨酸的比色定量。肌氨酸的分析检测遵循一个高度特异性的两阶段酶促和仿生级联过程。在初始识别阶段，天然酶肌氨酸氧化酶（SOX）催化肌氨酸的氧化脱甲基化为甘氨酸和甲醛。这一酶促反应的关键副产物是过氧化氢（H2O2）的定量生成，其浓度与初始存在的肌氨酸量成正比。在随后的信号传递阶段，合成的Cu-MOF@GO纳米酶作为高效的类过氧化物酶纳米酶发挥作用。利用其锚定在高表面积氧化石墨烯支持上的丰富Cu2+活性位点，纳米酶促进了生成的H2O2分解为高活性的羟基自由基（OH-）。这些自由基立即驱动显色底物o-苯二胺（OPD）从无色状态氧化为黄色产物2,3-二氨基苯嗪（DAP）。这种黄色的强度通过其在450 nm处的最大吸光度进行定量评估，作为肌氨酸的超灵敏检测分析信号，实现了从代谢生物标志物到可测量光学输出的无缝转换。

在这项研究中，基于铜的MOF通过溶剂热组装方法均匀锚定在氧化石墨烯表面，形成了具有大表面积和丰富可访问活性位点的高稳定复合体。GO的加入增强了电子传输和催化效率，使其比聚合物支持的类似物具有更优越的类过氧化物酶活性。与惰性聚合物不同，GO提供了含氧官能团（羧基、羟基），这些官能团作为Cu2+节点的配位位点，确保了高分散性和防止浸出。此外，GO的共轭结构在H2O2的氧化还原循环中促进了更快的电子转移，这是类过氧化物酶催化的限速步骤。GO的高长宽比和片状结构允许Cu-MOF晶体更好地分散，并与分析物更有效地相互作用，从而增强了纳米酶的催化性能。该材料通过FTIR、SEM-EDX、BET和XRD分析进行了彻底表征，确认了Cu-MOF框架和GO基质之间的均匀分布和密切相互作用。通过半分数中心复合设计（CCD）优化了Cu-MOF@GO纳米酶，以在H2O2存在下实现对OPD氧化的最大催化性能。该方法已应用于血清样本中肌氨酸的测定。该传感器已集成到基于Arduino的便携式设备中，可以实现在线监测。所开发的平台为H2O2和肌氨酸提供了灵敏、选择性和成本效益高的比色测定方法，适用于前列腺癌筛查的即时护理设置。该方法提供了比先前报道的方法更宽的线性范围和更低的检测限。这项工作代表了基于纳米酶的生物传感系统的重大进展，由四个关键因素驱动。首先，通过将Cu和GO整合到制备的纳米酶中实现了催化增强。第二个因素是通过中心复合设计（CCD）实验方法进行的统计优化，第三个因素是生物标志物的特异性，如选择性研究所示。第四个因素是使用基于Arduino的便携式设备应用所提出的传感器，以实现即时护理生物标志物的定量。

2. 材料与方法

2.1. 仪器

使用UV probe版本2.21程序和Shimadzu双光束UV-可见光分光光度计（型号：1610，日本东京）进行分光光度测量。样品的傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析是在Nicolet 380 FTIR上使用KBr盘技术进行的。分辨率为4，每个光谱在500–4000 cm?1范围内累积了16次扫描。Brunauer–Emmett–Teller（BET）测量（Quanta chrome Touch Win?版本1.2）用于确定纳米酶的表面积和孔隙率。SEM测量使用Thermo Fischer Scientific（FEI）的Quanta FEG250电子显微镜和S15A溅射镀膜机进行，配备EDX（能量分散X射线分析）。Cu MOF的制备使用了Teflon内衬的水热高压釜。

2.2. 材料与试剂

本研究使用了高分析纯度的溶剂和来自Milli-Q设备（Millipore Corporation，法国）的双蒸馏去离子水。Sigma Aldrich（德国Steinheim）提供了N,N-二甲基甲酰胺无水（DMF）、硫酸铜、氧化石墨烯（GO）、苯-1,3,5-三羧酸（BTC或三聚酸）、甲醇、过氧化氢、o-苯二胺（OPD）和肌氨酸氧化酶（SOX）以及肌氨酸（Sar或N-甲基甘氨酸）。PioChem（埃及开罗）提供了氢氧化钠颗粒、盐酸、冰醋酸、醋酸钠、磷酸二氢钾和磷酸二钾。所有引用的化学品均为分析纯度（95%至99%）。人类血清和尿液的样本是在埃及Giza的VACSERA（生物制品和疫苗控股公司）的许可下收集的。

2.3. Cu MOF@GO纳米酶的制备

采用了溶剂热技术，将50克GO放入Falcon管中，在20毫升DMF中超声分散20分钟，然后加入478毫克CuSO4，并在室温下磁力搅拌15分钟。同时，在另一个烧杯中用10毫升DMF溶解420毫克三聚酸。将第二个烧杯的内容物转移到第一个烧杯中后，将混合物放入水热炉中，在140°C下烘烤12小时。所得到的MOF粉末通过离心回收，用DMF、水和甲醇分别清洗三次，然后在60°C的真空干燥箱中干燥两小时。生成的纳米酶收集在Eppendorf管中，并储存在4°C的冰箱中以备使用。在这种方法中，金属前体和有机连接剂溶解在适当的溶剂中，密封并加热一定时间以促进受控的晶体成核和生长。精确控制的反应环境允许对晶体形态和颗粒均匀性进行精细控制。在这项工作中，选择铜作为中心金属，因为它具有优异的催化性能、结构灵活性、高热稳定性和化学稳定性以及低成本。三聚酸（BTC）作为有机连接剂；其苯环上的三个对称定位的羧基群以多个角度与Cu2+离子配位，构建了一个坚固且高度多孔的框架，具有大的表面积和稳定性。无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）被用作反应介质，因为它对金属盐和有机配体都有良好的溶解性，这有助于形成结构明确的MOF晶体。氧化石墨烯（GO）被引入作为支撑基质，以进一步增强分散性和电子转移，并增加用于锚定Cu-MOF的表面积。这种混合结构有利于催化位点的可及性，并大大增强了纳米酶的过氧化物酶样活性，使得H2O2和肌苷酸的比色检测具有高灵敏度。

2.4. Cu MOF@GO的过氧化物酶样活性及使用比色法检测H2O2

为了检验所制备纳米酶的过氧化物酶模拟活性，使用了OPD。过氧化物酶可以在H2O2存在下氧化OPD（无色溶液），生成二氨基吩嗪DAP（黄色溶液）。反应始于H2O2在纳米酶的金属中心分解，产生活性氧物种（ROS），这些ROS进一步将OPD底物氧化为2,3-二氨基吩嗪（DAP）。由于DAP的黄色，可以对其进行视觉检测，其颜色与H2O2的浓度相关，见图S1。实验方法是将360 μL 10 mM的OPD与360 μL 10 mM的H2O2和10 μL Cu-MOF@GO纳米酶（1 mg ml?1）混合（所有试剂均使用双蒸水制备），然后加入2770 μL pH 4.0的0.1 M醋酸盐缓冲液。醋酸盐缓冲液的制备遵循欧洲药典标准。pH是影响纳米酶过氧化物酶活性的主要因素之一，因此制备醋酸盐缓冲液是为了控制pH值。将混合液置于40 °C的水浴中10分钟后，通过测量450 nm处氧化OPD的吸光度并记录300–600 nm范围内的UV-vis光谱来评估反应。之后需要对不同组分的数量以及缓冲液pH和孵育时间进行优化。

2.5. Cu-MOF@GO纳米酶的过氧化物酶模拟活性优化

初步实验在恒定H2O2浓度下进行，以优化五个因素。首先发现酸性pH值会产生更好的吸光度。第二个因素是OPD浓度，低于30 mM的浓度可以获得最佳吸光度。第三个因素是纳米酶浓度，低于2 mg ml?1的浓度显示出增强的吸光信号。第四个因素是温度，低于50 °C的温度有利于几乎完全氧化OPD。第五个因素是孵育时间，发现超过15分钟后结果趋于平稳。初步实验后，采用质量设计（QbD）进一步优化每个因素。采用了表面响应方法论；使用半因子中心复合设计来优化上述五个因素，实际进行了32次实验以找到每个因素的最佳水平。只测量了一个响应参数，即吸光度，吸光度越高越好。图1显示了五个因素的最高和最低水平及其测量的响应值。

2.6. 构建H2O2测定的校准曲线

使用从中心复合模型获得的最佳实验条件，测试了不同浓度的H2O2与Cu MOF@GO催化的H2O2和OPD之间的反应。采用了2.4节中提到的相同程序，在450 nm处测量吸光度并构建校准曲线。

2.7. Cu-MOF@GO纳米酶的表征

使用EDX光谱确定存在的元素和纯度。通过SEM显微镜检查表面形态和颗粒形状。使用FTIR研究化学成分之间的相互作用以及制备的纳米酶的化学组成的变化，同时使用BET分析表征表面积和孔隙率。

2.8. 使用肌苷酸氧化酶（SOX）和制备的纳米酶检测肌苷酸

在pH 7下制备了每毫升0.5单位的肌苷酸氧化酶，将其分别与250 μM的肌苷酸溶液以1:1的体积比混合，在室温下孵育10分钟。从该混合物中取出360 μL（此反应代表H2O2的来源），然后加入360 μL 10 mM的O-苯二胺和10 μL Cu-MOF@GO纳米酶（1 mg ml?1），最后加入2770 μL pH 4.0的0.2 M醋酸盐缓冲液。将混合液置于40 °C的水浴中10分钟后，通过测量450 nm处氧化OPD的吸光度来评估反应。

2.9. 肌苷酸测量的优化和校准曲线的构建

为了优化肌苷酸与SOX之间的反应，研究了几个因素。这些因素包括缓冲液pH、温度和孵育时间、SOX与肌苷酸的比例。优化后，使用之前的程序分析了不同浓度的肌苷酸，并在450 nm处测量吸光度以构建肌苷酸校准曲线。

2.10. 便携式Arduino依赖的RGB分析

开发了一个极其灵敏的RGB传感平台，连接到Arduino微控制器上，用于便携式、现场定量检测H2O2和肌苷酸。该设备具有与传统分光光度计相同的光学功能，但组件小巧、便宜且便携。它由五个主要部分组成：一个单色光源（450 nm），提供稳定的激发；一个3D打印的比色皿支架，使用ELEGOO Neptune 3打印机（埃及制造）；比色皿支架有两个正交开口，一个在顶部允许光线进入，另一个在侧面以便以90°角检测透射信号；一个RGB颜色传感器（TCS34725-3.8 M:1，HiLetgo，中国），用作检测器来捕捉透射光强度；以及一个Arduino Nano 3.0微控制器（美国制造），用于处理传感器输出并计算其吸光度。处理后的数据通过mini-USB或USB OTG连接在笔记本电脑或智能手机上显示，这种连接也为系统供电。在这种特定配置中，只监测蓝色通道，因为随着分析物浓度的增加，该通道的信号变化最明显。总体而言，这个设置是根据Jun-Jie Poh等人开发的便携式设计改编的。

3. 结果

疾病的早期和有效诊断依赖于准确及时的生物标志物浓度检测，以便有效治疗并改善患者预后。本研究重点关注前列腺癌生物标志物肌苷酸的测定。在这方面，具有内在酶模拟催化活性的纳米酶作为一种强大的替代品出现，它们提供了高稳定性、可调活性和成本效益高的合成方法。鉴于这些优势，本研究专注于设计和优化一种Cu-MOF@GO纳米酶，该纳米酶表现出改进的过氧化物酶样活性，用于H2O2和肌苷酸的灵敏比色检测。如前所述，级联反应包括两个步骤：第一步是肌苷酸与SOX反应生成H2O2，第二步是生成的H2O2将OPD底物氧化为DAP黄色溶液。因此，这种产生的黄色与H2O2浓度相关，而H2O2浓度又与肌苷酸浓度相关。结果首先从第二步的优化、应用和验证开始，以确定H2O2。然后，在建立过氧化物酶模拟活性后，讨论了精心设计的结构表征，以了解制备纳米酶的形状、孔径、表面积和组成，从而将化学性质与纳米酶的性能联系起来。接下来讨论了纳米酶的优化、应用和验证，以确定肌苷酸生物标志物。最后，展示了选择性研究、重复性研究以及与先前报道的比色传感器的比较。

3.1. H2O2的比色检测

过氧化氢在生物学许多领域都很重要，例如疾病筛查和污染追踪。它是氧化应激的标志，与多种疾病有关，包括恶性肿瘤、神经系统紊乱以及心脏和血管问题。这使得H2O2有助于发现组织损伤并跟踪疾病的恶化情况。该反应由作为过氧化物酶类似催化剂的制备纳米酶催化，这种催化剂促进了H2O2（目标分析物）与OPD底物之间的反应，产生DAP黄色溶液，其强度与H2O2浓度相关。反应需要控制OPD浓度、纳米酶浓度、温度和时间，这些都在后续部分进行了优化。纳米酶与H2O2和OPD反应的过氧化物酶样活性的提出机制如下：首先，H2O2分子吸附在纳米酶表面，通常结合到表面金属位点；其次，表面金属位点将电子转移给H2O2，从而断裂O–O键；第三，H2O2的均裂产生OH˙自由基，这些自由基随后氧化底物如OPD，产生比色信号。该测定基于H2O2浓度与Cu-MOF@GO纳米酶介导的OPD催化氧化之间的直接和比例相关性。这里H2O2代表目标分析物，其浓度将在后续小节中与肌苷酸的测定相关联。该方法展示了出色的分析性能，吸光度谱在0.5 μM到1 mM的广泛浓度范围内逐渐增加，见图S1B。所提出的纳米酶传感器用于构建一个非常线性的校准曲线，相关系数（R）为0.9998，检测限（LOD）为0.17 μM。收集的数据加强了合成纳米酶用于开发准确且低成本的H2O2检测点-of-care系统的可行性。

3.2. Cu-MOF@GO纳米酶的过氧化物酶模拟作用的优化

采用半分数中心复合设计（CCD）来优化Cu/GO纳米酶与H2O2反应的催化性能，评估了五个关键因素的联合效应：缓冲液pH、OPD浓度、纳米酶浓度、反应温度和孵育时间，如表S1所示。这种设计允许仅使用32次实验运行来探索变量之间的线性和二次交互作用，而不是完整的25 = 243种可能组合，从而显著减少了实验工作和材料消耗。测量的吸光度值范围从0.43到1.12，反映了纳米酶在不同条件下的过氧化物酶样活性。可以观察到，反应效率对pH和底物浓度之间的相互作用以及催化剂剂量和温度敏感。最大吸光度1.12是在中心点条件获得的：pH 4.0、OPD 10.5 mM、纳米酶1.5 mg ml?1、40 °C、10分钟，这意味着底物可用性和催化表面活性之间的最佳平衡。这一结果通过图S2中的期望图和图S3中的最佳吸光度得到了证实。较低或较高的pH值导致吸光度降低，这是由于酶样稳定性降低或底物离子化效应。使用分数CCD提供了几个优势：它能够以高统计置信度识别显著因素及其相互作用，减少了实验次数，同时保持了模型准确性，并生成了可靠的响应表面和等高线图来可视化最佳条件。这种方法在处理纳米酶系统时特别有利，因为多种合成和/或操作参数可能会非线性影响催化效率。

3.3. 提出的H2O2测定方法的验证

所提出的分析技术根据ICH法规进行了验证。具体细节在3.9节中讨论。通过分析三种浓度的标准过氧化氢溶液（1、50和600 μM）来评估方法的准确性。每种浓度测量三次（总共九次测定），并计算平均回收百分比（R%）以评估方法准确性，平均值为99.86% ± 0.59（表1）。在两个水平上评估了方法的精确度：日内精确度（重复性）和日间精确度（中间精确度）。对于日内精确度，同一浓度水平在一天内测量三次。对于日间精确度，测量在不同的日子重复三次。在日内和日间测量中，可接受的相对标准偏差（RSD%）值支持了方法的可重复性（表1）。该方法的线性在0.5–1000 μM H2O2的浓度范围内得到了评估，校准曲线和回归方程表现良好，见图S1A。检测限（DL）和定量限（QL）是通过响应的标准偏差（SD）和校准曲线的斜率（m）计算得出的，其公式分别为LOD = 3.3 (SD/m) 和 LOQ = 10 (SD/m)。根据这些公式，得到的数值分别为0.17 μM和0.499 μM，见表1。通过故意改变特定的实验条件（缓冲液pH值、温度、孵育时间和催化剂浓度）来评估方法的稳健性。观察到的RSD%值较低，见表2，这支持了所开发的比色传感器的可靠性和稳定性。

表1

使用所提出的比色方法测定H2O2和肌氨酸的测定和验证参数

参数
H2O2
肌氨酸

线性范围（μM）
0.5–1000
0.05–250

斜率
0.1813
0.006

截距
0.0015
0.197

相关系数（r）
0.9998
0.999

准确度（平均值 ± 标准偏差）
99.86 ± 0.59a
98.74 ± 0.88b

LOD（μM）
0.17
0.016

LOQ（μM）
0.499
0.051

精密度（%RSD）

日内精密度（重复性）c
0.758
0.861

日间精密度（中间精密度）d
1.662
1.921

a
三种浓度（1, 50, 600 μM H2O2）各三次重复实验的平均值。
b
三种浓度（0.1, 50, 200 μM肌氨酸）各三次重复实验的平均值。
c
日内精密度（重复性）：在同一天内测量三种浓度，每种浓度测量三次。
d
日间精密度：在不同天内测量三种浓度，每种浓度测量三次。

表2

在固定浓度600.0 μM H2O2下所提出的比色方法的稳健性

参数
值
吸光度
RSD%

缓冲液pH值
4.2
0.961
0.936
0.942
1.379

3.8
0.992
1.01
1.03
1.881

温度（°C）
38
0.984
0.979
0.995
0.830

42
1.03
1.01
0.994
1.783

孵育时间（分钟）
11
0.974
0.969
0.977
0.415

9
0.996
1.01
1.02
1.195

催化剂浓度（mg/mL）
1.1
0.997
0.993
1.02
1.452
0.9
0.975
0.968
0.966
0.487

3.4. 制备的Cu-MOF@GO纳米酶的表征

制备的纳米酶通过SEM-EDX、BET、FTIR和XRD分析进行了研究，以了解其结构、形态和组成如何增强类似过氧化酶的活性。

3.4.1. 扫描电子显微镜和能量色散X射线分析（SEM-EDX）

扫描电子显微镜（SEM）用于高分辨率下观察Cu-MOF@GO纳米酶的表面形态和结构特征。该技术可以观察Cu-MOF晶体的大小、形状以及在氧化石墨烯（GO）表面的分布。能量色散X射线光谱（EDX）用于确定Cu-MOF@GO纳米酶的元素组成。低倍率下的图2A显示了Cu-MOF晶体在较暗的、有皱褶的、分层的GO支撑层上的均匀分布。该图突出了金属MOF节点与碳质支架之间的高组成对比度，证实了催化中心有效分散且没有显著的团聚现象。在高分辨率下，图2B清晰地显示了Cu-MOF晶体的多面体形态，具有典型的HKUST-1型框架的八面体特征。这些晶体的尺寸分布范围在200到500纳米之间，具有较高的表面积与体积比，有利于催化转化。这些有棱角的颗粒与GO表面的紧密接触表明了强烈的结构锚定，这对于促进类似过氧化酶的氧化还原循环中的快速电子转移至关重要。

图2

(A) 低倍率图像显示了Cu-MOF@GO纳米酶中MOF颗粒锚定在皱褶的GO表面上；(B) 高倍率图像显示了制备的MOF的多面体形状；(C) EDX元素图显示了Cu在富碳GO上的均匀分布。通过EDX分析进一步验证了复合材料的元素纯度和定量分布。光谱显示铜（Cu）是主要的金属相（占重量的57.36%），是负责分解H2O2的活性催化位点。碳（C）和氧（O）分别占重量的35.28%和7.36%，对应于有机的三聚酸连接剂和功能化的GO支撑层。没有外源元素峰的存在证实了溶剂热合成的成功，并确保了观察到的类似过氧化酶的活性本质上来源于Cu-MOF@GO的结构。

3.4.2. 布鲁纳-埃梅特-特勒（BET）分析

布鲁纳-埃梅特-特勒（BET）表面积分析用于测量Cu-MOF@GO纳米酶的比表面积。该技术提供了关于材料孔隙率和表面特性的宝贵信息，这对于理解其催化性能和吸附能力非常重要。通过在77.35 K下进行N2吸附-脱附等温线实验，量化了Cu-MOF@GO纳米酶的永久孔隙率和结构特征。如图S4所示，材料表现出IV型等温线轮廓，具有明显的H3型滞后环。H3环的存在表明该材料是具有狭缝状孔隙的层次多孔系统。这些狭缝状孔隙并非MOF本身的固有特征，而是由于多面体MOF晶体在非刚性的石墨烯氧化物（GO）层状结构中的界面组装而形成的。计算出的布鲁纳-埃梅特-特勒表面积为1476.8 m2 g?1，显示出高度多孔的结构和大量的可访问活性位点。C常数为30.7，表明氮与表面的相互作用适中，其相关系数（r = 0.9974）证实了BET拟合的准确性。这个值是典型的HKUST-1（Cu3(BTC)2）框架的特征，表明MOF的内部结构在与GO杂化后保持完整且完全可访问。该结构由苯-1,3,5-三羧酸（三聚酸）连接剂协调的铜桨轮簇组成，形成了面心立方晶格，具有高内在孔隙率。总孔体积确定为0.1983 cm3 g?1，进一步支持了纳米复合材料的高度多孔性。为了进一步探索孔隙结构，使用BJH（Barrett–Joyner–Halenda）模型对吸附分支进行了孔径分布（PSD）分析，如图S5所示。分布显示平均孔径为1.4161纳米，主要位于大微孔和小介孔之间的过渡区域。这种层次化的孔隙结构对于传感机制具有功能意义：较小的孔提供了高能量的环境，有利于类似过氧化酶的H2O2分解；而较大的介孔通道（延伸至60.0纳米）则作为质量传输的“高速公路”，促进了肌氨酸底物和庞大比色中间体的快速扩散。这种双尺度孔隙结构是分析试验中观察到快速响应和低检测限的根本原因。高表面积结合狭窄的孔道表明Cu-MOF晶体在石墨烯氧化物支撑层上发育良好且分布均匀，从而提供了丰富的催化中心和快速的质传输路径，以实现类似过氧化酶的活性和敏感的比色检测。

3.4.3. 傅里叶变换红外光谱（FTIR）

傅里叶变换红外光谱（FTIR）用于研究Cu-MOF@GO纳米酶中存在的官能团。该技术有助于识别Cu-MOF与石墨烯氧化物之间的特定键合相互作用，特别是石墨烯氧化物表面存在的羟基、羧基和环氧基团。Cu/GO复合材料的FTIR光谱（图S6）显示了特征性的振动特征，证实了铜物种与石墨烯氧化物的成功结合。3400至3500 cm?1之间的宽吸收带对应于三聚酸羧基的O–H伸缩振动，1720 cm?1附近的信号对应于羧基的CO伸缩振动。大约1620 cm?1处的带来源于石墨烯中sp2碳的CC伸缩，表明沉积过程后部分恢复了共轭结构。1100–1200 cm?1附近的峰对应于GO表面剩余的环氧基和烷氧基的C–O和C–O–C振动。

3.4.4. X射线衍射分析（XRD）

X射线衍射（XRD）用于确定Cu-MOF@GO纳米酶的结晶度和相组成。该技术可以识别材料中存在的结晶相的衍射图案。分析显示在2θ = 36.63°、43.55°和50.66°处有明显的衍射峰，这些峰对应于铜（Cu）相，其中43.55°处的峰强度最高，如图S7所示。这些峰证实了纳米酶中存在结晶铜，这是其主要成分。此外，在2θ = 26.66°处观察到一个峰，对应于石墨（C6），表明材料中也包含了石墨。另一个在2θ = 74.31°处的衍射峰归因于氧化亚铜（Cu2O），这可能是Cu、GO和三聚酸之间某种相互作用的结果。这些峰的相对强度，特别是铜的主导地位，突显了材料中铜的显著含量，这对纳米酶的催化活性起着关键作用。观察到的XRD图案与ICDD数据库中的标准参考图案进行了比较（参考代码：Cu为96-901-1605，石墨为96-901-2706，Cu2O为96-101-0964），进一步证实了制备的纳米酶中存在的结晶相。这些发现表明Cu-MOF@GO纳米酶由定义明确的结晶铜相组成，石墨烯和Cu2O共同构成了材料的整体结构和潜在的催化性质。

3.5. 使用肌氨酸氧化酶和制备的Cu MOF@GO纳米酶测定肌氨酸

肌氨酸（Sar）最近被证明是一种与前列腺癌进展和转移密切相关的有前途的代谢生物标志物。在这项工作中，通过结合肌氨酸氧化酶（SOX）的氧化功能和合成的Cu-MOF@GO纳米酶的类似过氧化酶的催化活性来测定肌氨酸，后者在H2O2存在下介导OPD的氧化。检测分为两个连续步骤进行，如实验部分所述。首先，在室温下、pH 7.0的0.2 M磷酸盐缓冲液中，使用1:1的SOX与肌氨酸比例，在SOX（0.5 U/mL）存在下对肌氨酸进行酶促氧化15分钟，生成与肌氨酸浓度成比例的过氧化氢（见图1）。随后，通过Cu-MOF@GO纳米酶对OPD的催化氧化，在450 nm处进行分光光度测定。由此产生了一个敏感的比色响应，该响应与肌氨酸的浓度直接相关。

3.6. 优化肌氨酸与肌氨酸氧化酶的反应并构建校准曲线

为了优化肌氨酸与肌氨酸氧化酶之间的反应，研究了五个因素。第一个因素是SOX浓度，尝试了不同的浓度（0.1–1 Unit/mL），其中0.5 Unit/mL显示出最佳响应（见图S8A）。第二个因素是pH值，尝试了不同的pH值（5、6、7、8、9），其中pH 8在SOX与Sar之间的反应中产生了更高的信号（见图S8B）。第三个因素是SOX与Sar的比例，尝试了不同的比例（1:1、1:2、1:3、3:1），其中1:3的比例显示出更好的传感器性能（见图S8C）。第四和第五个因素是反应温度和时间，尝试了不同的值（温度为25、30、35、40 °C，时间为5、10、15、20分钟），其中室温下的10分钟显示出最高的吸光度读数（见图S8D和S8E）。之后准备了不同的对照实验，以确保测量的信号是由于SOX与Sar之间的反应产生的H2O2。同时确保PAD颜色的产生仅是由于H2O2在Cu MOF@GO纳米酶存在下对OPD的作用。表S2中的结果显示，没有纳米酶的SOX和Sar不能氧化OPD。这意味着Cu MOF/纳米酶的存在对于过氧化酶活性至关重要。另一个观察结果是，没有SOX的纳米酶没有产生信号，这意味着合成的纳米酶仅具有类似过氧化酶的活性而没有氧化酶活性。所提出的方法已根据ICH指南验证了用于测定肌氨酸的可行性。为了构建校准曲线，准备并评估了一系列不同浓度的肌氨酸溶液。研究确定，在0.05至250 μM的范围内存在线性关系，检测限为0.016 μM，R2值为0.999（见图S9A）。前面提到的Arduino设置以示意图的形式展示在图S9B中。测量得到的颜色对应的光谱表明，随着肌肽浓度的增加，吸光强度逐渐增强。由于氧化产物（OPD）的量与产生的H2O2直接相关，而H2O2又与肌肽浓度相关，因此这种比色响应可以可靠地用于定量分析。如表1所示，这些结果具有良好的准确性和精确度。数据验证了为测量肌肽而开发的比色纳米酶集成方法的高灵敏度。

3.7. 与先前报道的方法比较

使用该方法的感觉能力与文献14,18–29中报道的其他纳米材料进行了比较（见表2）。所报道的方法是新型合成的催化剂，具有类似过氧化物酶的活性，用于测定H2O2和/或肌肽，它们都表现出良好的性能和先进的表征，但大多数方法的线性范围较窄，并且大多数方法只针对一种分析物（H2O2或肌肽）进行验证参数的测试。另一方面，能够同时测定H2O2和肌肽的方法显示出相对较低的灵敏度。所提出的比色技术在测定H2O2和肌肽方面表现出卓越的灵敏度（更低的检测限）和更宽的线性范围，这比之前报道的技术具有显著优势。这些出色的分析结果可能归因于所提出的传感器的独特设计，该设计通过GO的连接扩展了Cu的催化活性。此外，通过CCD模型的仔细和计算优化，完善了影响H2O2和肌肽测量的关键参数。最后，基于Arduino的设备在现场进行比色测定，提高了所提出传感器的适用性（见表3）。

3.8. 选择性研究

基于Cu-MOF@GO的比色传感器在选择性方面面临巨大挑战，因为几乎所有生物样本都含有可能干扰肌肽测定的氨基酸。所提出的方法在真实样本中对肌肽的测定具有独特的选择性，原因有二：首先是来自芽孢杆菌的肌肽氧化酶与肌肽之间的高度特异性；其次是针对肌肽分析优化的实验条件，使得制备的纳米酶成为仅在特定条件下激活的智能纳米材料。通过使用结构上非常相似的氨基酸（甘氨酸、甲基丙氨酸）研究了选择性。肌肽氧化的产物甲醛也可能产生干扰。葡萄糖和尿酸是人体中的常见底物，它们各自有相应的氧化酶。最后，尿液样本中含量丰富的肌酐在血清中的含量有限。图3中的结果显示了所提出方法对肌肽的独特选择性。

3.9. 比色分析在真实样本中定量肌肽的应用

从VACCERA购买了健康个体的血清样本。样本用pH值为8的磷酸盐缓冲液按1:1的比例稀释，然后从稀释液中取指定体积与0.5单位/毫升的SOX以最佳比例混合，并在室温下放置10分钟。之后，将360微升混合物加入360微升10 mM的OPD和10微升1毫克/毫升的Cu MOF@GO中，再加入2770微升pH值为4的醋酸缓冲液。最终溶液在40°C下保持10分钟，然后在450纳米处分析产生的溶液的吸光度。肌肽浓度将根据校准曲线的回归方程计算得出。为了进行比较，还分析了添加了标准肌肽的血清样本（见表4）。为了评估该方法的准确性和实用性，将建议的比色测定的结果与市场上销售的肌肽检测试剂盒的结果进行了对比（见表5）。结果显示，所提出的比色测定方法能够在正常范围以及前列腺癌病例中定量测定血清中的肌肽，具有公认的准确性和精确度。

3.10. 使用Arduino设备进行现场分析的肌肽测定

虽然高精度分光光度法验证了Cu-MOF@GO纳米酶的基本催化性能，但作为一种诊断工具的实际效用——特别是对于前列腺癌筛查——取决于其在资源有限环境中的可用性。为了展示我们平台的“即时检测”（PoC）潜力，我们将比色测定集成到一个定制的便携式分析装置中。与传统的实验室仪器不同，该系统使用低成本的TCS34725 RGB颜色传感器与Arduino Nano微控制器接口，进行实时的现场分析。先前的研究已经证实，通过使用RGB颜色传感器可以定量评估各种分析物，包括肌肽、镍和铁。检测原理基于从无色到黄色的颜色转变的数字量化（DAP）。随着肌肽浓度的增加，黄色产物的强度上升，导致RGB传感器的蓝色通道响应系统性地、可测量地降低。这种反比关系经过校准，以匹配分光光度试验中观察到的光学吸收趋势。如图4所示，得到的校准曲线显示出高度的线性，证明我们的纳米复合材料即使在转换为简化的便携式电子接口后，仍保持其超灵敏的检测能力。通过绕过对先进实验室基础设施的需求，这种基于Arduino的设置将Cu-MOF@GO纳米酶从实验室材料转变为一种可行的临床工具，用于快速、分散的生物标志物监测。

3.11. Cu-MOF@GO纳米酶在可靠肌肽定量方面的重现性和操作稳定性评估

Cu-MOF@GO纳米酶的重现性和稳定性随时间进行了评估。通过使用同一天制造的三个独立传感器，在5.0 μM、80.0 μM和200.0 μM的浓度下测量肌肽来评估重现性。然后，使用在不同天制造的三个传感器评估相同的两个浓度水平。每个传感器的批内和批间制备的相对标准偏差均小于2% RSD，表明制造和性能的重现性，结果展示在图S10A和S10B中。还评估了Cu-MOF@GO纳米酶在六个月期间的长期稳定性，针对相同的三个肌肽浓度水平。在此期间，还评估了两个传感器在六个月内随着H2O2氧化OPD底物时的持续催化活性，也获得了令人满意的RSD%。这些定量和定性结果表明，Cu-MOF@GO纳米酶在生物传感应用中具有良好的结构稳定性和催化稳定性，证明了其在实际诊断测试应用中的可靠性和耐用性。

4. 结论

新型Cu-MOF@GO成功合成并优化为高性能的过氧化物酶类似纳米酶，用于定量H2O2和Sar（与前列腺癌进展相关的关键生物标志物）。通过使用半分色CCD进行统计优化，系统地研究了实验因素，大大提高了这种纳米酶的催化效率和分析响应。优化的纳米酶对H2O2和肌肽都具有宽的线性范围和低的检测限，其性能优于许多先前报道的比色系统。其出色的稳定性、重现性和在添加尿样中的高回收率证实了所开发平台的可靠性和实际潜力。此外，将比色测定与基于智能手机的RGB分析相结合，为便携式、低成本和即时检测开辟了有趣的方向。这项工作不仅提出了设计和优化纳米酶传感器的简单策略，还通过智能分析设计和纳米材料工程促进了早期、可及的前列腺癌筛查。展望未来，未来的研究可以探索这种纳米酶在检测更广泛生物标志物方面的潜力。将这种纳米酶与其他传感器结合到便携式和低成本的诊断设备中，可能会彻底改变即时检测，特别是在早期疾病检测方面。其高表面积、选择性和易于功能化的特点表明其在医学诊断、环境监测和其他需要高效、快速检测分析物的领域具有显著的应用前景。

利益冲突

没有需要声明的利益冲突。

数据可用性

本研究生成或分析的所有数据都包含在文章[及其补充信息（SI）中。补充信息可获取。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d6ra01609j。

致谢

作者衷心感谢开罗大学药学院的Marianne Nebsen教授和Ahmed Hafez副教授提供的宝贵科学建议，以及慷慨提供的肌肽、肌肽氧化酶和这项工作所需的商业试剂盒。