从硅烷到硅杂芳烃：为单分子力谱研究开发的稳健功能化方法

《ChemBioChem》：Silanes to Silatranes: Robust Functionalization for Single-Molecule Force Spectroscopy

　　摘要

基于原子力显微镜的单分子力谱（SMFS）实验需要稳定且可重复的悬臂和表面功能化处理。传统的硅烷基方法稳定性较差，严重影响了其可重复性和性能。在这里，我们介绍了一种基于乙醇的氨基丙基硅烷（APS）功能化协议，该协议在相似的时间框架内实现了更优的性能。特别是，将这种方法与细菌粘附素耦合后，我们成功将尝试进行SMFS实验并获得可用单分子数据的比例提高了两倍。该方法通常可以应用于氮化硅和玻璃悬臂及表面，包括经过机械改性的悬臂，这些悬臂优化了快速响应时间、低刚度和低漂移特性。此外，我们还展示了一种简单且经济高效的方法，使用常见的溶剂和台式紫外线-臭氧清洁器来清洗这些功能化的悬臂，从而实现重新功能化并延长悬臂的使用寿命。总体而言，这为高质量的SMFS实验提供了一种可靠、可重复且多功能的功能化方案。

3-(氨基丙基)硅烷（APS）在单分子力谱实验中的表面功能化方面比传统的硅烷基方法具有更高的稳定性。本文利用细菌粘附素附着来证明基于APS的表面功能化在模型蛋白单分子展开实验中的优势，为未来其他生物系统的研究奠定了基础。

1 引言

单分子力谱（SMFS）是一种强大的工具，用于探究生物系统的各种方面，包括蛋白质折叠、配体相互作用、细胞复制和运动。在SMFS实验中，单个生物分子被固定在表面和力传感器之间，例如原子力显微镜（AFM）的悬臂之间[1]。施加力会驱动生物分子向展开或解离状态转变。这些状态在力-伸展曲线（FEC）中通过特征性的力下降来表示。SMFS可以探究系统在生物学环境中是否受到力的影响[2]。这些研究已经报道了蛋白质如肌动蛋白、α-螺旋重复蛋白和膜蛋白的构象动态、折叠中间体及其能量景观[3-8]。这些研究还可以为由于蛋白质错误折叠引起的遗传疾病提供见解，从而可能改进治疗方法[9]。为了使用SMFS获得准确且可重复的数据，需要可靠的化学功能化方法，以特异性地将感兴趣的单分子连接到表面和力探针上。在这种测定中，带有可寻址标签的蛋白质被固定在表面上，而标签的结合伴侣（例如生物素-亲和素、凝聚素-码头蛋白、肽-细菌粘附素[10-12]）则被固定在AFM探针（悬臂）的末端。或者，也可以通过共价生物正交偶联策略（例如DBCO-叠氮化物点击化学）实现特异性固定，无论是直接用点击化学试剂标记样品，还是通过sortase或OaAEP1等酶促连接[11, 13]。然后，当探针轻轻接触表面（约250 pN）时，标签与其伴侣之间有可能会形成键。这就建立了表面和探针之间的化学连接，从而可以对蛋白质施加力。这种特异性附着提供了一个独特且定义明确的附着点，减少了与非特异性粘附（1 nN）相关的人为误差[1]。如果没有这种特异性，可能需要数千次尝试才能获得正确的蛋白质展开模式[7, 14]。鉴于表面和探针功能化是进行AFM SMFS实验的许多步骤中的第一步，因此开发一个可靠的协议至关重要。随着时间的推移，表面化学功能化的可靠性和特异性已经取得了显著进步。早期的方法通常依赖于蛋白质对聚合物涂层表面的非特异性粘附[15]。这些方法存在许多非特异性和多重附着的问题。后续的改进涉及使用聚乙二醇（PEG）连接器和目标蛋白质上的特定终止标签[1, 10, 16, 17]。通常，使用(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）或其他类似的硅烷衍生物将生物分子固定在玻璃基底或AFM悬臂的氮化硅表面上。APTES的硅烷基团与经过紫外线-臭氧处理的表面上的自由醇反应，形成连续的单层，从而实现表面的均匀覆盖[18]。APTES的伯胺与PEG连接器一端的官能团反应；PEG另一端的历史胺与目标蛋白质上的半胱氨酸残基反应[16]。对于一步功能化，可以使用已经在一端具有三乙氧基硅烷基团的异双官能PEG分子[19]。然而，硅烷基功能化的实际效果受到硅烷不稳定性的影响。由于它们的结构和对水的敏感性，硅烷容易发生水解和自聚合。乙氧基官能团在接触水时会形成高反应性的醇，这些醇之间可能会发生反应（图1A），这可能导致表面形成粘性和不均匀的层[20]。在极端情况下，聚合的硅烷-PEG链可能在AFM悬臂上形成约100-μm大小的聚集体（图1A）。此外，不均匀的单层连接体会促进生物分子的异质聚集，阻止其单独附着在AFM探针上。

图1：APTES和APS的不同表面反应行为。(A) APS可以与经过紫外线-臭氧处理的玻璃表面反应形成所需的表面层，但也可能形成交联的聚集体，这些聚集体会附着在悬臂和表面上，从而妨碍SMFS研究对单个分子的观察，在极端情况下，形成的薄膜大到可以在可见光显微镜下看到（蓝色箭头）。(B) APS也可以与经过紫外线-臭氧处理的玻璃表面反应形成表面层，但在溶液中抵抗交联，从而实现所需的单分子固定。

3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷（APDMES）已经成功解决了APTES的一些缺点[21-25]。然而，由于含有乙氧基硅烷官能团，APDMES在水环境中容易发生水解，这表现为功能化表面层随时间的降解[20, 26]。因此需要一种具有与APTES相似反应性的化合物，它能够在水环境中形成稳定的均匀单层，但不会自聚合。一个强但未被充分利用的候选化合物是3-(氨基丙基)硅烷（APS）。尽管APS没有商业可用，但其合成方法简单，具有本科水平有机化学知识的工作者也能实现。APS在结构上与APTES相似，但不是三个容易水解的乙氧基硅烷，而是形成了一个稳定的三环结构（图1B）。这种化合物仍然可以与玻璃/云母/氮化硅表面的羟基反应，但由于氮和硅之间的分子内坐标键，该结构得到了稳定，并抵抗自聚合[27, 28]。到目前为止，APS和其他硅烷衍生物已被用于将生物分子固定到AFM上进行成像和钝化表面[18, 20, 29-34]。这包括Lyubchenko及其同事使用水沉积法进行的一些基于硅烷的SMFS研究。然而，最近的研究表明，在水条件下沉积APS有一个关键缺点：APS在水中的高溶解度限制了其附着到表面的能力，导致沉积不均匀和单层形成不完全[20]。Andersson等人展示了他们无法使用水沉积法达到完全覆盖表面的APS层厚度。然而，他们展示了一个简单的协议，包括乙醇沉积和短暂的固化步骤，可以实现完整的单层[20]。虽然这项工作侧重于表面钝化，但能够实现完整单层形成的方法对SMFS实验也非常宝贵。这样的均匀层有助于防止由于表面覆盖不均匀引起的生物分子聚集，并使固定生物分子的表面密度仅由生物分子的浓度决定。这种基于乙醇的方法促使我们提出了改进SMFS实验中生物分子附着的策略。我们之前依赖Walder等人[19]的硅烷基功能化协议，该协议使用具有一个三乙氧基硅烷基团和一个其他官能团的异双官能PEG进行了简单的功能化。然而，在我们的实验中，由于硅烷的不稳定性，这种方法的功能化成功率并不一致。在这里，通过在基于AFM的SMFS实验中实施基于乙醇的APS沉积（图1B），我们实现了显著提高的功能化成功率。在这项工作中，我们详细介绍了这种方法的实施，并强调了其与之前使用的硅烷基功能化相比的优势，包括显著更高的功能化成功率以及一致的单分子附着效率。我们还使用接触角测量法表征了该方法在玻璃表面上的化学性质。我们还讨论了如何将这种方法扩展到已经经过物理改性的悬臂上，以优化其机械性能，并通过去除功能化来实现悬臂的重复使用。

2 方法

2.1 SdrG和ddFLN4的表达和纯化

所有蛋白质都经过工程改造，在C末端添加了半胱氨酸用于硫醇-马来酰亚胺耦合，在N末端添加了10x组氨酸标签用于纯化。使用编码葡萄球菌粘附素蛋白SdrG和Fgβ标记的盘状细胞4（ddFLN4）的质粒转化E. coli BL21(DE3)细胞，然后诱导这些细胞表达相应的蛋白质。按照Milles等人的方法[10]，在37°C下，250-rpm摇床条件下，将培养物在含卡那霉素的LB培养基中培养16小时。加入1 mL的1 M IPTG，继续摇摇3.5小时直到生长停止。将培养物在8,000 g下离心10分钟。得到的沉淀物悬浮在30 mL的裂解缓冲液中（50 mM tris，50 mM NaCl，5 mM MgCl2，0.1% Tween-20，10%甘油，100 μg/mL溶菌酶）。通过Fisherbrand Model 505以40%占空比进行超声波处理120秒（8秒工作，8秒休息）。离心后的细胞再次在20,000 g下离心45分钟。收集上清液，并在含有4 mL树脂的金属亲和Ni-NTA柱中纯化。用4个柱体积（CV）的结合缓冲液（25 mM tris，500 mM NaCl，20 mM咪唑，0.25% Tween-20，10%甘油）洗涤柱子，然后加载样本。再用4个CV的洗涤缓冲液（25 mM tris，500 mM NaCl，20 mM咪唑，0.25% Tween-20，10%甘油）洗涤柱子，然后用4个CV的洗脱缓冲液（25 mM tris，500 mM NaCl，250 mM咪唑，0.25% Tween-20，10%甘油）洗脱蛋白质。通过SDS-PAGE确认蛋白质的身份。通过离心过滤去除盐分，并通过荧光测定法（Qubit Protein Broad Range Assay，Thermo Fisher Scientific Inc.）确定蛋白质浓度。

2.2 氨基丙基硅烷的合成

按照Andersson等人的方法[20]合成APS。在一个圆底烧瓶中，将APTES（2.2 mL，10.5 mmol）、三乙醇胺（0.8 mL，6 mmol）、甲醇（7 mL）和NaOH（15 mg，1.5 mmol）在85°C下回流24小时。通过旋转蒸发器去除溶剂后，将产物倒入n-己烷（50 mL）溶液中。通过真空过滤收集得到的固体。经过过夜真空过滤后，获得了1.013 g的白色固体产物（产率为72%）。将产物溶解在3 mL水中，制成1.435 M的溶液，并在4°C下保存。通过NMR确认其身份（图S1）。

2.3 表面和悬臂的清洁与功能化

玻璃盖玻片首先在丙酮中超声波处理5分钟，然后在95%乙醇中超声波处理5分钟，接着浸入3 M KOH溶液中3分钟。之后在水中冲洗并再次超声波处理3分钟，最后在N2流中干燥。表面和悬臂的清洁与功能化的具体步骤在支持信息中给出。简而言之，表面功能化首先通过紫外线-臭氧清洁（PSD Pro Series Digital UV Ozone System，PSDP-UVD8，Novascan Technologies Inc.）进行30分钟。处理后，将91 mM APS溶液中的APS滴液放在每个表面上60秒。然后用水冲洗表面，并在N2流中干燥。将表面放置在预热至75°C的培养皿中固化60秒。固化后，用水冲洗表面，在N2流中干燥，然后放入0.15 mg/mL的NHS-PEG-马来酰亚胺（1 kDa MW，Nanosoft Polymers）溶液中1-2小时。沉积后，表面先用甲苯、异丙醇和水冲洗（每种溶液中浸泡20-30次），然后干燥。接着加入50微升三钠氯酸盐缓冲液（tris-NaCl缓冲液，50 mM tris，150 mM NaCl，pH 7.4）中的蛋白质溶液，并储存在4°C的湿度箱中直至使用。在功能化处理之前，悬臂梁先分别用甲苯、异丙醇和水冲洗30秒。之后，将其暴露在紫外臭氧中30分钟。处理完成后，将每个悬臂梁放入99%乙醇中的91 mM APS溶液中45秒。随后用乙醇冲洗并用无绒布擦干，然后放在预热至75°C的培养皿上固化45秒。固化完成后，再次用清水冲洗悬臂梁，擦干，然后放入含有2毫升异丙醇的0.15毫克/毫升NHS-PEG-马来酰亚胺的甲苯溶液中，在60°C下处理1-2小时。之后再用甲苯、异丙醇和水冲洗悬臂梁（每种溶液中各浸泡30秒），再用无绒布擦干，最后加入50微升三钠氯酸盐缓冲液（tris-NaCl缓冲液，50 mM tris，150 mM NaCl，pH 7.4）中的蛋白质溶液，并储存在4°C的湿度箱中直至使用。

在对柔软的机械改性悬臂梁进行功能化处理时，需要格外小心，以防止因毛细力导致悬臂梁弯曲，例如使用氮气而不是用布擦干。这些修改后的步骤在下面的“支持方法1”中有详细说明。

2.4 SMFS 测定

使用Cypher ES AFM（Asylum Research）设备收集力-位移数据。所使用的悬臂梁为Bruker MLCT-BIO（针尖B型，名义弹簧常数为0.020 N/m）。力-位移数据以300纳米/秒的速度采集，表面接触力为250皮牛。在随机选取的20×20微米区域内对表面进行探测。每个区域内，在400个等间距的位置上获取FEC（Force-Extension Curve）数据。采集400个点后，再在表面的其他位置探测新的区域。如果检测到一个具有正确ddFLN4单分子展开模式以及随之而来的SdrG-Fgβ相互作用断裂的记录，則认为功能化成功（见图2C）。为了验证正确的展开模式，我们寻找两个能指示ddFLN4展开路径的转变，并用类似蠕虫的链（WLC，Worm-like Chain）模型进行拟合。在该模型中，弹性被视为未展开氨基酸链的弹性（使用Marko–Siggia WLC插值公式计算，持久长度为0.4纳米）和PEG连接基团的附加弹性（使用Oesterhelt等人的自由连接链模型计算，该模型考虑了PEG的结构异构化[35-37]。

2.5 悬臂梁重新功能化

之前已功能化的悬臂梁首先用水冲洗30秒，然后分别用甲苯、异丙醇和水冲洗30秒。之后将其暴露在紫外臭氧中30分钟，再分别用甲苯、异丙醇和水冲洗30秒，最后在紫外臭氧清洁剂中处理30分钟。此时，按照上述常规功能化程序对悬臂梁进行处理，从APS溶液滴加开始。

2.6 接触角测量

使用DSA 20E测角仪（Krüss）在20°C下进行静态水接触角测量。测量采用静止滴液法[38]。通过自动化给药系统将大约1.5微升液体滴到每个表面上。滴液沉积后立即拍摄其轮廓图像。根据滴液形状的不同，使用基线拟合或椭圆拟合方法通过仪器软件测量接触角。软件记录三个数值：左侧接触角、右侧接触角和平均接触角。

2.7 统计分析

所有力-距离曲线均使用Igor Pro 9软件进行分析。通过计算曲线非接触区域的平均力并从中减去该值来校正基线，从而确定零力水平。为了将力-距离曲线转换为力-位移曲线，从原始位移值中减去悬臂梁的偏转量。所有收集到的力-距离曲线都已在图3A的数据中进行分析。成功率95%的置信区间使用Wilson评分方法确定。共有28个独立实验（每个来自一个新的功能化悬臂梁），SPM化学方法的成功率为42%（95%置信区间：27-61%；n=28个AFM探针），APS化学方法的成功率为88%（95%置信区间：69-96%；n=24个）。对于重新功能化的悬臂梁，有10个之前用APS功能化的悬臂梁进行了重新功能化（n=10）。所有三个数据集的成功曲线均根据上述SMFS测定部分的标准进行识别。图3B中的详细分析选择了4个独立的SPM实验和6个独立的APS实验，这些实验产生的可分析力-距离迹线数量最多，分别为n=3,263和n=9,130。报告的单分子附着率是每个探针成功率的平均值，不确定性以平均值的标准误差表示。

（A）APS化学、APTES/SPM化学以及用APS化学重新功能化的成功率。95%置信区间以紫色线条显示。（B）两种化学方法在单分子拉伸实验中的附着成功率。红色条形表示多次试验的平均标准误差。表1使用了与上述相同的成功标准。在不同蛋白质浓度（1.16、11.6和116 μM）处理的表面上使用了三种针尖（n=3）。分别收集了807、849和802个迹线。表1显示了蛋白质浓度对单分子附着率的影响。

在每个表面上进行了一次接触角测量，总共测量了n=3个表面。报告的结果是平均接触角，其不确定性通过分布的标准差来量化。

3 结果与讨论

3.1 基于乙醇的Silatrane沉积提高了功能化成功率

基于硅烷的功能化策略虽然有时有效，但由于硅烷的不稳定性可能会受到影响。硅烷容易发生交联，形成粘性的聚合物层，使得大多数力-位移曲线无法解读。我们发现这种交联可能非常严重，以至于悬臂梁上会形成可见的聚合物层（见图1A）。这促使我们采用了Andersson等人[20]提出的新功能化策略，即使用乙醇中的Silatranes而不是硅烷进行沉积。我们通过将其与现有的蛋白质SMFS测量中的功能化策略进行比较来评估这种新方法的成功率。我们之前的功能化策略是将三乙氧基硅烷-PEG-马来酰亚胺（SPM）连接到经过紫外臭氧处理的玻璃表面或硅氮化物AFM探针上（见图2A[19]）。三乙氧基硅烷形成硅醇，这些硅醇容易与玻璃表面上的其他硅醇（或溶液中的其他硅醇）反应；马来酰亚胺通过迈克尔加成反应与目标标记生物分子的末端半胱氨酸上的巯基结合。SPM同样用于将带巯基的结合伴侣连接到AFM探针上。我们利用细菌粘附素SdrG及其目标标签15-氨基酸Fgβ（NEEGFFSARGHRPLD）在拉伸过程中将ddFLN4连接到力探针上。SdrG通过“对接锁定”机制与Fgβ结合，形成非常强的捕获键，能够承受高达2 nN的力[10]。这种断裂力超过了ddFLN4的约45皮牛的展开力。该捕获键在低力下的可逆性意味着每个功能化的悬臂梁可以进行数千次展开试验。在展开的FEC（Force-Extension Curve）中可以很容易地区分SdrG-Fgβ的断裂，进一步证明了正确的附着。虽然本研究中使用了SdrG-Fgβ系统，但也可以使用其他粘附素标签对，例如从蛋白质C末端进行拉伸的ClfB-DK系统[10]。我们的新功能化策略使用相同的标签，但不是通过SPM，而是将APS沉积在乙醇溶液中的表面或探针上（见图2B）。由于其笼状结构，APS在其氮原子和硅原子之间具有强出的分子内供体-受体相互作用，因此比三乙氧基硅烷更不易水解[31, 32]。氮原子上的孤对电子还增加了其与连接的氧分子的亲和力，从而比其他硅烷衍生物具有更强的吸引力[39]。提出的一种反应机制表明，硅键合的氧会使表面醇脱质子化。由此产生的带负电荷的表面氧化物随后攻击硅原子，引发一系列类似的反应，直到硅与三个相邻的表面氧原子结合，并消除三乙醇胺[31]。更详细的反应机理见方案S1。附着在表面的伯胺可以与NHS-PEG-马来酰亚胺分子的NHS-酯端反应，从而去除NHS并形成胺与酯的羰基之间的键。由于PEG连接到表面，另一端的马来酰亚胺可以像在SPM化学中一样与生物分子的末端半胱氨酸结合。这种方法也可以推广到使用其他官能团的NHS-PEG分子，例如点击化学反应试剂。我们将这两种化学方法应用于ddFLN4蛋白质结构域的SMFS展开实验，该结构域具有研究充分且易于识别的两步展开模式（见图2C[10, 37]）。无论是SPM还是APS基的功能化策略，都将SdrG连接到AFM探针，并将Fgβ标记的ddFLN4连接到玻璃基底上。对于SPM化学，我们观察到的成功率为42%（95%置信区间：27-61%；n=28个AFM探针），而APS化学的成功率显著更高，为88%（95%置信区间：69-96%；n=24个探针）（见图3A[40]）。我们还测试了在蛋白质浓度约为10 μM时，每种功能化方法在长时间实验中产生大量单分子附着的能力。发现SPM化学的平均单分子附着率为1.9%±0.8%，APS化学的平均单分子附着率为4.8%±0.4%（每个探针的成功率平均值±标准误差；n=4个SPM探针，n=6个APS探针）。这些结果是从总共3,263次（SPM）和9,130次（APS）的拉伸实验中计算得出的。在这一过程中，我们确实观察到APS化学中的多次附着现象显著增加。一个示例性的APS功能化悬臂梁在1,712次尝试中出现了224次总附着，其中92次是单分子附着，132次是同时附着到多个分子上。这表明通过调整表面浓度，还有进一步提高单分子（相对于多分子）附着率的空间。

3.1 基于乙醇的Silatrane沉积提高了功能化成功率

基于硅烷的功能化策略虽然有时有效，但由于硅烷的不稳定性可能会受到影响。硅烷容易交联，形成粘性的聚合物层，从而导致大多数力-位移曲线无法解读。我们发现这种交联可能非常严重，以至于在悬臂梁上形成可见的聚合物层（见图1A）。因此，我们采用了Andersson等人[20]提出的新功能化策略，使用乙醇中的Silatranes而不是硅烷进行沉积。通过将其与现有的蛋白质SMFS测量中的功能化策略进行比较，来评估这种新方法的成功率。我们之前的功能化策略是将三乙氧基硅烷-PEG-马来酰亚胺（SPM）连接到经过紫外臭氧处理的玻璃表面或硅氮化物AFM探针上[19]。三乙氧基硅烷形成硅醇，这些硅醇容易与玻璃表面上的其他硅醇（或溶液中的其他硅醇）反应；马来酰亚胺通过与目标标记生物分子末端半胱氨酸上的巯基发生迈克尔加成反应。SPM同样用于将标记的半胱氨酸结合伴侣连接到AFM探针上。我们利用细菌粘附素SdrG及其目标标签15-氨基酸Fgβ（NEEGFFSARGHRPLD）在拉伸过程中将ddFLN4连接到力探针上。SdrG通过“对接锁定”机制与Fgβ结合，形成非常强的捕获键，可以承受高达2 nN的力[10]。这种断裂力超过了ddFLN4的约45皮牛的展开力。由于捕获键在低力下的可逆性，每个功能化的悬臂梁可以进行数千次展开试验。在展开的FEC中可以很容易地区分SdrG-Fgβ的断裂，进一步证明了正确的附着。虽然本研究中使用了SdrG-Fgβ系统，但也可以使用其他粘附素标签对，例如从蛋白质C末端进行拉伸的ClfB-DK系统[10]。我们的新功能化策略使用相同的标签，但不是通过SPM，而是将APS沉积在乙醇溶液中的表面或探针上（见图2B）。由于其笼状结构，APS在其氮原子和硅原子之间具有强出的分子内供体-受体相互作用，因此比三乙氧基硅烷更不易水解[31, 32]。氮原子上的孤对电子还增加了与其结合的氧原子的质子亲和力，从而与其他硅烷衍生物相比，使其对硅醇表面的吸引力更强[39]。提出的反应机理表明，硅键合的氧会使表面醇脱质子化。随后产生的带负电荷的表面氧化物攻击硅原子，引发一系列类似的反应，直到硅与三个相邻的表面氧原子结合并消除三乙醇胺[31]。方案S1中展示了更详细的反应机理。附着在表面的伯胺可以与NHS-PEG-马来酰亚胺分子的NHS-酯端反应，从而去除NHS并在胺和酯的羰基之间形成键。由于PEG连接到表面，另一端的马来酰亚胺可以像在SPM化学中一样与生物分子的末端半胱氨酸结合。这种方法也可以推广到使用NHS-PEG分子和其他官能团的情况，例如点击化学反应试剂。我们将这两种化学方法应用于ddFLN4蛋白质结构域的SMFS展开实验，该蛋白质结构域具有研究充分且易于识别的两步展开模式（见图2C[10, 37]）。无论是SPM还是APS基的功能化策略，都用于将SdrG连接到AFM探针，并将Fgβ标记的ddFLN4连接到玻璃基底上。对于SPM化学，我们观察到的成功率为42%（95%置信区间：27-61%；n=28个AFM探针），而APS化学的成功率显著更高，为88%（95%置信区间：69-96%；n=24个探针）（见图3A[40]）。我们还测试了在蛋白质浓度约为10 μM时，每种功能化方法产生大量单分子附着的能力。发现SPM化学的平均单分子附着率为1.9%±0.8%，APS化学的平均单分子附着率为4.8%±0.4%（每个探针的成功率平均值±标准误差；n=4个SPM探针，n=6个APS探针）。这些结果是从总共3,263次（SPM）和9,130次（APS）的拉伸实验中计算得出的。在这个过程中，我们确实观察到APS化学中的多次附着现象显著增加。一个示例性的APS功能化悬臂梁在1,712次尝试中出现了224次总附着，其中92次是单分子附着，132次是同时附着到多个分子上。这表明通过调整表面浓度，还有进一步提高单分子（相对于多分子）附着率的潜力。为了评估沉积的蛋白质浓度与单分子附着频率之间的关系，我们使用同一批功能化的三个探针在不同蛋白质浓度（1.16、11.6和116 μM）下进行了实验。每个探针进行了大约800次拉伸尝试。如表1所示，单分子和多次附着事件都随着浓度的增加而增加；然而，当浓度超过某个阈值时，单分子事件的比例发生了明显变化。在1.16 μM和11.6 μM时，大约60%的总附着事件是一次附着一个分子。相比之下，在116 μM时，只有6.2%的相互作用是一次附着一个分子。在该浓度下，大多数相互作用是无法解读的多分子附着。这表明存在一个阈值浓度，在此浓度以上，可以在保持最佳单分子附着比例的同时增加总附着事件的数量。鉴于基于乙醇的氨基丙基硅烷（APS）沉积能够产生均匀的表面涂层，控制沉积蛋白质的表面密度对于减少多重附着并提高单分子产率可能至关重要。

3.2 改性悬臂的功能化
扫描力显微镜（SMFS）数据的质量已被证明与AFM悬臂的机械性能密切相关[41-43]。通过使用聚焦离子束（FIB）铣削和化学蚀刻技术，可以物理改造小型、低阻力的悬臂，从而降低其弹簧常数，减少力噪声和力漂移，同时保持快速的响应时间。这使得能够进行高精度测量，捕获之前未被发现的蛋白质中间体[44]。由于这些改性悬臂的弹簧常数较低，我们预计它们在功能化过程中特别容易受损，尤其是在通过空气-液体界面时。实际上，我们发现必须对方法中描述的改性步骤进行一些调整，以防止对柔软的改性悬臂造成不可逆的损伤。特别地，我们发现使用温和的氮气流干燥悬臂比用无尘布擦拭更为重要。我们发现，用布擦拭时产生的毛细管流体动力学力通常会导致悬臂发生不可逆的弯曲。我们还发现，在75°C的培养皿中对悬臂进行干燥这一步骤是必要的。支持方法1展示了这些步骤是如何整合到功能化工作流程中的。相比之下，未经改性的悬臂在干燥或固化步骤中均未出现弯曲现象。如果没有这些步骤，改性悬臂会不可逆地偏离水平方向，从而无法正确反射AFM检测激光。然而，通过这些步骤，我们成功地功能化了多个根据先前报道的程序[45]改性的Olympus AC40-TS悬臂。我们观察到，在两次功能化和清洁周期后，改性悬臂的关键机械性能（如弹簧常数、共振频率和品质因数）没有明显下降（见图S2）。

3.3 悬臂的清洁与再功能化
未经改性的悬臂在未使用时仅能保持几周到一个月的最佳性能，而在使用过程中只能进行有限次数的拉伸[19]。因此，需要一种可靠的清洁改性悬臂的方法以便后续再功能化。过去曾使用反应离子刻蚀机去除悬臂上的PEG涂层；然而，此类设备成本较高，且通常需要在洁净室等专业设施中使用[46]。Vig的研究表明，通过短暂冲洗后暴露于UV臭氧，可以清除玻璃、云母、石英和金属等各种表面的有机物质[47]。UV-臭氧清洁的原理是有机污染物在紫外线作用下被激发，分解成离子和自由基。当O2暴露在紫外线下时，还会生成原子氧和臭氧；这些物质随后与激发的有机分子和离子反应，形成CO2、N2和H2O等挥发性物质[47]。我们证明了这种UV-臭氧清洁方法，通过在其中加入中间冲洗步骤等改进措施，能够有效去除故意沉积的有机层，并使AFM悬臂成功再功能化[47]。首先，我们用水冲洗已经功能化的悬臂，然后依次用甲苯、异丙醇和水冲洗。接着将它们置于UV-臭氧清洁器中处理30分钟。然而，在这些条件下，再功能化的效果并不一致。由于之前的UV-臭氧清洁表面研究没有考虑密集的硅烷层，我们假设某些有机残留物可能在初始的UV-臭氧步骤中只能部分氧化或蒸发。因此，我们在相同的溶剂中引入了第二次冲洗步骤，然后再置于UV-臭氧清洁器中处理30分钟。我们用来验证成功再功能化的测试与之前评估APS成功率的测试相同。我们再次研究了经过至少一次功能化处理的悬臂，在再功能化前应用我们的UV-臭氧处理后，能够至少实现一次单分子附着到ddFLN4上的百分比（见图3A）。这一成功率与高再功能化率一致，表明这种清洁过程适合延长SMFS实验中悬臂的使用寿命。在7个成功再功能化的悬臂中，有86%在最初的20-100次拉伸尝试中至少实现了一次成功的单分子附着，表明在整个功能化循环中数据质量稳定。

3.4 接触角测量
为了表征我们化学物质的表面特性，我们使用DSA 20E测角仪进行了接触角测量。我们对（1）使用KOH处理（但未进行功能化）的玻璃表面以及（2）沉积了APS和PEG的功能化表面进行了测试。对于用KOH处理的表面，我们观察到的平均接触角为10.81° ± 0.08°（平均接触角均值 ± 标准差；n = 3个表面），这表明表面具有很强的亲水性。而功能化表面的接触角无法测量，因为它们远低于仪器的大约10°的检测限。这表明表面亲水性进一步增加，超过了裸露玻璃表面的程度。这种亲水性的提高与先前的研究结果一致[48-51]。值得注意的是，我们的表面甚至比文献中报道的表面更具亲水性。尽管测试方法不完全相同，但表面性质的显著变化与我们的表面具有高PEG覆盖率是一致的。

4 结论
在这里，我们展示了基于乙醇的氨基丙基硅烷功能化显著提高了SMFS实验的性能，优于之前使用硅烷化合物的方法。APS沉积更为可靠，同时整个功能化过程仅需大约4小时。这种功能化方法以一种通用的方式解决了硅烷的不稳定性问题，适用于至少所有硅氮化物和玻璃悬臂及表面，包括那些经过优化以获得高质量SMFS数据机械特性的改性悬臂。当它与细菌粘附素耦合策略结合使用时，这种方法尤其多功能：在没有力的情况下可以实现高附着力，快速脱离率，并且当基因编码到目标蛋白质中时，还能实现高标记效率[10, 11]。由于APS的成本与SPM化学试剂相当，且APS合成是一个简单的单锅反应，可以使用最标准的本科有机化学教学实验室设备完成，并且APS在水溶液中4°C下可以长时间保持稳定，因此这是一种易于在任何研究实验室实施的方案。潜在用户不应因需要合成APS试剂而感到犹豫。我们还建立了一种简单、经济高效的方法来清洁APS改性的悬臂，从而允许重复功能化和延长悬臂的使用寿命。通过仅使用常见溶剂和台式UV-臭氧清洁器，这种方法可以在大多数实验室中轻松实施。更多支持信息可在线查阅支持信息部分。

致谢
作者感谢Byoungmoo Kim教授的实验室在合成3-(氨基丙基)硅烷方面的帮助，以及Thomas Perkins教授的实验室提供的ddFLN4和SdrG质粒。作者还感谢Clemson大学生物材料工程与测试（BET）核心设施以及Guzeliya Korneva博士在提供测角仪方面的帮助。FIB改性的悬臂是在Clemson大学研究部的电子显微镜设施中制备的。这项工作得到了美国国家卫生研究院（NIH）R00GM140439号奖励和美国国家科学基金会（NSF）MCB-2439881号奖励的支持。X.O.还得到了NSF REU项目DBI-2349368的支持。