利用互补方波伏安法和LC-MS/MS分析技术对两种体内骨骼肌疾病小鼠模型中的DNA变异进行评估

《ChemBioChem》：Assessment of DNA Variations From Two In Vivo Skeletal Muscle Disorder Mouse Models Using Complementary Square-Wave Voltammetry and LC-MS/MS Analysis

　　摘要

杜兴氏肌肉营养不良（DMD）和埃勒斯-丹洛斯综合征（EDS）的特点是由于DNA损伤导致的遗传不稳定，进而引发肌肉功能丧失。为了探究这些疾病的遗传影响，我们从X染色体连锁肌肉营养不良的小鼠模型（mdx，DMD模型）或杂合col5a1（+/-）小鼠（EDS模型）的选定肌肉组织中提取了DNA。我们使用互补方波伏安法（SWV）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）来分析提取的DNA。在Ru(bpy)32+存在的情况下，通过将DNA层层固定在热解石墨（PG）电极上进行氧化处理来进行SWV分析。在约+1.05 V处的SWV峰电流（Ip）变化表明，与野生型（WT）对照相比，遗传改变的小鼠组织中存在显著的DNA变化。mdx和杂合col5a1（+/-）样本的Ip水平显著降低（p < 0.05），这表明由于遗传改变，鸟嘌呤含量发生了变化，尤其是在腿部肌肉DNA中这种变化更为显著。MS/MS结果验证并进一步扩展了SWV的发现。DNA碱基分析显示，mdx小鼠的DNA氧化损伤增加，同时未受损碱基含量也发生了变化。col5a1（+/-）腿部肌肉的DNA未受损碱基含量也表现出显著变化。

图解摘要

互补方波伏安法（SWV）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）用于分析从mdx或col5a1（+/-）小鼠模型中提取的DNA。SWV的氧化电流随处理而变化，允许进行快速的遗传分析。LC-MS/MS验证了SWV的结果，并提供了更深入的碱基含量分析。碱基含量的变化与潜在的疾病病理学是一致的。

1 引言

杜兴氏肌肉营养不良（DMD）和埃勒斯-丹洛斯综合征（EDS）是两种不同的遗传性疾病，其特征是骨骼肌功能异常，表现为细胞生理和结缔组织异常[1, 2]。DMD与骨骼肌和心肌功能的逐渐减弱和丧失有关，这是由于丧失了抗肌营养不良蛋白[1, 3]。抗肌营养不良蛋白糖蛋白复合物在机械应力下保护肌膜；然而，在DMD中其缺失会引发细胞危机，可能干扰DNA修复过程，从而导致进一步的基因突变[1, 4]。EDS是一系列疾病，通常表现为组织脆弱性和异常愈合，这是由于不同胶原基因组合的突变所致[2, 5, 6]。支持胶原蛋白生成的基因，如COL5a1，参与了I型异型纤维的形成[7]。抗肌营养不良蛋白的表达丧失或胶原纤维的形成不规则都与遗传不稳定有关[8, 9]，这意味着这些蛋白质的不规则性促进了恶性转变和进一步的基因缺陷[3]。因此，研究这些疾病的遗传基础对于阐明疾病进展的机制至关重要。此外，了解基因突变与由此产生的细胞和组织水平异常之间的相互作用对于开发针对性疗法至关重要。DNA分析和损伤测序方法通常需要通过PCR扩增或短读长序列测序，这可能会妨碍DNA损伤的定量[10, 11]。PCR是最常见的技术，因为它简单可靠[10, 12-14]，但可能会引入扩增偏差[15]。短读长序列测序在处理嵌合DNA或具有结构变异的DNA时存在偏差[14]。此外，短读长序列测序通常仅限于500个碱基对，使得人类基因组中的大部分大结构变异无法检测[14]。长读长序列测序可以读取5,000至30,000个碱基对[16]，尽管历史上与之相关的准确性限制已大部分被克服，但仍存在挑战[16]。特别是，长读长序列测序需要高浓度、高质量、高分子量的DNA输入，这可能难以获得，从而限制了其广泛应用[17-19]。这些技术在分析DNA损伤和不同类型的DNA时常常遇到困难。例如，PCR由于线粒体DNA（mtDNA）的独特特性（如高突变率、异质性和大量多态性）而难以正确测序[20]。这与许多基因编辑小鼠模型（如DMD）中显示的高突变率一致[21, 22]。基于传感器的DNA分析[23-25]，尤其是电化学DNA传感器[26]，为分析受损DNA提供了一些解决方案。电化学传感方法已被用于评估复杂生物样本中受损的代谢物或其他氧化损伤的碱基，主要是鸟嘌呤[26-31]。电化学方法对于分析难以处理的DNA底物和检测可能被扩增技术遗漏或扭曲的低丰度损伤特别有价值[26, 32, 33]。基于传感器的方法可以提供DNA损伤的空间分布信息和实时分析能力，使其适用于传统实验室环境之外的应用[25, 34-36]。许多这些方法利用基于质谱的技术来验证和量化受损碱基[34, 37, 38]。能够直接检测和量化特定类型的DNA损伤而无需扩增，是一种补充测序方法的方法，提供了快速、基于结构的信息，并提高了损伤量化的准确性和灵敏度[34, 37]。我们最近报告了一种互补方波伏安法-串联质谱分析方法，该方法能够在不需要DNA扩增的情况下直接量化氧化损伤和其他修饰的DNA碱基，如氧化损伤的碱基[39, 40]。这种互补分析方法为评估生物来源的DNA提供了强大的工具，有助于深入了解疾病进展[39, 41]。这种方法有效地阐明了BRCA1敲除（KO）小鼠与野生型（WT）小鼠在mtDNA和核DNA（nDNA）方面的差异，并表明该基因对DNA修复过程至关重要[39]。mtDNA的多态性对传统测序方法提出了挑战[20, 42]，但该测定方法用于检测突变和氧化损伤的增加，这与传统遗传测定和观察到的表型结果一致。采用类似的方法，分析了特定的DMD和EDS小鼠模型的总DNA，以更全面地理解这些疾病的遗传机制。小鼠模型研究已被广泛用于探索DMD[43-45]和EDS[46-48]模型的多种基因校正和靶向策略，以及进一步的遗传和生理特异性研究。从这些小鼠中获得的DNA首先在层层改性的石墨电极（LbL）上通过SWV进行分析[49, 50]。在钌催化剂的存在下对这种DNA进行电化学氧化，产生的电流输出提供了关于碱基（主要是鸟嘌呤）含量的信息[39, 51, 52]。通过SWV快速评估DNA变化后，使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析进行验证，以识别微妙的碱基组成变化。这些DNA碱基变化，包括受损碱基的识别，可能使用传统方法被忽略[53, 54]。同时比较两种不同疾病模型提供了独特的机会，以识别导致这些疾病遗传不稳定的共同和独特途径。

2 实验

2.1 材料

Tris缓冲液来自Fluka，聚二烯二甲基氯化铵（PDDA）、聚（4-苯磺酸钠）（PSS）和三（2,2'-联吡啶）二氯钌（Ru(bpy)32+）、甲酸、氯化铁（II）、过氧化氢、乙腈、甲醇（HPLC级）以及DNA碱基标准品均来自Sigma。纯化的18 MΩ cm^-1去离子水来自西门子高纯度水系统。所有用于电化学实验的其他化学试剂均来自Sigma，为试剂级。

2.2 DNA分离和制备

EDS小鼠模型是通过Col5a1基因的半缺乏产生的，如Wenstrup等人所描述[9]。简而言之，使用的是V型胶原蛋白proa(V)链的半缺乏小鼠模型，这导致所有组织中的V型胶原蛋白减少50%（由Louis D. S提供）。EDS模型在col5a1(+/+)和col5a1(+/-)品系中维持，后者是经典的EDS模型[9]。在这些实验中，从10至12周大的雄性和雌性col5a1(+/+)（n = 3，WT）和col5a1(+/-)（n = 3，Het）同窝小鼠中提取骨骼肌组织。在生理学测定方面，此处描述的EDS小鼠没有观察到基于性别的显著差异（数据未显示）。肌肉样本来自三个不同的肌肉群：趾伸肌（EDL）、比索尔肌（SOL）和膈肌（DIA）。我们使用mdx和年龄匹配的对照小鼠作为代表DMD的小鼠模型。mdx小鼠缺乏抗肌营养不良蛋白，这是抗肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物的关键组成部分[8]。从10-12周大的C57BL/10ScSnJ（BLK/10，n = 3）和C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J（mdx，n = 3）小鼠的腓肠肌中提取DNA，这些小鼠来自Jackson实验室（Bar Harbor，ME）。小鼠被饲养在温度（22°C）和光照（12/12小时光照/黑暗）受控的环境中，并可以自由获取食物和水。所有动物程序和使用均获得了东卡罗来纳大学机构审查委员会和NRC制定的动物护理指南的批准[55]。使用QIAamp Fast DNA Tissue Kit（Qiagen，目录号51 404）从骨骼肌中分离总DNA。使用Nanodrop（Thermo）分光光度计对所有小鼠模型的DNA进行了定量。

2.3 电极制备

热解石墨（PG，麦克马斯特-卡尔（Elmhurst，IL）来源）电极（直径4 mm）是内部制造的，并在800目SiC（Buehler）纸上研磨，然后在去离子水（DI H2O）中冲洗和超声处理。在Ar下干燥后，电极依次暴露于以下溶液：PDDA（60 μL滴液，6 mg mL^-1在DI H2O中，含50 mM NaCl）15分钟，然后是PSS（6 mg mL^-1在DI H2O中，含50 mM NaCl）15分钟。这些步骤重复三次。接下来三轮使用DNA（0.050 mg mL^-1在10 mM Tris，10 mM NaCl，pH 7.4）代替PSS，应用30分钟。每次层之间用去离子水冲洗电极。最终的改性电极膜结构为（PDDA/PSS）2(PDDA/DNA)2。

2.4 电化学测量

所有电化学测量都是使用CH Instruments（奥斯汀，TX）Model 660A电位计进行的。改性的电极被放置在一个标准的三电极电化学池中（铂对照电极，饱和汞（饱和KCl）参比电极，在10 mL缓冲液（10 mM tris，10 mM NaCl，pH 7.4）中，含有50 μM Ru(bpy)32+）。使用以下参数获得方波伏安图（SWVs）：扫描范围从0到+1.3 V，频率15 Hz，步长4 mV，幅度25 mV。

2.5 LC-MS DNA制备

DNA样本（col5a1(+/-)：0.50 mg mL^-1，mdx：1.00 mg mL^-1）用等体积的44%甲酸稀释，然后在1 mL真空水解管中加热1小时。然后将溶液转移到Amicon Ultra-0.5 mL 3K过滤管中，并以30,000 x g离心40分钟。滤液随后转移到含有10 μL插管的LC小瓶中。

2.6 LC-MS/MS分析

使用配备Gemini 3 μm NX-C18 110 ? LC柱（50 x 2 mm）的SciEx 3200三重四极杆LC-MS/MS。开发了六种MS/MS检测方法，使用正离子MRM模式对两个表征产物离子进行检测，如表S1所总结。初步分析集中在鸟嘌呤监测上，使用了之前使用的LC协议：溶剂A：95:5 DI H2O（0.1%甲酸）和乙腈；溶剂B：甲醇。梯度洗脱在100% A 0-3分钟，然后逐渐增加到75% A 3-5分钟。总分析时间为5分钟。流速为0.200 mL min^-1，注射量为1.00 μL。后来，开发了一种等渗LC检测方法来监测所有四种未受损的碱基，使用0.1%甲酸和70:25:5 H2O:MeOH:ACN。总分析时间为30分钟，流速为0.200 mL min^-1，注射量为1.00 μL。额外的LC溶剂包括：溶剂A：0.1%甲酸，95:5 DI H2O和乙腈；溶剂B：60:20:20 ACN:异丙醇:H2O；溶剂C：甲醇。对于两种受损碱基，梯度洗脱分别为：8-oxoG，8-oxoG：50:50:5 A:B:C 0-1分钟，然后A减少5%，C增加5%，持续3分钟；FapyA，100% B 0-2分钟，然后逐渐增加到20% C 2分钟，再回到100% B 5分钟。FapyA的总分析时间为5分钟，8-oxoG的总分析时间为6分钟。流速为0.300 mL min^-1，注射量均为1.00 μL。

2.7 数据分析

使用Excel for MAC 2019版本16.24和SCIEX MultiQuant软件版本3.0，通过未配对t检验（Welch校正）对每个突变组与对照组进行了统计分析。原始MS和SWV数据使用OriginPro 9软件进行分析。对于SWV图表，使用不含DNA的（PDDA/PSS）2电极的相同SWV电化学响应进行了背景减除。图形使用Adobe Illustrator CS6进行了修改。

3 结果

3.1 电化学分析

图1显示了在Ru(bpy)32+存在下，薄层LbL DNA薄膜氧化时的典型基线调整SWV响应。根据以下文献[51, 52]，使用过渡金属催化剂显著提高了这种检测方法的灵敏度，相比于通过电催化循环直接氧化碱基。

（a）代表性SWV图，比较了WT（黑色）或mdx KO样本（红色）的DNA响应。（b）在+1.1 V时的平均Ip，比较WT和KO。误差条表示n=3的标准差。*表示统计学上的显著差异（p < 0.05）。 Ruthenium催化剂的氧化电位与鸟嘌呤的氧化电位重叠（Eo’ ～ 1.05V vs. SCE）[51, 52]；因此，在这些类型的分析中获得的信号已被证明高度依赖于鸟嘌呤[51]。实际上，在可溶性[51]或基于聚合物的ruthenium催化剂存在下，腺嘌呤薄膜的电催化几乎不存在[56]。对从腿部肌肉提取的mdx DNA进行的电化学氧化显示，KO样本在氧化过程中产生的电流明显低于WT样本。图1展示了遗传KO处理和WT对照之间的标准响应。这里，SWV比较的是KO mdx（红色）和WT BLK/10（黑色）。图1b显示，在约+1.1 V时的平均峰电流减少了25.49 ± 0.40%（p < 0.05），表明mdx中的鸟嘌呤含量减少[39]。这表明mdx的缺陷是导致这些DNA变化的原因。转向EDS模型，图2比较了从WT和杂合col5a1(+/-)小鼠不同肌肉位置提取的DNA。这些肌肉是根据它们的不同功能和表型选择的，SOL是一种慢速氧化肌肉，EDL是一种快速糖酵解的伸展肌肉，而DIA是一种主要负责呼吸的肌肉，具有混合的代谢和收缩表型。图2显示，基线Ip不仅取决于肌肉类型，因为在所有电极上固定了相同浓度的DNA，而且从腿部肌肉提取的DNA的电流减少比DIA更明显。这种峰电流的减少与KO组织中鸟嘌呤含量的减少一致[39]。这反映了mdx样本中的情况（图1）。SOL和EDL肌肉的电流分别减少了36.07±0.88%和26.72±0.75%，平均减少了约30%（p < 0.05）。相比之下，从DIA组织提取的DNA的电化学分析显示，Het与WT样本相比，峰电流的减少要小得多，减少了13.87±0.14%的Ip。这些数据表明，腿部肌肉中的DNA受到消除的Col5a1等位基因的影响更大。腿部肌肉样本中较低的基线WT电流表明，这些组织中的鸟嘌呤含量受到肌肉功能的影响。值得注意的是，只有DIA的平均Ip差异（Het vs WT）在统计学上是显著的（p < 0.05）。当结合趋势平均值时，SOL和EDL的Ip差异也是显著的（p < 0.05），但在单独基础上并不显著。需要注意的是，肌肉提取的差异基于DMD和EDS的疾病病理学差异。并非所有表现出DMD表型的小鼠在组织采集时都会在这些三个肌肉位置表现出病理学特征，因此对这些样本进行了腓肠肌的检测。

3.2 基串联质谱分析

为了提供基于传感器的分析验证，并阐明在比较WT和处理DNA时Ip变化的遗传基础，我们使用了MS/MS进行更深入的碱基分析。DNA暴露于酸水解后，通过过滤，对水解样品进行定量和鉴定产品离子分析，使用校准的MS/MS程序。在我们之前的报告中，我们依赖于监测鸟嘌呤和8-oxoguanine（8-oxoG）来验证电化学响应[39]。为了进一步探索mdx和col5a1(+/)小鼠中观察到的电化学趋势背后的具体DNA变化，我们扩展了质谱碱基分析，包括了所有典型碱基以及氧化产物8-oxoG（对于所有样本）和4,6-二氨基-5-甲酰胺嘧啶（fapyadenine，FapyA）（对于mdx样本）。由于灵敏度限制和Ru(bpy)32+/鸟嘌呤电氧化电位的重叠，基于传感器的方法最适合提供基于鸟嘌呤的分析，但氧化损伤和腺嘌呤损伤在遗传疾病中的重要性越来越受到认可。在体细胞基因组中测序腺嘌呤损伤的准确性仍然不足[10-13, 57-62]。MS/MS分析可以弥补这些限制。FapyA的检测可以为DNA样本中的氧化损伤程度提供有价值的见解，并且由于产生的独特质量片段，使用我们的协议可以更容易地检测到它。我们的MS/MS方法和FapyA的片段分析在支持信息中进行了总结（表S1，图S1）。图3显示了用于鸟嘌呤分析的LC-MS/MS色谱图以及剩余碱基和氧化产物的百分比变化总结图，比较了BLK/10 WT和mdx处理。图3中的LC-MS/MS色谱图显示了来自mdx样本的剩余碱基的LC-MS/MS色谱图。

图4a-b显示了从DIA（蓝色）、EDL（黑色）和SOL（红色）检测到的鸟嘌呤（152 → 135）的LC-MS/MS色谱图。实线是WT，虚线是Het col5a1(+/-)。（b）百分比比较显示了mdx KO与WT样本中指定碱基含量的差异。色谱图显示了例如在比较WT BLK/10与mdx分析时，鸟嘌呤的定量离子过渡峰面积减少。其他碱基也以相同的方式被检测和分析，以生成图3b中的百分比比较图。该图显示了mdx KO样本中水解后指定碱基的百分比变化，与BLK/10 WT对应样本相比。该图显示，鸟嘌呤的百分比减少与SWV数据一致，因为电化学测定高度依赖于鸟嘌呤含量。图4a-b显示了从col5a1(+/-)样本分析的三种不同组织的类似分析。尽管有这些限制，碱基分析仍然揭示了在SWV氧化过程中产生电流变化的遗传变化。除了鸟嘌呤之外，该图还阐明了由于小鼠的基因改变而在不同肌肉组织中发生的碱基变化类型。mdx模型显示鸟嘌呤和胞嘧啶含量减少，同时腺嘌呤和胸腺嘧啶含量增加，8-oxoG和FapyA氧化损伤也增加。在这些样本中，FapyA水平增加了8.7±1.1%（p < 0.05）。这种G:C到A:T碱基对的明显转变与由于初始氧化损伤的错误修复而导致的潜在点突变一致。这与在慢性高氧化环境下，由于dystrophin糖蛋白复合物功能障碍或胶原蛋白组装中断导致的修复机制不堪重负的情况一致[63-67]。随着氧化损伤碱基水平的增加，这些损伤在DNA复制期间被误解的可能性也增加了。例如，8-oxoG可以与腺嘌呤而不是胞嘧啶配对，导致G:C到T:A的转换突变[68]。同样，FapyA的存在可能会破坏正常的碱基配对，可能导致A:T到G:C的转换突变[69]。在Het col5a1(+/-)小鼠中，DIA DNA显示出最小的碱基组成差异与WT相比。SOL和EDL腿部肌肉的DNA显示出更严重的碱基组成变化，与其WT对应样本相比。与SWV分析一致，这表明腿部肌肉受到Col5a1突变的影响更大。具体来说，这里的结果显示所有检查的肌肉类型的鸟嘌呤和胞嘧啶都一致减少，尽管DIA样本中的变化较小，这些样本也是三个样本中唯一显示出8-oxoG略微增加的样本。总体而言，结果表明，与呼吸肌肉相比，DIA可能没有受到同样显著的损伤。然而，在监测的EDS模型腿部肌肉中，鸟嘌呤和胞嘧啶的显著减少与8-oxoG的近似相等减少相关。这与突变率与损伤积累率不同一致，这意味着可能是修复机制不堪重负，或者除了氧化损伤之外的其他因素，如DNA修复机制的缺陷或细胞环境的变化，可能是col5a1(+/-)腿部肌肉组织中突变的主要驱动因素。

4 讨论

已经使用了多种小鼠模型来研究这些肌肉疾病并研究可能的治疗靶点[2-4, 8, 9]。mdx小鼠品系已被广泛用作DMD的同基因模型[1, 3]。DMD基因负责编码dystrophin，这是一种对维持骨骼肌肌膜稳定性和功能至关重要的蛋白质[21, 67]。mdx小鼠通过DMD基因的突变再现了DMD病理学特征的dystrophin缺乏，该基因编码对肌膜完整性至关重要的dystrophin蛋白[15]。之前的小鼠转基因模型强调了collagen V在人类EDS中的作用[7, 9]，并强调了COL5a1基因的重要性，该基因负责编码type V胶原上的α1链。在突变形式中，胶原纤维的形成受到干扰[2]。从mdx KO小鼠中提取的DNA显示出显著的氧化损伤，如图3所示，鸟嘌呤水平降低，8-oxoG水平增加。col5a1(+/-)小鼠显示出明显的鸟嘌呤和胞嘧啶含量降低，同时8-oxoG氧化损伤也减少。碱基含量的减少与这些组织中的突变一致[39, 41]。在mdx样本中，这伴随着8-oxoG的增加，表明这里捕获的腿部组织暴露在氧化损伤条件下，导致鸟嘌呤受损，随后鸟嘌呤丢失。鸟嘌呤的减少伴随着腺嘌呤/胸腺嘧啶的增加，表明发生了转换突变[68]。从mdx和col5a1(+/-)小鼠的腿部肌肉中提取的DNA受到更严重的影响。col5a1(+/-)腿部肌肉的鸟嘌呤含量降低，但8-oxoG水平也降低。随着检测到的腺嘌呤水平的增加，这仍然与氧化损伤导致这些样本中的突变一致，尽管氧化损伤的发生速率或过程不同，这是由于氧化损伤碱基含量的减少。结合电化学SWV分析，这表明小鼠的遗传改变导致这些特定组织中DNA突变负荷显著增加，这与DMD和EDS的表型一致。氧化损伤通过产生复杂的损伤和大规模的基因缺失导致基因组不稳定性增加[15]。在DMD的病理条件下，氧化损伤导致广泛的不稳定性[70]。dystrophin缺乏与持续的膜损伤和细胞坏死有关，从而产生氧化环境，导致DNA损伤[67]。活性氧直接修饰DNA碱基，其中腺嘌呤和鸟嘌呤最容易被氧化[57, 59, 71]。由此产生的复杂损伤使修复机制不堪重负，通过容易出错的途径错误地重新连接，导致点突变或缺失[10, 12, 13, 62]。我们之前已经证明，8-oxoG的变化伴随着鸟嘌呤突变，但此前我们并没有评估腺嘌呤的损伤情况。腺嘌呤损伤的量化可以填补在评估氧化损伤负荷及其导致的基因型变化方面的关键空白[14, 72, 73]。虽然鸟嘌呤的氧化损伤已经得到了充分的研究，但腺嘌呤损伤的重要性也日益受到关注，尤其是在那些具有类似肌肉萎缩症特征的氧化应激相关的神经病理学研究中[57]。然而，由于扩增偏差和特异性问题，对体细胞基因组中腺嘌呤损伤进行精确测序仍然存在困难[11, 12, 57-61]。常见的测序方法常常因为8-oxoA与天然碱基相似而无法检测到它，从而导致假阴性结果。结构相似的氧化嘌呤，如8-oxoA和FapyA，在高氧化环境下容易积累，但却难以被识别[74-78]。不过，质谱技术可以提供更好的分离能力和对腺嘌呤损伤的敏感检测[76]。在这里，mdx DNA中FapyA的增加表明，这种肌肉组织的氧化损伤过程比单纯的鸟嘌呤氧化损伤后发生突变要复杂得多。这与大多数主要关注“鸟嘌呤模型”病变的氧化损伤评估方法不同[76]；然而，需要进一步分析才能完全理解这种腺嘌呤损伤途径的遗传学影响。在EDS模型中，大约58%的COL5a1基因突变被发现在患有该疾病的患者中[5]。与经典或血管性EDS相关的表型经常表现出COL5a1的致病性变异，这通常是这些病型的相关基因[2, 79]。这些重叠的表型与潜在的胶原蛋白缺陷一致，因为致病的COL5a1变异会干扰胶原纤维的组装和交联，从而降低功能性胶原蛋白含量，进而改变细胞外基质结构和组织的抗拉强度[3, 6, 7]。COL5a1在细胞外基质形成和骨骼肌功能中起着重要作用，它构成了影响肌肉被动僵度和关节灵活性的细胞外骨骼肌基质的一部分[2]。对澳大利亚足球运动员的遗传分析显示，COL5a1中的一个单核苷酸多态性与肌肉损伤的严重程度和功能有很强的相关性[80]。我们的研究结果强调了COL5a1基因的变异对这些肌肉组织的整体基因组成有明显影响，这可能反过来影响肌肉损伤的严重程度和功能[2, 79]，并且与导致EDS发病机制的COL5a1变异相符。这里使用的电化学方法提供了一种简便的方式来快速初步评估DNA损伤和组成变化。较低的氧化电位使得鸟嘌呤成为全球DNA变化的主要标志物[30, 31, 51, 71, 81]。氧化电位与Ru(bpy)32+的重叠使得电化学分析对鸟嘌呤含量非常敏感，而鸟嘌呤的含量可能会因氧化或突变为其他碱基而波动。尽管其他过渡金属催化剂也可能用于探测8-oxoG[82]，但使用Ru(bpy)32+来探测DNA已被证明是一种直接、快速且经济有效的方法，可以区分野生型和突变型DNA样本[39-41, 83]。与本报告类似，我们之前也使用LC-MS/MS作为验证技术，证明了电化学输出主要与分析样本中的鸟嘌呤含量或8-oxoG相关[39]。这项工作的一个主要目标是将DNA碱基监测从鸟嘌呤和8-oxoG扩展到更多碱基，以更全面地验证可能导致SWV结果的累积损伤和突变负荷的假设。由于大多数DNA损伤测序方法需要DNA扩增，这可能会阻碍DNA损伤水平的量化[11]，而结合电化学和质谱的方法可以通过检测8-oxoG和FapyA等氧化损伤来克服这一限制，从而提供一种比传统测序方法更有效的替代方案，后者可能存在扩增偏差和对基因组结构变化的评估有限的问题[39, 84, 85]。这种分析方法的多样性使其能够识别传统方法可能无法检测到的微小损伤。因此，采用这种分析平台来分析DMD和EDS模型中的DNA不稳定性（这两种疾病都具有显著的氧化遗传特征[65-67]），可以更清晰地揭示氧化应激的模式、由此产生的DNA损伤以及组织退化的机制因素之间的联系。

5 结论

这里介绍的SWV和MS/MS分析互补方法为探究生物学来源的DNA提供了强大的概念验证工具，阐明了DMD和EDS这两种骨骼肌肉遗传疾病的遗传基础。这种快速电化学评估方法克服了传统测序方法的局限性，能够通过电化学检测DNA变异，并利用质谱分析直接量化碱基变化和氧化损伤。我们的结果突显了这些组织中的氧化损伤及其在DMD和可能的EDS中驱动基因组不稳定性的作用。通过比较氧化损伤的分布和碱基组成的变化，我们得以深入了解这些疾病的 verschillende 应激刺激和致病机制。这种互补方法结合了基因型和表型数据，提供了基因突变、细胞功能障碍以及组织水平异常之间复杂相互作用的更完整图景。未来的研究将致力于进一步完善这项技术，并将其应用于更大的动物模型和患者样本群体，以增强该方法的统计功效，并验证其在临床应用和个人化医疗方法中的潜力。

补充信息

更多支持信息可以在“支持信息”部分找到。

致谢

本研究得到了NSF REU 1851844（EGH, SB, ELR）和NIH R33 AR078100（EES）的支持。

资助

本工作得到了国家科学基金会（1851844）和国家卫生研究院（R33 AR078100）的资助。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究发现的数据可以在本文的补充材料中找到。