大果假虎刺（Carissa macrocarpa）的植物化学分析、组分细胞毒潜力及HT-29和LS174T细胞系中p53表达的分子调控

《Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology》：The phytochemical analysis of Carissa macrocarpa, cytotoxic potential of fractions, and the molecular modulation on p53 expression in HT-29 and LS174T cell lines

　　

天然产物仍然是抗癌药物的重要来源，黄酮类化合物和酚类化合物因其调节肿瘤抑制通路的能力而受到特别认可。大果假虎刺（Carissa macrocarpa, C. macrocarpa）是一种富含次生代谢物的可食用植物。本研究旨在通过液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）鉴定C. macrocarpa叶片中的次生代谢物，评估其对结直肠癌细胞系（HT-29和LS174T）的细胞毒性和促凋亡作用，并通过计算机模拟对接阐明其与p53的潜在分子相互作用，从而揭示其抗癌活性的机制见解。LC–MS/MS分析揭示了丰富的黄酮苷，特别是山奈酚、槲皮素和异鼠李素的衍生物。生物测定表明提取物具有有效的细胞毒性，其中总提取物对LS174T细胞的抑制作用最强（IC50= 0.5 μg/mL）。提取物诱导了细胞凋亡，导致G1/S/G2细胞周期阻滞，并上调了p53表达。对接实验证实了糖基化黄酮类化合物（如山奈酚-3-O-罗宾糖苷-7-O-鼠李糖苷、橙皮苷和异鼠李素-3-O-芸香糖苷）具有很强的结合亲和力（?7.87 至 ?9.28 kcal/mol）。此外，100 ns的分子动力学研究证实了山奈酚-3-O-罗宾糖苷-7-O-鼠李糖苷和橙皮苷在p53口袋中的稳定结合。总之，这项综合研究表明，C. macrocarpa通过调节p53在结直肠癌细胞中发挥抗癌作用，并为其治疗潜力提供了机制依据。

该研究论文题为《大果假虎刺（Carissa macrocarpa）的植物化学分析、组分细胞毒潜力及HT-29和LS174T细胞系中p53表达的分子调控》，发表于《Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology》。结直肠癌（CRC）是全球癌症相关发病率和死亡率的主要原因之一，尽管化疗、放疗和靶向治疗取得了进展，但耐药性、全身毒性和复发仍是有效治疗的主要障碍。天然产物历来提供了丰富的抗癌化合物库，其中黄酮类和酚酸因其抗氧化、抗炎和抗癌活性备受关注。大果假虎刺（C. macrocarpa）作为一种原产于南非的可食用植物，既往研究多集中于其抗氧化或抗菌作用，缺乏对其抗癌机制的深入探索，特别是其与p53肿瘤抑制蛋白相互作用的数据尚显匮乏。为此，研究人员开展了此项综合研究，旨在通过整合植物化学分析、体外生物学实验和计算机模拟技术，阐明C. macrocarpa叶提取物的化学成分、抗癌活性及其潜在的分子靶点p53的作用机制。

研究人员采用了多项关键技术方法以完成上述目标。首先，利用液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）对C. macrocarpa叶片甲醇提取物的酚类和黄酮类成分进行了定性和定量分析。其次，通过磺酰罗丹明B（SRB）法评估了提取物对HT-29和LS174T两种结直肠癌细胞系的细胞毒性，并利用膜联蛋白V-FITC/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）双染结合流式细胞术检测细胞凋亡与坏死情况。同时，采用碘化丙啶（PI）单染法分析细胞周期分布变化。此外，通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）分析了p53蛋白的表达水平。最后，利用分子对接（Molecular docking）技术将鉴定出的代谢物与p53蛋白（PDB ID: 3DCY）进行结合模式分析，并进一步通过100纳秒的分子动力学（MD）模拟验证了复合物结合的动态稳定性。

研究结果显示，在植物化学分析方面，LC–MS/MS在负离子模式下共鉴定出19种次生代谢物，包括羧酸、酚酸以及12种黄酮类化合物，主要为山奈酚、槲皮素、芹菜素和异鼠李素的衍生物。生物学评估结果表明，总提取物对LS174T细胞表现出极强的细胞毒性（IC₅₀= 0.5 ± 0.03 μg/mL），并能显著诱导两种细胞系的凋亡。细胞周期分析发现，不同提取物分别导致了HT-29和LS174T细胞在G1、S或G2期的阻滞。在分子机制层面，Western Blot证实亚甲基氯提取物能显著上调两种细胞系中的p53蛋白水平。分子对接研究显示，黄酮苷类化合物如山奈酚-3-O-罗宾糖苷-7-O-鼠李糖苷（结合能为?9.28 kcal/mol）和橙皮苷（结合能为?8.82 kcal/mol）与p53口袋具有极强的结合亲和力，主要通过与Arg10、Asn17、Gln23、Glu89、Arg203等关键残基形成氢键和阳离子-π相互作用实现。分子动力学模拟进一步证实了这两种配体与p53蛋白形成的复合物在100 ns模拟过程中具有优异的结构稳定性，表现为较低的骨架均方根偏差（RMSD）和高数量的持续氢键。

讨论与结论部分指出，该研究首次系统地揭示了C. macrocarpa叶中富含的糖基化黄酮类化合物是其发挥抗癌活性的主要物质基础。这些化合物通过直接与p53蛋白的DNA结合域相互作用，稳定其活性构象，从而上调p53表达，最终诱导结直肠癌细胞凋亡和细胞周期阻滞。值得注意的是，该研究考虑了HT-29（携带R273H突变型p53）和LS174T（野生型p53）细胞系的不同遗传背景，发现提取物对两种细胞均有作用，提示其可能通过靶向突变型p53的致癌功能或恢复其部分野生型功能发挥作用。尽管所有五种排名靠前的黄酮苷类化合物在硅学预测中的结合能均优于阳性对照药5-氟尿嘧啶（5-FU），但仍需在动物模型和临床前研究中进一步验证其疗效与安全性。综上所述，这项研究填补了C. macrocarpa抗癌机制研究的空白，为其作为结直肠癌p53靶向治疗剂的开发提供了坚实的化学和生物学依据。