《European Journal of Immunology》：Mapping of Neutrophils in Cancers: Insights From Spatial Omics Technologies
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肿瘤中性粒细胞表现出显著的表型可塑性，并在肿瘤生物学中发挥双重作用，涵盖促肿瘤和抗肿瘤活性。单细胞RNA测序（scRNA?seq）能够在单细胞分辨率下对肿瘤中性粒细胞进行转录组分析，而空间转录组学（ST）通过保留完整组织内细胞的空间背景，解决了scRNA?se
肿瘤中性粒细胞表现出显著的表型可塑性，并在肿瘤生物学中发挥双重作用，涵盖促肿瘤和抗肿瘤活性。单细胞RNA测序（scRNA?seq）能够在单细胞分辨率下对肿瘤中性粒细胞进行转录组分析，而空间转录组学（ST）通过保留完整组织内细胞的空间背景，解决了scRNA?seq的关键局限性，从而最大限度地减少细胞丢失并保持天然组织结构。随着ST技术的持续进步，它为肿瘤微环境（TME）中肿瘤中性粒细胞的调控机制提供了日益全面的洞见。本综述首先总结了ST的最新技术进步。随后讨论了跨多种癌症类型的中性粒细胞检测，强调了不同研究和恶性肿瘤在中性粒细胞研究中的关键差异与挑战。此外，概述了优化肿瘤中性粒细胞研究的测序策略和样本处理建议。最后强调，整合ST与多组学方法为推进肿瘤中性粒细胞生物学理解及识别用于靶向治疗的更精确生物标志物提供了一条极具前景的途径。
1 引言
作为外周血中最丰富的先天免疫细胞，中性粒细胞不仅在宿主防御感染中扮演核心角色，也在塑造肿瘤微环境（TME）方面发挥关键作用。中性粒细胞的转录和功能状态存在于一个连续谱系中，受发育成熟度、组织微环境、分子编程及功能特化等因素影响，这些因素最终由特定的组织背景和疾病状态所决定。当中性粒细胞通过恶性细胞产生的趋化因子梯度被募集到肿瘤部位时，会经历功能性重编程，转变为具有显著表型异质性的肿瘤中性粒细胞。新出现的证据表明，肿瘤中性粒细胞同时发挥抗肿瘤和促肿瘤活性，使其成为肿瘤免疫治疗中极具潜力的靶点。
过去十年间，单细胞RNA测序（scRNA?seq）通过实现超越批量测序群体水平平均值的单细胞分辨率转录组分析，彻底改变了癌症免疫学。单细胞转录组分析促进了肿瘤中性粒细胞的系统性表征，显著推动了癌症免疫学领域的发展。它使得研究人员能够深入洞察TME内中性粒细胞的异质性。然而，scRNA?seq固有的局限性在于破坏了空间组织结构，且主要捕获活细胞，可能排除在组织解离过程中丢失的细胞群。此外，实验操作可能无意中刺激细胞并激活应激反应通路，潜在地损害数据准确性。至关重要的是，中性粒细胞具有独特的脆弱性，且其mRNA含量和基因多样性显著低于其他免疫细胞，这可能降低scRNA?seq分析的准确性和深度。
为了克服这些局限性，空间转录组学（ST）作为一种变革性技术应运而生，它在保留细胞定位的同时绘制基因表达图谱。该方法最近被公认为该领域的突破性进展。通过保留空间信息，ST提供了关于TME的组织结构、多样性和异质性以及其细胞组分间复杂相互作用的宝贵洞见。本综述系统总结了ST在肿瘤中性粒细胞研究中的应用，旨在增强对肿瘤中性粒细胞空间分布的理解，并指导未来ST技术的发展。
2 空间转录组学的进展：类型与原理
2024年标志着ST的一个重要里程碑，迎来了这项快速发展的技术的新时代。值得注意的是，各种平台都实现了空间分辨率的显著提升。例如，10x Genomics推出的Visium HD将分辨率从55?μm（Visium）提升至2?μm。其他值得关注的2024年发布产品，包括BGI Stereo?seq?1.3、10x Xenium和NanoString CosMx?6K，也达到了亚细胞分辨率。2025年，10x Genomics进一步扩展了ST产品线，推出Visium HD?3'，实现了跨越人类和小鼠之外的所有真核生物的转录组分析。
多重抗错荧光原位杂交（MERFISH?2.0）也取得了技术飞跃。通过实施改进的RNA锚定策略、优化的编码探针结合和增强的读出探针设计，最新版本的MERFISH显著提高了检测灵敏度，特别是在RNA可能部分降解的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中。这种“单分子”灵敏度对于解析中性粒细胞特有的低丰度转录本至关重要，这些转录本通常被基于捕获的方法遗漏。
当前的空间转录组技术主要分为两类：基于测序的和基于成像的技术。基于测序的平台包括BGI Stereo?seq和10x Visium HD，而基于成像的平台则由NanoString CosMx、10x Xenium和Vizgen MERFISH为代表，它们利用荧光探针直接对基因表达进行空间成像。NanoString提供两种能够同时检测RNA和蛋白的空间转录组平台：GeoMx数字空间分析仪（DSP）可对多细胞区域、特定细胞亚群或定义的组织结构进行全转录组或数百种蛋白的空间分析；相比之下，CosMx空间分子成像仪（SMI）允许在亚细胞分辨率下原位检测数千个RNA靶点和多达64种蛋白。
每个平台根据实验背景呈现出独特的优势和局限性。例如，虽然基于测序的方法提供无偏的全转录组发现，但基于成像的平台如MERFISH和Xenium提供更优越的信噪比和亚细胞精度，这对于表征TME中脆弱且低RNA含量的中性粒细胞群体不可或缺。因此，根据实验目标和样本特征选择合适的ST平台对于研究的成功至关重要。
3 肿瘤微环境中中性粒细胞空间转录组学：超越细胞异质性
虽然scRNA?seq已将中性粒细胞分类为不同的转录状态，但它本质上缺乏定义这些状态的环境驱动因素所需空间背景。新兴的空间组学证据表明，肿瘤中性粒细胞并非随机分布，而是被组织成由特定微解剖生态位塑造的功能性“空间程序”。
3.1 空间受限的代谢生态位
ST在识别驱动中性粒细胞重编程的代谢生态位方面发挥了关键作用。例如，在胰腺导管腺癌（PDAC）中，整合ST和基于MACSima的蛋白质组数据揭示了CD73hiGLUT1hi缺氧、糖酵解生态位的存在。在这些特定的空间域内，中性粒细胞经历确定性重编程，形成终末分化的dcTRAIL?R1+状态（T3中性粒细胞）。这种微环境驱动的代谢特化是scRNA?seq无法检测的，因为它缺乏将中性粒细胞与缺氧肿瘤核心或糖酵解区域联系起来的关键空间背景。
3.2 空间浸润模式作为预后决定因素
从广泛的免疫量化向空间分辨图谱的转变重新定义了研究人员对肿瘤中性粒细胞作为预后指标的理解。通过将ST应用于结直肠癌肝转移（CRLM），研究人员已超越简单的“细胞计数”，去解析中性粒细胞定位的功能意义。虽然历史上的临床模型（如Immunoscore）确立了T细胞密度在肿瘤核心和侵袭前沿的预后价值，但ST揭示了涉及髓系细胞的更复杂的空间层次。最近的空间转录组反卷积识别出不同的组织学亚组，其中中性粒细胞向侵袭前沿的空间募集是疾病进展的关键决定因素。ST揭示特定“细胞邻域”内中性粒细胞的协调浸润可以区分预后不同的组织学亚型，如替代型与促结缔组织增生型生长模式。这强调了ST独特的能力，即将中性粒细胞浸润的物理结构直接与临床生存结果联系起来，提供了传统组织学和scRNA?seq无法实现的空间精度。
3.3 近神经炎症程序
ST还发现了与神经侵犯（NI）相关的独特中性粒细胞群体。高NI组织的特征是NLRP3+巨噬细胞和癌相关肌成纤维细胞聚集在被侵犯的神经周围。在高NI胰腺癌组织中，发现一个特定的亚群（M11_Neutrophil?CXCL8）特异性聚集在受侵神经周围的近神经点。这些中性粒细胞表现出增强的炎症反应通路和白细胞趋化性，表明神经系统作为一个独特的空间生态位，通过局部信号主动募集并重塑中性粒细胞功能。
3.4 空间定义的细胞?细胞相互作用程序
除了识别孤立的生态位外，ST还提供了一个解码细胞间通讯“空间逻辑”的平台，这在scRNA?seq中常因组织解离过程中局部信号分子的稀释而丢失。一个显著的例子是治疗后的中性粒细胞空间重组。在接受微波热化疗（MTC）治疗的唇鳞状细胞癌（LSCC）中，ST能够精确定位治疗后景观中N1型和N2型肿瘤相关中性粒细胞（TANs）的位置。通过整合空间邻近性与配体?受体分析，研究人员确定了一个调控治疗反应的“成纤维细胞?中性粒细胞空间轴”。具体而言，癌症相关成纤维细胞（CAFs）被发现通过CXCL2–CXCR2轴主动将抗肿瘤N1中性粒细胞募集到肿瘤部位。同时，这些成纤维细胞通过CXCL12–CXCR4信号通路促进促肿瘤N2中性粒细胞的清除。这种中性粒细胞极化的空间协调——即成纤维细胞的物理邻近性决定了功能转换——凸显了ST在揭示局部结构如何驱动免疫介导的肿瘤清除方面的力量。
4 空间与单细胞转录组学中中性粒细胞分析的挑战与优化策略
4.1 中性粒细胞捕获实验流程的挑战与优化
尽管scRNA?seq和ST已在各种微环境中识别出肿瘤中性粒细胞，但检测效率仍然高度可变。虽然流式细胞术和组织学分析表明中性粒细胞约占非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤及癌旁正常组织白细胞的10%–20%，但在某些单细胞数据集中的比例低于6%。这种差异可能归因于中性粒细胞固有的特性，特别是其脆弱性和低RNA含量，这需要专门的实验和分析方法来精确分析中性粒细胞。
在处理阶段，通过最小化解离与PCR扩增之间的时间间隔来提高肿瘤中性粒细胞的捕获效率。为了减少机械应力，优选磁激活细胞分选（MACS）而非荧光激活细胞分选（FACS）来消除死细胞。这种快速处理与低剪切分离的结合对于维持肿瘤中性粒细胞数据的完整性至关重要。对于ST样本制备，连续切片允许进行中性粒细胞特异性免疫荧光（IF）染色，以优先考虑具有高肿瘤中性粒细胞浸润的区域。在使用靶向平台（如MERFISH、Xenium）时，基因组合必须包含高置信度的中性粒细胞谱系标记物（S100A8、S100A9和FCGR3B）以及功能指标（CXCL8、ARG1和MMP9）。鉴于肿瘤中性粒细胞RNA产量低，对经典标记物采用冗余探针可提高检测鲁棒性。最后，严格的RNA质量控制（如RIN和DV200）以及细胞类型特异性的分析QC指标对于严格的数据解释必不可少。
4.2 中性粒细胞的平台选择与分析策略
肿瘤中性粒细胞独特的生理学特征——极低的mRNA含量、高丰度的内源性RNase以及核分割伪影的倾向——对标准ST方案提出了重大挑战。因此，平台的选择必须针对这些特定限制而非一般性能指标进行调整。
从分析角度来看，需要调整以适应中性粒细胞固有的低RNA含量。例如，中性粒细胞唯一分子标识符（UMI）检测的最佳范围为100–6000，而其他细胞类型为500–6000。ST和scRNA?seq平台的选择也会影响结果。一项比较研究表明，BD Rhapsody平台捕获的每个细胞的mRNA分子数量显著更高，可能更适合表征转录本丰度低的细胞。当前能够检测中性粒细胞的主要空间转录组平台包括MERFISH、GeoMx?DSP、CosMx和Xenium。
基于成像的平台（如Xenium、CosMx和MERFISH）：这些平台提供单分子灵敏度和亚细胞分辨率，这对于检测中性粒细胞中稀疏的转录本至关重要。Xenium和CosMx等平台在FFPE样本中表现强劲，即使在转录活性低的细胞中也能有效解析单个RNA分子。它们依赖基于探针的杂交而非poly?A捕获，能够识别通常被基于捕获的方法遗漏的肿瘤中性粒细胞亚态。
基于捕获的平台（如Visium?HD、Stereo?seq）：虽然提供无偏的全转录组覆盖，但由于捕获效率有限，这些平台在中性粒细胞富集区域容易发生“脱落”（dropout）事件。然而，下一代高分辨率版本（利用亚微米分箱或纳米球阵列）越来越能够解析中性粒细胞簇。通过聚合来自相邻空间坐标的信号，只要严格保持初始组织的RNA完整性，这些方法可以恢复中性粒细胞的特征。
传统的细胞分割通常因中性粒细胞的多叶核而失败。建议使用基于深度学习的分割工具（如Cellpose或Mesmer），专门针对粒细胞形态进行微调，以避免ST数据集中的人工细胞碎片化。
4.3 肿瘤中性粒细胞的功能异质性与演变的分类框架
以前，肿瘤中性粒细胞的细分没有统一标准。大多数研究将肿瘤中性粒细胞分为两个主要功能亚型：抗肿瘤（N1）和促肿瘤（N2）。值得注意的是，N1在特定条件下可转化为N2，导致它们在肿瘤中共存。最新研究通过整合成熟度、转录状态、功能和组织适应等多个生物学维度，提出了一个四层框架，为中性粒细胞分类提供了全面且灵活的方法。促肿瘤中性粒细胞的浸润与患者不良预后相关，可通过ST可视化其浸润模式。阻断特定的促肿瘤亚群（如CXCR2+）可增强肿瘤治疗敏感性。相反，抗肿瘤中性粒细胞是潜在的治疗靶点，研究旨在提升其抗肿瘤功能，且早期中性粒细胞浸润已被证实有助于抗肿瘤过程。然而，N1/N2分类过于简化。深入研究，特别是跨器官和跨肿瘤的scRNA?seq，采用了更精细的分类。例如，KP1.9荷瘤小鼠中的肿瘤中性粒细胞根据转录组学被分为三个簇和七种功能状态，每种状态反映了不同的免疫治疗反应。
聚类方法显然取决于研究目标，突显了对普遍认可的分类系统的需求。肿瘤中性粒细胞在癌症间既表现出保守性又表现出特异性。Ng等人验证了胰腺癌来源的T3中性粒细胞亚群在多种肺癌模型中的存在，表明跨肿瘤类型的保守肿瘤中性粒细胞重编程，其中T3作为终末分化亚型。对17种癌症的肿瘤中性粒细胞分析显示，存在异质性保守功能程序以及癌症特异性的亚型分布和功能偏向，50个空间转录组数据集显示了跨肿瘤的不同浸润深度。
这些发现强调了中性粒细胞检测的技术挑战和细分的解析挑战，迫切需要优化和规范空间与单细胞转录组学中的分析策略及分析流程。解决这些挑战不仅将提高中性粒细胞表征的准确性，还将加速临床相关生物标志物和发现治疗靶点。
5 空间转录组学与多组学技术联合应用的未来展望
目前，虽然ST正在迅速扩展，但中性粒细胞空间数据集的稀缺性和标准化的缺乏阻碍了跨研究的可比性。尽管SpatialDB等数据库正在整合这些数据，但跨平台整合常常受到源于捕获效率、探针化学和组织处理差异的巨大批次效应的阻碍。解决这些技术差异对于确保数据可重复性至关重要。
以往的ST通常需要与scRNA?seq数据整合，并进行算法优化，以准确解析细胞的空间分布和细胞间的相互作用。在现有平台中，Xenium、MERFISH?2.0和CosMx?6K提供最高的分辨率，实现了亚细胞的探针定位；然而，由于其问世不久，广泛应用仍然受限。未来的进步，如将原位测序与膨胀显微镜相结合，旨在进一步提高转录本定位至纳米级的分辨率。此外，随着ST技术的进步和实验成本的降低，高分辨率3D?ST可能成为下一个前沿领域，揭示2D分析中无法检测到的空间连续结构。
与多组学技术的深度融合代表了推进空间生物学的关键方向。将ST与质谱流式细胞术（CyTOF）耦合，能够同时进行转录组和蛋白质组分析，提供更全面的细胞功能视图。空间蛋白质组学平台如MACSima和CODEX——尽管基于不同的检测原理——可以有效与ST结合，实现基因表达和蛋白质功能的空间共定位。这种整合不仅验证了mRNA与蛋白水平的对应关系，还揭示了由翻译后修饰引起的差异，为识别精确的治疗生物标志物提供了新途径。代谢组学的整合也具有巨大潜力。虽然基于基因表达的代谢评分可以推断代谢重编程，但它无法捕捉代谢物的空间分布。纳入原位代谢组学能够同时绘制转录组和小分子代谢物图谱，促进对“转录调控–代谢物积累–细胞功能”轴的深入理解。最后，将ST与表观基因组学整合可以阐明空间细胞异质性的表观遗传机制，有助于理解细胞命运决定和复杂组织的调控结构。
总之，肿瘤中性粒细胞已成为肿瘤进展的关键参与者，其表型异质性和双重功能角色使其成为免疫治疗的重要靶点。ST通过克服scRNA?seq的局限性，彻底改变了研究人员对肿瘤中性粒细胞的理解。随着技术进步以及与多组学的整合，这将推动肿瘤调控和治疗开发领域的变革性发现。
