非手术深层子宫胚胎移植结合基于电穿孔的基因组编辑技术，能够实现CD163基因敲除猪的大规模生产

《Theriogenology》：Non-surgical deep uterine embryo transfer combined with electroporation-based genome editing enables scalable production of CD163-Knockout pigs

　　

李惠媛|全秉珍|张贤成|崔在允|姜古

韩国首尔国立大学兽医学院临床兽医科学系，治疗基因学与生物技术实验室，邮编08826

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）仍然是全球养猪业中最具经济破坏性的病毒性疾病，仅在美国每年就造成超过6亿美元的损失。虽然CD163敲除（KO）猪对PRRS病毒（PRRSV）感染具有完全的抗性，但依赖微注射基因编辑和外科胚胎移植的传统生产方法在工业规模应用中存在显著瓶颈。本文展示了结合电穿孔CRISPR-Cas9基因编辑技术和非外科深部子宫内胚胎移植的方法，可以实现CD163-KO猪的大规模生产。我们的方法无需手术干预或专业微注射技术，成功实现了基因编辑后猪崽的怀孕和出生。基因分型分析显示，部分后代具有完全的双等位基因敲除（KO）状态，而其他个体则表现出嵌合模式，这反映了电穿孔介导的基因编辑的随机性。这些发现为生产基因编辑猪提供了一种技术可行且可扩展的途径。通过消除对复杂手术设施和专业微注射设备的需求，这种方法为标准商业养猪场提供了实用且可实施的策略，代表着基因编辑家畜在全球农业中广泛应用的关键一步。

引言

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种严重的系统性疾病，会严重损害猪的呼吸和生殖健康。PRRS病毒（PRRSV）主要攻击猪的肺泡巨噬细胞，导致免疫调节紊乱，使宿主易受机会性继发感染。这些病理效应导致大量生产损失，表现为繁殖母猪的晚期流产和死产，以及生长猪的慢性肺炎。据估计，PRRS每年造成的全球经济损失达数十亿美元，仅美国产业就损失超过6亿美元。尽管已广泛实施疫苗接种计划，PRRSV仍对传统控制措施具有抗性。该病毒具有遗传可塑性和复杂的免疫逃逸策略，包括快速突变和病毒持续存在，导致疫苗效果因株型而异。在韩国等地区，欧洲（1型）和北美（2型）基因型的共同传播促进了病毒重组和疫苗逃逸变体的出现。鉴于当前的生物安全和免疫措施不足以根除该病毒，识别宿主的遗传抗性已成为减轻这一进化病原体影响的关键策略。

自2015年CRISPR/Cas9系统问世以来，基因编辑技术已广泛应用于基础研究和人类疾病研究，并通过各种动物模型进行验证。该技术进一步扩展到畜牧业领域，为培育抗病畜禽提供了可能。这些成功案例引入了畜牧业育种的新范式，演变为现在所称的“分子育种”。

特别是发现PRRSV利用CD163蛋白作为关键进入调控因子；具体而言，病毒与CD163基因的外显子7编码的富含半胱氨酸的结合受体（SRCR5）相互作用，从而促进病毒脱壳并释放到宿主细胞中。基于这一机制，科学家们成功培育出了CD163敲除（KO）猪，这些猪对PRRSV具有完全抗性，同时保持正常的表型和免疫功能。鉴于CD163 KO猪的显著优势和生理正常性，美国食品药品监督管理局（FDA）于2025年批准其用于人类食用。此后，除美国外，许多国家也在寻求对基因编辑生物（GEOs）的监管批准，使分子育种成为畜牧业领域的颠覆性变革。

尽管基因编辑技术在畜牧业中具有巨大潜力，但在实际生产基因编辑猪方面仍存在诸多瓶颈。目前，CD163 KO猪主要通过外科胚胎移植（ET）获得。虽然外科ET适用于研究规模的应用，但对商业农场来说，维持手术设施和培训专业人员的成本过高，因此基因编辑猪的生产主要局限于少数育种公司。虽然尝试通过精液或活体动物运输进行基因传播，但这些方法常常因建立种群所需的额外世代、高昂的运输成本和密集的劳动力需求而受阻。此外，活体动物的运输存在疾病传播的重大生物安全风险。外科ET的侵入性也对动物福利和代孕母猪的健康造成严重担忧。为应对这些挑战，研究人员开发了非外科深部子宫内胚胎移植（NsDU-ET）技术。然而，现有研究仅限于使用体内（in vivo）来源的胚胎进行后代生产，尚未有使用体外（IVP）生产的基因编辑胚胎进行分子育种的报道。

本研究的主要目标是建立一种可在商业养猪场实施的CD163 KO猪生产系统，从而推动农场内分子育种的可行性。尽管传统的外科ET非常有效，但其对专业设施和兽医技术的需求仍是大规模商业应用的主要障碍。为解决这些实际和福利相关问题，我们开发了一种集成流程，结合了基于电穿孔的基因编辑（该技术在编辑过程中比微注射具有更高的胚胎存活率）和非外科深部子宫内胚胎移植（NsDU-ET）。这项研究展示了将基因编辑技术从实验室推向商业养猪业的可行且符合福利要求的框架。

部分摘录

猪胚胎成纤维细胞（PEF）的制备和电穿孔

从屠宰后的猪子宫中获取妊娠20天（E20）的胎儿。使用手术刀将胎儿皮肤组织切割成小块，并在37°C、5%二氧化碳（CO?）孵箱中，用1毫升1U/mL的胶原酶I（Gibco，美国，17100017）和HBSS（Gibco，14025092）消化4小时。消化完成后，将组织以2000转/分钟的速度离心5分钟，用PBS清洗一次，然后在DMEM培养基（Cytiva，德国，SH30243.01）中培养。

为了选择最佳的sgRNAs用于CD163敲除，我们重新验证了针对编码SRCR5结合受体的CD163外显子7的sgRNAs。选取六个候选sgRNAs，其中三个针对CD163外显子7的近端区域，另外三个针对远端区域，并将其作为Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物导入猪胚胎成纤维细胞（PEFs）中（图1A）。主要通过T7E1检测评估其切割效率；进一步定量编辑精度和删除情况。

讨论

本研究表明，结合电穿孔基因编辑技术和NsDU-ET的生产流程能够高效且可扩展地生产CD163 KO猪。据我们所知，这是首例使用NsDU-ET移植IVP基因编辑胚胎后成功获得活体动物的报告。这一成就标志着基因编辑技术在养猪业中可扩展性的重大突破。

后代的基因分析表明……

结论

总之，我们的结果表明，结合电穿孔编辑和NsDU-ET的方法是生产CD163编辑猪的可行且实用的方式。通过这种非手术流程成功生产出PRRSV抗性后代，表明了一种在降低生物安全风险的同时将抗病特性引入商业养猪场的可行技术途径。

崔在允：资源获取、方法设计。姜古：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、研究实施、资金筹集、概念构思。李惠媛：撰写——初稿撰写、方法设计、研究实施、数据管理、概念构思。全秉珍：撰写——初稿撰写、可视化、方法设计、研究实施、数据管理、概念构思。张贤成：资源获取、方法设计。

作者声明不存在利益冲突。

资助

本研究得到了兽医科学研究所、首尔国立大学研究基金（编号：550-20250064）以及韩国政府（MSIT）资助的NRF生物医学技术研发计划的财政支持（资助编号：RS-2023-00260968）。

作者声明不存在可能影响本文工作的已知财务利益或个人关系。

我们感谢Samseong养猪场的员工、Valad猪兽医中心的兽医以及姜古实验室成员对这项研究的协助。