基于模拟明胶基质的筛选和应用，利用LC-MS/MS技术对明胶肽进行绝对定量分析

《Results in Chemistry》：Absolute quantification of gelatin peptides using LC-MS/MS based on simulated gelatinous matrix screening and application

　　黄小正|青瑞子|孙玉清|魏圆青|刘瑞|韩淑英|滕宇豪
南京中医药大学附属医院，南京210023，中国

**摘要**
在复杂基质中利用LC-MS/MS对肽进行准确绝对定量时，常常受到显著的基质效应的干扰，尤其是在食品中明胶肽的定量测定时。本研究通过基于物理化学相似性筛选模拟基质，开发了一种减少LC-MS/MS测定明胶肽时基质干扰的策略。将鹿角明胶用八种蛋白酶水解并进行全面表征。多变量分析（PCA和HCA）确定Compound蛋白酶水解物与胰蛋白酶处理后的基质最为相似，且干扰最小，因此选择其用于方法开发。该方法对五种特征肽的测试显示出优异的线性（12.5–500 ng/mL，r2 > 0.998），检测限（LOQ）为0.12–5.20 ng/mL，精密度RSD为4.45–12.44%，准确率为79.5–116.9%。该方法成功应用于鹿科动物鹿角明胶中肽的定量，为提高食品质量控制的可靠性提供了一种实用方法。

**1. 引言**
动物胶原蛋白广泛应用于食品添加剂、化妆品和药品辅料。从猪、牛、驴、龟壳、鹿角和海洋鱼类等来源提取的明胶都是安全高质量的食物添加剂和化妆品原料[1][2][3]。在各种明胶中，鹿角明胶具有重要的药用价值，是传统医学中的重要成分，具有抗氧化特性、促进骨骼分化和矿化、促进血液循环和止血效果[4][5]。鹿角每年自然脱落，这些脱落的鹿角也可以在野外收集。对于驯养的经济动物如梅花鹿（Cervus nippon）和红鹿（Cervus elaphus），它们的鹿角是明胶的重要来源。作为食品工业中的重要原料，明胶的鉴定和质量控制受到了广泛关注[6][7][8][9]。其中，基于蛋白质谱分析的特征肽检测越来越多地被用于鉴定明胶来源并确保质量控制。包括我们的研究小组在内的多项研究已经从不同动物来源的明胶中鉴定出一系列特征肽，这些肽可以用来区分来自鹿、牛、猪、龟等的明胶[6][7][10][11]。通过分析这些特征肽的相对峰面积比，可以检测出假冒明胶的掺假率。之前建立的特征肽检测方法为明胶的质量控制提供了有效策略。

我们在之前的研究中发现了一系列来自鹿的肽，例如Pep-4（是鹿科动物的特征肽），Pep-G1、Pep-G2、Pep-G3（是区分鹿角和皮革的特征肽），Pep-R（在鹿角和皮革中的含量相似[12]）。这些特征肽的相对含量测定技术已经非常成熟，然而，在明胶样品中测定其绝对含量对质量控制是一个重大挑战。影响绝对定量准确性的主要问题是基质效应[13][14]。在之前的研究[15]中，有报道称某些明胶肽在明胶基质中表现出“响应增强效应”，使得这些肽的检测限降低了近一个数量级。这种“基质增强效应”可能归因于明胶肽混合物中高含量的氨基酸残基，如Gly、Ala和Val。这些氨基酸的-COOH和-NH3+基团可以释放质子化肽，抵消甲酸引起的离子抑制效应，显著增强肽的质谱响应[16][17]。鉴于肽酶水解的复杂性，获取不含分析物的空白基质以消除基质效应是不可行的。因此，之前建立的方法无法准确测定样品中肽的真实含量。我们小组之前合成了同位素标记的肽作为内部标准物，从而能够准确评估“响应增强效应”，实现肽的绝对定量[15]。然而，这种策略仅限于结构相似的少数肽或具有相似“响应增强效应”的肽，无法同时准确测定多种肽。此外，合成同位素肽的高成本使其不适合作为通用方法广泛应用。

为了解决明胶中特征肽绝对定量时基质效应带来的关键瓶颈，本研究提出了一种基于物理化学模拟的候选基质筛选策略。首先选择胰蛋白酶水解明胶得到的基质作为标准。然后，通过使用专门设计的酶消化方法，构建了包含多种蛋白酶的候选基质库，同时排除目标特征肽的潜在干扰。接下来，采用多尺度物理化学表征系统（包括亲水-疏水平衡、粒径-ζ电位分布、特征官能团红外指纹图谱和表面疏水微区）来定量评估基质相似性，从而精确选择仿生基质。这种创新策略利用酶促途径调控获得本质上无干扰的空白基质，有效解决了肽定量中的背景扣除问题。该方法不仅为胶原蛋白肽分析提供了多种解决方案，还建立了将绝对定量方法扩展到其他功能性蛋白质和肽配方的范例。

**2. 材料与方法**
2.1. **材料**
胰蛋白酶（测序级）购自Promega（1.68 × 10^7 U/g，美国威斯康星州菲奇堡）。木瓜蛋白酶（8 × 10^5 U/g）和碱性蛋白酶（2 × 10^5 U/g）购自北京Solarbio科技有限公司（中国北京）。Flavourzyme（2 × 10^4 U/g）、弹性蛋白酶（3 × 10^4 U/g）、酸性蛋白酶（5 × 10^4 U/g）和Compound蛋白酶（1.2 × 10^5 U/g）购自上海源业生物科技有限公司（中国上海）。胃蛋白酶（3 × 10^3 U/g）购自BioFroxx有限公司（德国）。8-氨基-1-萘磺酸（ANS）购自上海麦克林生化科技有限公司（中国上海）。二硫苏糖醇（DTT）购自亿菲雪生物科技有限公司（中国南京）。邻苯二甲醛（OPA）购自上海阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。甲酸和丙腈购自默克KGaA（德国达姆施塔特）。

五种肽Pep-4、Pep-G1、Pep-G2、Pep-G3和Pep-R由GenScript公司（中国南京）化学合成，具体信息见表1。鹿科动物鹿角样品包括梅花鹿（Cervus nippon）、红鹿（Cervus elaphus）、欧亚麋鹿（Alces alces）、斑马鹿（Rusa unicolor）、白尾鹿（Odocoileus virginianus）、驯鹿（Rangifer tarandus）、黇鹿（Dama dama）和埃尔德鹿（Rucervus eldii），均来自中国安徽省亳州市的传统中药市场。

**表1. 正确模式下肽的MS/MS参数**
| 肽 | 序列 | MRM 1 | DPCE | MRM 2 | DPCE |
|---|------|------|------|------|
| Pep-4 | GYH | HypG | PDG | TAG | AHypG |
| | PGQ | GPV | GPT | K | 765.5 | > | 55 | 4.47 | 0.15 | 29.13 |
| | GP | QGP | VPG | K | 765.5 | > | 69 | 2.27 | 4.96 |
| | 32.49 | 31.02 | 28.11 | 15.41 | 62.49 |
| Pep-G1 | GND | GAT | GA | AGP | HypG |
| | PG | GPAG | PHypG | HP | 850.4 | > | 51 | 5.41 | 32.87 | 15.44 |
| | 62.49 | 31.02 | 850.4 | > | 65 | 6.21 | 15.41 |
| Pep-G2 | GSD | GSV | GPV | GPAG | PIG | HypG |
| | HP | GFH | HypGA | HP | 864.0 | > | 53 | 5.41 | 66.57 | 33.95 |
| | 864.0 | > | 56 | 39 | 15.46 | 12.11 |
| Pep-G3 | GSD | GSV | GPV | GPAG | PIG | HypG |
| | HP | GFH | HypGA | HP | 858.7 | > | 52 | 7.41 | 60.35 | 35.65 |
| | 858.7 | > | 55 | 58 | 15.67 | 12.16 |
| Pep-R | GND | GAT | GA | AGP | HypG |
| | PG | GPAG | PHypG | HP | GFPGA | HypG |
| | PK | 845.0 | > | 50 | 7.31 | 62.52 | 31.51 | 84 |
| | 50 | > | 53 | 5.91 | 40.94 | 28.16 |

2.2. **模拟基质的制备**
鹿角明胶在实验室自制。简而言之，将25.0 g鹿角粉与200 mL水（水/样品比8:1）混合，并回流提取8小时。重复此提取过程三次。合并提取物在减压条件下浓缩并冷冻干燥，得到鹿角明胶冻干粉。

根据我们之前研究的方法稍作修改，将200 mg鹿角明胶冻干粉转移到50 mL锥形瓶中，在40 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中超声处理2分钟。然后将溶液稀释至最终体积50 mL。使用比色酸（BCA）法测定所得鹿角明胶溶液的蛋白质浓度。从该溶液中取出8份样品，分别加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、Flavourzyme、弹性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶或胃蛋白酶进行酶解。每种酶的用量为6000 U/g。将每份样品的pH值和温度调整到表S1中指定每种蛋白酶的最佳条件。在水浴中酶解12小时后，煮沸10分钟终止反应。水解产物随后冷冻干燥并储存在-20°C直至进一步分析。

2.3. **模拟基质的物理化学性质测定**
2.3.1. **水解度（DH）**
模拟基质样品的水解度（DH）根据Nielsen [18]的方法测定。DH值使用以下公式计算：
Serine?NH2 = As ? Ab
Ast ? Ab × C
serine?NH2 × X × Ph = Serine?NH2 ? β

α = 0.796, β = 0.457, htot = 11.1 mmol/g（基于本研究使用的特定蛋白质底物和条件）
2.3.2. **SDS-PAGE**
SDS-PAGE使用不连续缓冲系统进行，分离胶为15%，堆积胶为3%，根据Wang [19]的方法稍作修改。将每个样品稀释至最终浓度1.25 mg/mL。随后，将80 μL稀释样品与20 μL SDS-PAGE loading buffer混合，在100°C加热5分钟，冷却至25°C。每条泳道加载10 μL样品。电泳最初在80 V下进行30分钟，然后在100 V下进行3小时。凝胶用Coomassie Brilliant Blue R-250染色1小时，随后过夜脱色。在凝胶上观察蛋白质条带。

2.3.3. **傅里叶变换红外光谱（FTIR）**
使用Thermo Nicolet iS5光谱仪（Thermo Fisher Scientific Ltd.，美国）进行FTIR光谱分析，以研究鹿角明胶（DAG）和各种酶解得到的模拟基质的二级结构[19]。简而言之，将DAG或模拟基质的样品（0.001 g）与溴化钾（KBr，0.1 g）混合，在红外灯下研磨成1 mm颗粒。在25°C下，在4000–400 cm^-1的波数范围内获取光谱数据。数据分析使用OMNIC软件进行。

2.3.4. **内在荧光光谱（IF）**
根据[19]的方法对DAG和每个模拟基质样品进行IF光谱分析。将样品稀释至0.03 mg/mL的蛋白质浓度，使用F-7000分光光度计（Hitachi，日本）在390 nm激发波长下获取荧光光谱。发射光谱记录在300–500 nm范围内。仪器参数设置为：激发和发射狭缝宽度均为10 nm，扫描速率为240 nm/min，光电倍增管（PMT）电压为400 V。

2.3.5. **表面疏水性（SH）**
使用8-氨基-1-萘磺酸（ANS）作为荧光探针，根据Li [20]的方法测定模拟基质的表面疏水性（SH）。将样品稀释至0.01–0.1 mg/mL的浓度。然后向每个稀释样品中加入40 μL 8 mM ANS溶液，涡旋15秒。在黑暗中孵育15分钟后，使用BioTek Synergy H1微孔板读数仪（BioTek Instruments Ltd., 美国）在390 nm和470 nm的激发和发射波长下测量ANS-蛋白质混合物（FIprotein+ANS）的荧光强度。同时，在相同条件下测量不含ANS的蛋白质溶液（FIprotein）的荧光强度作为空白值。校正后的荧光强度（FIc）使用以下公式计算：
FIc = FIprotein + ANS ? FIprotein

FIc与蛋白质浓度（X轴）作图，线性回归的斜率代表平均SH。

2.3.6. **ζ电位（ZP）、粒径分布（PSD）和多分散指数（PDI）**
根据Wang [19]的方法测定不同模拟基质的ZP、PSD和PDI。将每个样品稀释至0.3 mg/mL的浓度，使用Zetasizer Nano ZS90纳米粒径分析仪（Malvern Instruments Ltd., 英国）进行测量。

2.4. **Nano-LC-MS/MS分析**
每个样品使用Dionex Ultimate 3000 nanoLC系统与Q Exactive Plus四极杆-轨道阱质谱仪（Thermo Fisher Scientific，加利福尼亚州圣何塞）联用进行分析。每个模拟基质样品中的肽经脱盐、干燥后重新溶解在0.1%甲酸中，然后以400 nL/min的流速直接注入自制的反相毛细管柱（75 μm × 15 cm，孔径1.7 μm，孔径150 ?）进行分离。使用120分钟的线性梯度洗脱，从2%到30% B（0.1% FA在98%丙腈中）。

数据依赖性采集（DDA）在正离子模式下进行，循环一次完整的MS扫描和随后针对最丰富的20个前体离子的MS/MS扫描。MS/MS光谱使用碰撞诱导解离（CID）生成，归一化碰撞能量为30，分离窗口为2.0 Da。仅在前体离子的强度在MS调查扫描中超过1×10^4计数（扫描时间为30.0秒，具有动态排除功能）的情况下，才选择这些离子进行碎片化。电喷雾电压设定为2.0 kV。为了防止离子阱过载，启用了自动增益控制（AGC），目标值为积累MS/MS光谱的5×10^4个离子。MS扫描的m/z范围是350到1800。使用PEAKS Studio软件（版本8.5，Bioinformatics Solutions Inc.，加拿大滑铁卢）分析所得的MS/MS数据。串联质谱数据与自建的Cervidae胶原蛋白数据库（补充数据1）以及等长的诱饵序列进行了比对，以估计假发现率（FDR，阈值<1%）。对于用胰蛋白酶消化的样品，指定了胰蛋白酶作为酶；对于其他基质，则未选择任何酶，允许最多有两个切割机会丢失。指定了Pro的羟基化（+15.99）、Gln和Asn的脱酰胺（+0.98）作为可变修饰。所有其他参数均采用默认设置，包括fragment ion tolerance为0.02 Da和经过重新校准后的前体离子tolerance为10 ppm。

2.5. UPLC-MS/MS MRM条件
LC-MS/MS用于根据我们之前的工作[12]描述的方法对Pep-4、Pep-G1、Pep-G2、Pep-G3和Pep-R的分离、鉴定和定量。MRM分析使用Shimadzu Nexera UPLC LC-20A系统（Shimadzu，日本京都）进行，该系统配备了QTRAP 6500质谱仪（Applied Biosystems，美国福斯特城），采用电喷雾电离（ESI）源，处于正离子模式。色谱分离是在Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm × 50 mm，1.7 μm）上完成的。流动相由A（0.1% FA在H2O中）和B（0.1% FA在ACN中）组成。每个样品注射2 μL的体积，并使用0–5分钟的梯度洗脱（B比例为5%–25%）和5–6分钟的梯度洗脱（B比例为25%），流速为0.3 mL/min。质谱参数优化如下：离子源温度500°C；电离电压5500 V；脱溶剂温度500°C。选定前体（Q1）和产物离子（Q3）MRM跃迁的优化碰撞能量（CE）和去杂电位（DP）详见表1。数据采集、峰积分和定量计算使用Analyst软件（版本1.5.2，Sciex）进行。

2.6. 方法验证
将Pep-4、Pep-G1、Pep-G2、Pep-G3和Pep-R的标准曲线、检测限（LOD）和定量限（LOQ）加入到明胶样品中并进行了定量。通过绘制选定模拟基质中峰面积与相应浓度的关系图，确认了每个标准曲线的线性。定量限（LOQ）和检测限（LOD）是根据信噪比（S/N）分别为3:1和10:1的稀释标准溶液确定的。

2.7. 方法准确性和重复性
将五种特征肽（Pep-4、Pep-G1、Pep-G2、Pep-G3和Pep-R）以最终浓度200 ng/mL加入选定基质中。精确度通过日内和日间相对标准偏差（RSD）来评估，这是根据模拟基质中肽的峰面积比确定的。日内精确度通过单日内的六次重复分析来评估，而日间精确度则通过连续三天重复实验两次来评估。方法重复性表示为从六个独立准备的重复样品中获得的肽含量的RSD（%）。方法准确性通过将已知量的标准肽Pep-4、Pep-G1、Pep-G2、Pep-G3和Pep-R加入模拟基质中，并在三个浓度水平（360 ng/mL、720 ng/mL、1080 ng/mL）下来确定，表示为平均回收率百分比。回收率（%）的计算公式为：回收率（%）=（观察到的量 - 原始量）/ 添加的量 × 100%。

2.8. 在实际样品中的应用
将100 mg冻干明胶样品准确称重到50 ml锥形烧瓶中。加入40 ml PBS后，样品超声处理2分钟并稀释至50 ml。将所得溶液的1 ml体积稀释至5 ml，然后加入1%（w/w）胰蛋白酶。在37°C下进行12小时的酶解，酶解产物通过0.22 μm膜过滤后进行LC-MS/MS分析。使用MRM方法量化的肽标记物（Pep-4、Pep-G1、Pep-G2、Pep-G3和Pep-R）。浓度是根据预先建立的校准曲线（表S2）确定的。

2.9. 统计分析
所有统计分析均使用GraphPad Prism 9.5（美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行。主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）图使用R（http://www.R-project.org/）生成。每个实验的重复次数在相应的图例中注明。应用方差分析（ANOVAs）进行多组比较。显著性描述如下：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

3. 结果和讨论
3.1. 鹿角明胶的DH
图1A显示了用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、Flavourzyme、弹性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、复合蛋白酶和胃蛋白酶处理的鹿角明胶的DH程度。12小时后，弹性蛋白酶（14.47 ± 0.98%）、酸性蛋白酶（19.92 ± 1.22%）和胃蛋白酶（17.91 ± 1.13%）的DH值与消化前水平没有显著差异（p > 0.05）。相比之下，其他蛋白酶在0到2小时内迅速增加DH，然后在2到12小时内逐渐增加后趋于稳定。Flavourzyme处理的基质具有最高的DH值，为55.09 ± 3.05%，其次是复合蛋白酶，为45.50 ± 2.84%。胰蛋白酶水解的样品DH达到31.35 ± 3.14%，而木瓜蛋白酶（30.03 ± 0.58%）和碱性蛋白酶（27.74 ± 0.40%）在12小时时的水解效率与胰蛋白酶相当。

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图1. 用不同蛋白酶处理的鹿角明胶的DH（n = 3，A）、SDS-PAGE（B）、FTIR（C，D）、IF（E）和SH（n = 3，F）。数据以平均值±标准差表示，P值使用单因素方差分析计算。***P < 0.001 vs. 改性胰蛋白酶组。

3.2. SDS-PAGE
SDS-PAGE分析显示了不同酶处理后明胶水解产物的不同分子量谱（图1B）。所有酶处理的样品中原始明胶条带都消失了，取而代之的是模糊的电泳图案。胃蛋白酶、酸性蛋白酶和弹性蛋白酶的水解产物显示出宽范围的条带，覆盖10–180 kDa，这与它们较低的水解程度（DH 14.47–19.92%）一致。相比之下，木瓜蛋白酶、Flavourzyme、碱性蛋白酶、复合蛋白酶和胰蛋白酶处理的产物主要产生低于25 kDa的片段，这与它们较高的水解效率（DH 27.74–55.09%）相符。值得注意的是，与其他高效酶相比，木瓜蛋白酶和Flavourzyme在10–15 kDa区域观察到更强的条带，表明存在残留的中等分子量肽，反映了不同的蛋白水解特异性。

3.3. FTIR
FTIR光谱提供了关于蛋白质内部二级结构的信息。酰胺A区域（3500–3000 cm^-1）通常与NH和OH伸缩振动相关，反映了肽骨架内的氢键，这对稳定蛋白质和肽的二级结构起着关键作用。如图1C所示，天然鹿角明胶及其酶水解产物在酰胺A区域都显示出宽的吸收带。然而，这些峰的强度在酶产物和天然鹿角提取物之间有所不同，表明这八种酶的水解改变了鹿角提取物蛋白质的二级结构。弹性蛋白酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶处理的样品的峰强度低于其他酶处理的样品。这一观察结果可能与这三种酶实现的DH程度较低有关，如图1A所示，表明氢键结构的破坏较少。

3.4. 内在荧光光谱
蛋白质的内在荧光（IF）指示了芳香族氨基酸的微环境极性，尤其是色氨酸残基的极性，并进一步反映了蛋白质的三级结构[21]。一般来说，大多数产生荧光的芳香族氨基酸都包含在蛋白质中。当蛋白质结构发生变化时，这些氨基酸的一些侧链基团会被暴露出来，从而改变这些氨基酸所在微环境的极性，导致蛋白质的最大发射波长在这个波长范围内发生红移。如图1E所示，鹿角提取物的最大发射波长为309.0 nm，而在酶水解后，鹿角明胶水解产物的相应发射波长范围为309.2至310.8 nm。这种仅0.2–1.8 nm的微小红移表明，酶水解后明胶中芳香族氨基酸周围的微环境极性基本保持不变。酶水解后的荧光强度变化表明了蛋白酶的不同效应（图1E）。木瓜蛋白酶、Flavourzyme、碱性蛋白酶和复合蛋白酶产生的水解产物中，强度有显著增加。这种增强可能归因于水解后酪氨酸和色氨酸残基之间的空间接近性增加了Forster共振能量转移（FRET）的效率。相反，酸性蛋白酶的水解导致荧光强度降低。这种抑制效应可能是由于酪氨酸和色氨酸残基之间的距离增加，或者是因为有抑制基团靠近色氨酸残基。弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶产生的水解产物具有相似的荧光强度，表明它们的荧光团空间排列相似，因此微环境也相似。

3.5. SH
SH（表面疏水性）是一个受空间结构和变性影响的蛋白质特性指标，它反映了疏水性氨基酸对溶剂环境的暴露程度。使用8-苯胺-1-萘磺酸（ANS）作为荧光探针进行量化，该探针在结合到蛋白质表面的疏水区域时表现出增强的发射。SH指数是根据荧光强度与蛋白质浓度的线性回归的初始斜率确定的[20]。如图1F所示，水解产物显示出广泛的SH值。弹性蛋白酶水解产物表现出最高的指数（7607.67 ± 1611.1），显著高于胰蛋白酶水解产物。相比之下，碱性蛋白酶水解产物的SH值最低。其他水解产物，包括复合蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的水解产物的表面疏水性相对相当。

3.6. ZP、PSD和PDI
ZP反映了分散介质中颗粒表面的平均净电荷，是胶体稳定性的关键指标。通常，较高的绝对ZP值表示颗粒之间的静电排斥力较强，从而有利于分散稳定性。如图2A所示，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、Flavourzyme、碱性蛋白酶、复合蛋白酶和胃蛋白酶产生的水解产物的ZP值范围为-5 ~ -10 mV。这些低的绝对值表明颗粒表面携带的负电荷密度较低，导致颗粒之间的排斥力弱，有聚集的趋势。

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图2. 用不同蛋白酶处理的鹿角明胶的ZP（n = 3，A）、PSD（n = 3，B，C）、PDI（n = 3，D）、物理化学性质的PCA（E）以及FTIR和荧光光谱的HCA（F）。数据以平均值±标准差表示，P值使用单因素方差分析计算。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001 vs. 改性胰蛋白酶组。
胃蛋白酶水解产物表现出最低的绝对ZP值（图2A），表明样品具有明显的聚集倾向和较差的胶体分散性。PSD分析（图2B，C）显示弹性蛋白酶水解产物中的颗粒主要分布在200–500 nm范围内，平均颗粒大小约为310 nm。相比之下，其他水解产物的颗粒大小主要在100至200 nm之间。还评估了PDI，它反映了颗粒分布的均匀性。如图2D所示，弹性蛋白酶水解产物的PDI最小，表明其分散稳定性相对较好，这可能归因于其相对较高的表面电荷、适中的分子量分布以及SDS-PAGE中观察到的较少的大聚集物。值得注意的是，除了弹性蛋白酶水解产物外，所有水解产物的PDI都超过0.6，表明颗粒大小分布广泛，分散状态不均匀。此外，在颗粒测量过程中，经常检测到大聚集物，这可能影响了所有样品的ZP、PSD和PDI的测定。纳米液相色谱-质谱/质谱（Nano-LC-MS/MS）分析
从蛋白质组学分析获得的肽识别结果显示，八种酶解产物之间存在显著差异，识别出的肽数量从1106个到3684个不等（补充数据2）。随后对这些肽的理化性质进行了分析，包括亲水性/疏水性和分子量分布。如图3A所示，使用平均疏水性（GRAVY）值来评估肽谱的整体亲水性/疏水性。所有水解产物中的大多数肽都表现出亲水性（GRAVY < 0）。值得注意的是，Compound蛋白酶水解产物的GRAVY值分布与胰蛋白酶水解产物的GRAVY值分布非常相似，表明这两种酶解产物具有相似的亲水性。

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图3. 不同蛋白酶处理后的鹿角明胶肽的性质（GRAVY、长度、分子量和强度）的提琴图（A–D）。

图3B、C和D显示了肽的长度、分子量和强度分布。在所有水解产物中，超过75%的肽的分子量低于2000 Da。这种低分子量肽的普遍存在与SDS-PAGE分析中未出现明显蛋白质条带的结果一致（图1B），证实了蛋白质的广泛降解。

最重要的是，蛋白质组学分析显示，在任何一种酶解产物中均未检测到Pep-4、Pep-G1、Pep-G2、Pep-G3和Pep-R这些肽的序列（补充数据2），这意味着在所选条件下这些肽在模拟基质中是无法检测到的。这对于确保后续定量实验中这些肽的准确性和可靠性是有利的。模拟基质中无干扰肽的存在对于最小化基质效应和验证定量方法至关重要。

3.8 基于模拟基质的方法验证
使用多变量分析对各种酶解产物的理化性质进行了系统的表征。基于SH、ZP、PSD和PDI参数的PCA分析表明，木瓜蛋白酶、Compound蛋白酶和胰蛋白酶水解产物的置信椭圆与修饰的胰蛋白酶衍生基质的部分重叠，表明它们的理化性质相似（图2E）。此外，傅里叶变换红外光谱（FTIR）和离子耦合质谱（IF）的异质性分析（HCA）显示，Compound蛋白酶水解产物与修饰的胰蛋白酶基质的聚类最为紧密，表明它们的光谱特征更为相似（图2F）。

尽管木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的水解产物在理化性质上也表现出一定程度的相似性，但它们的制备所需的温度和pH条件与胰蛋白酶基质显著不同。相比之下，Compound蛋白酶水解产物可以在更为相似和方便的条件下制备（表S1）。因此，选择了Compound蛋白酶水解产物作为后续方法开发和绝对肽定量验证的模拟基质。

因此，我们使用Compound蛋白酶衍生的模拟基质对鹿角明胶中的特征肽进行了精确的定量分析。用于定量的五个肽的MRM（多反应监测）转移信号总结在表1中，MRM色谱图显示在图4中。如表S2所示，特征肽（Pep-4、Pep-G1、Pep-G2、Pep-G3和Pep-R）的校准曲线构建在12.5至500 ng/mL的浓度范围内，并表现出优异的线性（r2 > 0.998）。定量限（LOQ）和检测限（LOD）分别为0.12–5.20 ng/mL和0.04–1.74 ng/mL。重复性（日内精度）以六个重复样品的峰面积RSD表示，范围为3.08%至8.61%；中间重复性（日间精度）通过在三天内进行六次重复实验得出，RSD范围为4.45%至12.44%；方法重复性以六个独立制备的样品副本的肽含量RSD表示，范围为7.38%至10.07%。精度数据令人满意，表明具有良好的日内和日间精度。通过三个添加水平下的回收率评估的准确性，所有五个肽的准确率范围为79.5%至116.9%（表S3）。

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图4. Pep-4、Pep-G1、Pep-G2、Pep-G3和Pep-R的代表性LC-MS/MS MRM色谱图

3.9 鹿科动物鹿角样品中特征肽的绝对定量
优化和验证的方法成功应用于同时定量不同鹿科动物鹿角明胶样本中的五个特征肽（Pep-4、Pep-G1、Pep-G2、Pep-G3和Pep-R）。如表2所总结的，每个样本中都检测并定量到了所有五个目标肽，且在不同样本中的浓度各不相同。

表2. 动物明胶中的肽含量及其相对含量（n = 3）

样品 含量（mg/g） 相对含量（Pep/Rep）
Pep-4 1.040 ±0.03 3.72
Pep-G1 2.776 ±0.06 1.45
Pep-G2 4.595 ±0.18 3.08
Pep-G3 0.881 ±0.00 0.93
Pep-R 0.430 ±0.03 2.96
Pep-4 0.430 ±0.03 4.90
Pep-G1 0.957 ±0.05 7.47
Pep-G2 0.673 ±0.05 1.21
Pep-G3 0.111 ±0.02 2.74
Pep-G3 0.264 ±0.02 5.70
Pep-R 0.114 ±0.02 1.06
Pep-4 0.979 ±0.03 0.67
Pep-G1 1.143 ±0.03 1.80
Pep-G2 0.673 ±0.05 4.38
Pep-G3 0.264 ±0.02 2.59
Pep-R 0.114 ±0.02 0.76
Pep-G4 0.054 ±0.02 1.74
Pep-G5 0.222 ±0.06 0.68
Pep-G1 0.979 ±0.03 0.15
Pep-G2 1.143 ±0.03 0.11
Pep-G3 1.297 ±0.02 0.76
Pep-R 0.114 ±0.02 0.80
Pep-G4 0.111 ±0.02 0.15
Pep-R 0.998 ±0.03 0.38
Pep-G1 1.003 ±0.02 0.76
Pep-G2 0.125 ±0.02 1.34
Pep-G3 0.694 ±0.03 1.09
Pep-R 0.913 ±0.04 0.15
Pep-G4 0.619 ±0.05 0.75
Pep-G2 0.159 ±0.01 0.11
Pep-G3 0.158 ±0.02 0.78
Pep-R 0.191 ±0.04 0.19
Pep-G4 0.047 ±0.03 0.26
Pep-G1 0.054 ±0.02 0.11
Pep-G3 0.114 ±0.05 0.51
Pep-R 0.018 ±0.01 0.44
Pep-G2 0.086 ±0.02 0.21
Pep-G3 0.137 ±0.02 0.35
Pep-R 0.153 ±0.02 0.19
Pep-G4 0.078 ±0.01 0.85
Pep-G1 0.065 ±0.03 0.38
Pep-G2 0.054 ±0.02 0.12
Pep-G3 0.114 ±0.02 0.05
Pep-R 0.158 ±0.02 0.19
Pep-G4 0.036 ±0.03 0.54
Pep-G1 0.091 ±0.02 0.12
Pep-R 0.100 ±0.03 0.76
Pep-G2 0.159 ±0.04 0.11
Pep-G3 0.106 ±0.05 0.15
Pep-R 0.097 ±0.02 0.22
Pep-G4 0.158 ±0.03 0.17
Pep-G1 0.028 ±0.06 0.11
Pep-G2 0.036 ±0.03 0.13
Pep-R 0.097 ±0.02 0.18
Pep-G3 0.114 ±0.02 0.11
Pep-R 0.191 ±0.04 0.07
Pep-G4 0.086 ±0.02 0.17
Pep-G2 0.147 ±0.05 0.15
Pep-G3 0.125 ±0.02 0.14
Pep-R 0.168 ±0.03 0.08
Pep-G4 0.047 ±0.03 0.15
Pep-G1 0.191 ±0.04 0.11
Pep-G2 0.054 ±0.02 0.15
Pep-G3 0.028 ±0.03 0.16
Pep-R 0.018 ±0.02 0.19
Pep-G4 0.036 ±0.02 0.18
Pep-G1 0.097 ±0.03 0.18
Pep-G2 0.159 ±0.02 0.12
Pep-G3 0.100 ±0.03 0.11
Pep-R 0.137 ±0.02 0.10
Pep-G4 0.154 ±0.01 0.15
Pep-G1 0.054 ±0.02 0.17
Pep-G2 0.036 ±0.02 0.15
Pep-R 0.065 ±0.02 0.18
Pep-G4 0.086 ±0.02 0.14
Pep-G2 0.137 ±0.02 0.12
Pep-R 0.097 ±0.03 0.15
Pep-G4 0.054 ±0.02 0.17
Pep-G1 0.028 ±0.03 0.15
Pep-G3 0.154 ±0.02 0.16
Pep-R 0.047 ±0.02 0.19
Pep-G4 0.036 ±0.03 0.15
Pep-G1 0.028 ±0.02 0.18
Pep-G2 0.114 ±0.03 0.11
Pep-R 0.054 ±0.02 0.15
Pep-G3 0.097 ±0.02 0.18
Pep-R 0.158 ±0.02 0.14
Pep-G4 0.065 ±0.03 0.17
Pep-G2 0.125 ±0.02 0.15
Pep-R 0.091 ±0.02 0.13
Pep-G3 0.036 ±0.03 0.12
Pep-R 0.114 ±0.02 0.11

如图5所示，基于五个肽的绝对定量和相对定量数据的PCA分析显示出明显的聚类模式，有效地将样品分为几个主要群组。绝对定量数据表明，Cervus nippon鹿角（CN-1至CN-5）形成了一个相对紧凑的群组，并且与其他鹿种的区分度更高。相比之下，Cervus elaphus鹿角（CE-1至CE-5）和其他物种的分布更为分散且重叠较多。具体来说，CE-2与Rusa unicolor鹿角（RU）和Rucervus eldii鹿角（RE）的聚类更为紧密，而CE-1、CE-3和CE-4则更倾向于与Alces alces鹿角（AA）、Rangifer tarandus鹿角（RT）和Odocoileus virginianus鹿角（OV）聚集在一起。CE-5和Dama dama鹿角（DD）的分布比其他鹿角样本更为分散（图5A）。然而，当使用相对定量数据时，聚类模式变得不那么明显。CN样本与CE和其他物种之间的重叠较大，导致物种之间的区分度降低（图5B）。这些结果表明，绝对定量比相对定量更能增强CN物种的区分度，尽管未能完全分离。

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图5. 基于绝对定量数据（A）和相对定量数据（B）的鹿角样品PCA模型得分图

先前的研究主要依赖于特征肽的筛选来进行鹿角鉴定，鉴定是基于目标肽的存在与否使用相对定量策略[10]。然而，考虑到鹿角来源的多样性以及批次和地理来源的潜在差异，掺假样本中不可能总是保证没有特征肽的存在。基于本研究中获得的明胶肽的绝对定量数据，应用PCA进一步探讨了样本之间的差异。结果表明，可以根据特征肽的绝对定量谱型有效区分CN与其他鹿种。

在这种情况下，绝对定量提供了一种更可靠和稳健的质量控制方法。它促进了基于肽的绝对定量指纹图谱的开发，并为与机器学习方法的集成提供了可能性，以便更准确地分类鹿角物种和来源[22]。总体而言，本研究为不同来源的明胶的精确区分和质量评估奠定了基础。

4. 结论
本研究开发了一种策略，通过基于理化性质的相似性来筛选合适的模拟基质，以实现复杂食品基质中特征肽的绝对定量。通过系统的理化性质表征，发现使用Compound蛋白酶制备的水解产物是最合适的模拟基质，其性质与胰蛋白酶消化的明胶最为接近。使用该基质建立的方法表现出良好的线性且基质效应可以忽略不计，能够实现对鹿角明胶中特征肽的准确绝对定量，定量限低至0.12 ng/mL。与现有方法相比，该方法提供了一种无需依赖同位素标记内标来解决基质效应的实用解决方案[15]。将模拟基质设计与定量LC-MS/MS分析相结合，进一步提高了Cervus nippon与其他物种的区分度，证明了其在食品真实性验证中的适用性。

尽管本研究 focused on 五个代表性肽，但所提出的方法可以扩展到复杂基质中的其他基于肽的分析。未来的工作可能涉及增加目标肽的数量，并在更广泛的样本类型中验证该方法。总体而言，本研究为明胶在食品、化妆品及相关领域的质量控制、真实性评估和标准制定提供了可靠且多用途的框架。

**CRediT作者贡献声明**
黄晓猛：撰写——原始草稿，监督。
青瑞子：撰写——原始草稿，研究，数据管理。
孙玉清：撰写——原始草稿，研究，数据管理。
魏远青：项目管理。
刘瑞：监督，概念化。
韩