综述：基因编辑技术在提升作物抗逆性中的应用——以水稻为重点

《Plants》：Applications of Gene-Editing Technologies in Enhancing Crop Stress Resistance with Emphasis on Rice Minghui Sun, Fozia Ghouri, Muhammad Waqas, Amjad Ali, Muhammad Azhar Nadeem, Guanqing Wu, Faheem Shehzad Baloch and Muhammad Qasim Shahid

　　

基因编辑技术为应对作物胁迫、增强对生物胁迫（真菌、细菌、病毒感染）和非生物胁迫（盐分、干旱、重金属、极端温度）的抗性提供了创新策略。CRISPR/Cas9系统被广泛用于敲除感病基因、激活抗性基因或调控胁迫响应基因，已产生许多抗逆作物品种。然而，脱靶效应、嵌合效应以及多基因协同编辑的复杂性限制了其应用。通过优化并与其他前沿技术集成，基因编辑有望培育出高度抗逆和高产的作物品种，为可持续农业发展和保障全球粮食安全做出重大贡献。水稻作为一种关键的主粮和模式植物，在基于基因编辑的抗逆研究中已被广泛研究。研究人员利用CRISPR/Cas9及相关技术有效修饰了许多与干旱、盐分、极端温度和抗病性相关的基因，证明了基因编辑用于农业改良的实际潜力。本文综述了基因编辑在作物胁迫研究中的应用，审视了各种胁迫对作物的影响以及利用基因编辑开发耐胁迫品种的方法。它为通过基因编辑改善作物抗逆性、培育具有更强适应复杂多变环境能力的高度耐受性栽培品种提供了实质性指导。

1. 引言

近年来，气候变化对作物生产造成了巨大影响，气候变化与粮食安全相互关联。在全球气候变化、世界人口持续增长的背景下，干旱、洪涝、高低温、盐碱等非生物胁迫，以及病虫害等生物胁迫，严重制约了作物的生长发育和产量。据统计，每年全球约有2%的作物因气候变化引起的不利胁迫而损失。传统的育种方法在筛选高抗品种时面临育种周期长、难以将多个由基因控制的优良性状集中到单一有利遗传背景中等挑战。因此，基因编辑技术为改善作物品质、增强胁迫耐受性提供了一种简单高效的工具。该技术作为一种新兴的遗传工程技术，使研究者能够直接编辑作物中的关键基因，增强其对各种胁迫的耐受性，从而加强全球粮食安全。本综述系统总结了利用基因编辑技术增强作物胁迫耐受性的最新研究进展，重点关注关键耐胁迫基因的鉴定如何应用于抗逆育种，为利用基因编辑技术确保全球粮食安全提供理论框架。

2. 从传统育种到基因编辑

传统育种是指利用生物学中的自然变异或人工创造变异，再通过选择和培育方法获得优良品种，从而增强作物的适应性。传统育种，如突变育种和杂交育种，提高了作物产量，在农业生产发展中发挥了重要作用。然而，在筛选由多基因控制的复杂性状时，传统育种的局限性变得明显：筛选过程耗时费力，通常需要数年甚至数十年才能培育出一个新品种，且选择效率相对较低，难以同时选择多个优良性状。此外，传统育种方法对遗传资源的利用相对有限，难以实现对复杂性状的精准改良，也很难将多个基因控制的优良性状组合到单一有利的遗传背景中。

相比之下，基因编辑（又称基因组编辑）技术的出现为作物应对胁迫提供了新的方法和希望。基因编辑是一种通过在基因组中删除、插入或替换一段DNA或特定碱基来引起特定变化的分子技术。利用该技术，可以精确靶向基因组上的特定位点，切割目标DNA片段并插入新的DNA片段，从而引起该位点基因序列的突变，实现DNA序列的遗传修饰。与传统的育种方法相比，基因编辑技术具有操作简单、效率高、周期短等优点。通过基因编辑技术，科学家可以在较短时间内培育出具有特定抗逆性状的作物品种，大大缩短了育种周期。基因编辑技术通过精确的基因组修饰改变植物基因序列，包括CRISPR/Cas、锌指核酸酶 (ZFN) 和转录激活因子样效应物核酸酶 (TALEN) 技术。其中，CRISPR/Cas9技术可以像“分子剪刀”一样精确靶向特定基因位点，直接编辑DNA序列，从而获得所需的性状基因。目前，CRISPR/Cas9技术因其设计简单、载体构建成本低、编辑效率高，已成为修饰作物基因的重要工具。此外，基因编辑技术可以打破物种间的生殖隔离，促进跨物种的基因转移，为培育抗逆作物提供更丰富的遗传资源。

3. 作物胁迫

作物胁迫是指作物在生长发育过程中受到各种不利环境因素的影响，导致其生长、发育、生理功能等方面受到抑制或损害，从而影响作物产量和品质的现象。作物胁迫主要分为两大类：生物胁迫和非生物胁迫。

3.1. 生物胁迫

生物胁迫是指由其他生物因素对作物造成的不利影响，一般分为病害、虫害和杂草侵扰。这些生物因素与作物竞争养分、水分和空间，影响其正常生长发育，降低产量和品质，甚至导致作物绝收或死亡。

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  3.1.1. 病害：由真菌、细菌和病毒引起的病害是导致作物减产的主要原因。作物患病后，其形态、生理和生化特性发生异常，严重影响产量和产品品质。其中，水稻常见病害包括稻瘟病、白叶枯病和褐斑病，其中稻瘟病危害最大。小麦锈病是造成小麦减产的主要原因之一，可导致高达20%的产量损失。
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  3.1.2. 虫害与杂草：农田中的杂草和害虫对作物生长构成重大威胁。农田杂草过多可使直播水稻减产70-80%。植食性昆虫的入侵导致全球农业生产每年减少约五分之一。杂草与作物争夺水、养分、光照等资源，并可能为病原体和害虫提供滋生地。水稻叶蝉、棉铃虫等害虫取食作物，阻碍其生长发育，每年对水稻和棉花造成重大经济损失。

3.2. 非生物胁迫

非生物胁迫是指由非生物因素，即环境因素，对作物造成的有害影响，也影响生物体间的相互作用。通常是由干旱、极端温度、洪涝和盐渍化等因素引起的不利影响，已严重影响作物粮食安全。预计全球气候变化将增加粮食需求，而极端天气会降低作物产量和营养品质。非生物胁迫造成的损害已远超生物胁迫。

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  3.2.1. 干旱与洪涝：缺水导致的干旱是影响全球作物产量最严重的非生物因素，也是最具破坏性的自然灾害。水分胁迫期间，它会影响气孔关闭并抑制光合作用，还会破坏作物体内的激素平衡、蛋白质合成和酶活性，导致生长受阻和发育延迟。水稻根系极易受到水分亏缺的影响。土壤水分供应不足时，作物根系无法吸收足够水分以满足蒸腾和代谢需求，导致植株缺水。同时，作物根系对水分极为敏感。缺水时期，根系向上的水分运输受阻，严重影响作物产量和产品品质。相反，近年来频繁发生的洪涝严重影响了作物产量。渍水过多会减少根系氧气供应，导致有害物质积累。同时，地上部分长时间浸泡会降低光合作用活性，呼吸作用受损最终导致作物减产。
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  3.2.2. 极端温度：近年来，极端温度（高温和低温）的频繁发生严重影响了农业生产，威胁粮食安全。它通过影响作物的关键生长阶段（如灌浆期、抽穗开花期），从而抑制花器官发育和花粉活力，导致作物生长发育减缓、生长和代谢紊乱、热害诱导活性氧 (ROS) 积累、灌浆率降低、作物品质下降和产量减少，严重时作物死亡。
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  3.2.3. 盐碱与重金属胁迫：此外，土壤盐渍化和重金属污染也对农业生产构成重大挑战。盐碱胁迫会引发作物一系列生理生化变化，抑制水稻生长和养分吸收，降低谷物产量。盐胁迫还会导致水稻缺铁，降低叶片光合效率，抑制产量增长。同时，盐碱胁迫对根系造成严重损害，影响其生长发育，阻碍养分吸收和有机物运输，导致减产或植株死亡。另一方面，重金属可直接参与与植物发育和代谢相关的众多生理过程，包括酶活性和代谢过程的调节。然而，当土壤重金属浓度超过作物耐受阈值时，这些元素可能从作物生长所必需的因子转变为胁迫因子，变得有毒并对作物构成威胁。当土壤重金属浓度达到一定水平时，会严重破坏土壤微生物群落和根际微生物活性，引发一系列胁迫反应，影响作物生长发育。重金属的积累可通过产生过量的活性氧 (ROS) 以及降低作物光合作用和呼吸速率来破坏作物生理并损害细胞防御系统。这些影响不仅阻碍作物生长发育，还抑制根系生长。活性氧物种的变化对作物生长和品质产生负面影响。重金属和类金属通过提高ROS水平和改变细胞及抗氧化防御机制，显著阻碍多倍体和二倍体水稻的生长。

总之，复杂多变的生物和非生物胁迫是制约当前和未来全球粮食安全的主要瓶颈。传统育种方法在应对这些胁迫时存在育种周期长、选择效率低的特点。因此，利用新兴的基因编辑技术精准修饰作物基因组，培育新的高抗品种，已成为保障全球粮食安全的必然选择。

4. 基因编辑在生物胁迫中的应用

4.1. 抗病基因的改良

稻瘟病是由真菌 Magnaporthe oryzae引起的毁灭性水稻病害，被称为“水稻的癌症”，广泛分布于全球水稻种植区。稻瘟病的发生对水稻产量和品质有重大影响，对全球粮食安全构成巨大威胁。据统计，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失可高达30-50%，在一些重灾区甚至可能导致绝收。随着基因编辑技术的不断进步，序列特异性核酸酶 (SSNs) 是改良作物的有力工具，其中CRISPR/Cas9是最有效的工具之一。科学家利用CRISPR/Cas9等基因编辑工具精确编辑与稻瘟病抗性相关的基因，取得了一些重要成果。例如，在稻瘟病调控中，OsGLP2-1和 OsMESL代表了两种不同的调控机制。胚芽蛋白 (GLP) 基因家族是一个重要的防御基因家族，已被证明参与植物抗病性。研究表明，OsGLP2-1是水稻 GLP基因之一，能被 Magnaporthe oryzae显著诱导。研究发现，当 OsGLP2-1过表达时，观察到水稻对白叶枯病、穗颈瘟和叶瘟的抗性增强。在水稻中发现了一个新的抗病突变基因——甲基酯酶样基因 (OsMESL)，它通过基因编辑产生功能突变。OsMESL通过与水稻中的硫氧还蛋白相互作用影响ROS的积累，从而使水稻对白叶枯病 (Xanthomonas oryzae)、纹枯病 (Rhizoctonia solani) 和稻瘟病表现出显著的耐受性。

此外，多基因编辑策略也是基因编辑技术中的重要方法。例如，玉米大斑病是由真菌病原体 Setosphaeria turcica引起的，病斑主要出现在叶片上。受感染的叶片表现出萎蔫甚至坏死，严重损害叶片光合作用。研究表明，Ht1、Ht2、Ht3和 Htn1这四个基因赋予了玉米对真菌 Setosphaeria turcica的抗性。研究发现这些基因增强了对病原体的基础防御能力，提高了玉米的抗逆性。

4.2. 除草剂抗性研究

由于农田杂草过度生长，除草剂的应用可能会影响作物的生长发育，甚至导致作物死亡。因此，有必要利用基因编辑工具，特别是CRISPR/Cas9系统，开发抗除草剂 (HR) 作物以消除杂草并提高作物产量。CRISPR/Cas9技术可用于研究抗除草剂作物。Zhang等人发现，通过对控制水稻落粒性的 SH4和 qsh1基因进行精确编辑，并引入特定的基因突变，转基因杂草稻品系的落粒倾向显著降低，从而减少了产量损失。其次，对于草甘膦等对杂草和主要作物均有致死作用的除草剂，通过CRISPR/Cas9介导的同源定向修复 (HDR) 实现靶向碱基编辑，将碱基替换引入水稻的内源基因中。为了应对作物对草甘膦的敏感性，研究人员利用基因编辑产生了含有 mCcEPSPS的T₂代编辑植株进行研究。这些植株表现出突变的持续遗传、降低的草甘膦结合亲和力，并且在施用草甘膦后保留了最佳的光合和农艺特性，从而增强了作物的抗逆性。

4.3. 抗虫性研究

虫害是导致全球粮食作物减产的主要因素之一。CRISPR/Cas9技术可以改变昆虫DNA以引发基因突变或对抗昆虫对特定杀虫剂的抗性。例如，草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda) 是一种极具破坏性的农业害虫。由于 dsx基因调节昆虫的性别分化，研究人员利用CRISPR/Cas9技术精确靶向该基因，发现具有 dsx突变的成年雄性害虫无法与其他雄性交配，从而减少了害虫种群数量。这是一种有效的害虫防治方法。同时，可以靶向破坏、替换或修饰作物中抗虫相关基因的启动子或其他调控区域中的关键顺式作用元件，从而精细调控其表达水平和模式，增强作物的抗虫性。

研究发现，当水稻受到害虫侵害时，其胰蛋白酶抑制剂基因的表达会增加，从而通过抑制害虫体内的酶活性来抑制害虫生长。通过使用CRISPR/Cas9技术精确修饰抗虫基因的启动子区域，研究人员显著抑制了害虫幼虫的生长发育，从而减少了其造成的损害。

5. 基因编辑在非生物胁迫中的应用

5.1. 抗旱性研究

由于气候变化，干旱严重影响了全球水稻的生长发育和产量。研究人员正在采用多种研发策略来应对气候引起的干旱风险。

通过研究MYB蛋白，鉴定出了 OsMYBR1基因。利用基因编辑产生了过表达 OsMYBR1的植株，并通过评估各种生理指标（包括游离脯氨酸、可溶性糖浓度和脱落酸 (ABA) 敏感性）与野生型植株进行比较，进行了耐旱性研究。结果表明，OsMYBR1的过表达导致可溶性糖和游离脯氨酸的积累，降低了对脱落酸的敏感性，从而增强了植物的抗旱性。它主要通过改变生理指标来响应干旱胁迫。此外，还鉴定出一个可能参与诱导植物抗旱性的基因 OsWIH2。以日本晴为遗传背景，他们构建了 OsWIH2过表达 (OsWIH2-OE) 和RNA干扰 (OsWIH2-RNAi) 株系。随后的干旱处理和复水试验表明，与 OsWIH2-RNAi 和野生型 (WT) 植株相比，OsWIH2-OE 植株在干旱胁迫下的存活率显著更高。此外，OsWIH2-OE植株表现出减少的ROS积累，从而增强了其对干旱胁迫的抗性。该基因主要关注胁迫后的恢复。相比之下，Liu等人研究了 Osgf14b在水稻耐旱性中的作用。与野生型相比，osgf14b突变体改变了多个胁迫相关基因的表达，使其对干旱和渗透胁迫更具抗性。osgf14b突变体增强了作物的耐旱性，而 OsGF14b过表达株系对干旱胁迫更敏感。这提示我们，对于某些基因，CRISPR/Cas9敲除可能比过表达赋予更强的抗性。例如，Ye等人利用CRISPR/Cas9修饰了 Rc基因，从而消除了野生稻的有害稃壳性状，提高了其种子在萌发期间的耐旱性。此外，在模拟干旱条件的实验环境中，基因编辑水稻的产量比未编辑对照增加了30%以上。Luo等人研究的miR1432-OsCaML2模块通过调控 microRNA 来微调下游靶基因；miR1432通过直接靶向 OsCaML2基因来影响水稻的耐旱性。

5.2. 耐高温性研究

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，研究人员通过靶向敲入热稳定性基因或替换内源的Rubisco活化酶基因，将热稳定的Rubisco活化酶引入拟南芥 (Arabidopsis) 和适应高温的野生稻种中。这种精确的基因编辑方法增加了Rubisco活化酶活性，提高了高温下的光合作用并促进了植物生长。最近，在利用基因编辑技术阐明耐热性的生化、生理和分子机制方面取得了重要进展。在胁迫响应方面，热休克蛋白 (HSPs) 是植物抵御热胁迫的第一道防线。例如，Hsp101、BOBBER1 和 Hsa32 已被证明对诱导和维持耐热性很重要。HsfA2的下游靶基因和上游调控因子，包括 Hsa32和 Apx2，以及热休克转录因子结合蛋白，都参与调控耐热性。

相比之下，肖浪涛团队对 RARE1的研究揭示了另一种耐热策略。该研究意外地发现，敲除 RARE1基因后，植物表现出明显的高温不耐受性。进一步的研究表明，RARE1基因的表达以及相应的 accD编辑效率都响应温度变化。人工提高植物中 accD的编辑效率可以显著增强其耐高温性，表明 accD编辑效率与植物耐高温性呈正相关。深入研究表明，accD编辑效率的变化直接影响乙酰辅酶A羧化酶 (ACCase) 的活性，该酶是脂肪酸合成的关键酶，从而调节不饱和脂肪酸的产生，并影响生物膜耐受高温的能力。这项研究不仅全面揭示了植物叶绿体 accD基因的RNA编辑通过参与调节ACCase活性和脂肪酸合成来响应高温胁迫的分子机制，而且扩展了胁迫条件下RNA编辑的理论认识，对分子植物育种具有重要的指导意义。研究人员重点关注拟南芥中的 PIF7基因，这是一种 bHLH转录因子，在响应高温胁迫的转录调控机制中起关键作用。

5.3. 耐淹性研究

长时间的淹水会导致植物缺氧，损害其生长发育。植物进化出两种相反的生存策略来应对淹水胁迫：“伸长策略”和“停滞策略”。通过对大麦群体进行全基因组关联分析 (GWAS)，鉴定出一个差异表达基因 HvERF62。通过CRISPR/Cas9介导敲除该基因的突变体表现出对淹水的敏感性、不定根形成减少和叶绿素含量降低。该基因调节植物组织的气孔形成和ROS稳态。其中，耐淹位点 Sub1A-1代表了休眠策略，而漂浮基因 SNORKEL1 (SK1) 和 SNORKEL2 (SK2) 代表了伸长策略，调节水稻的不同淹水反应。携带 Sub1A-1的品种表现出有限的伸长和碳水化合物的保存，而 SK1/SK2促进节间的快速伸长，共同有助于提高淹水胁迫下的存活率。水稻的淹水反应受激素调节：SUB1A-1通过抑制赤霉素介导的伸长来促进静止，而 SK1/SK2通过乙烯-GA信号传导增强节间伸长，从而提高淹水胁迫下的存活率。

Gammanpila等人报道，缺氧响应转录因子，特别是 SUB1A和 AP2/ERF家族成员，通过抑制淹水期间的伸长生长来调节无氧代谢、保存能量，并提高水稻在淹水胁迫下的存活率。有趣的是，研究人员筛选了本地水稻地方品种中的耐淹位点 Sub1A和 SNORKEL(SK1/SK2)，发现有几个基因型同时携带这两个位点，使其能够采取静止或伸长策略，从而在混合淹水条件下提高存活率。此外，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统产生了水稻 SAB23基因的靶向敲除突变体。将该突变体与过表达株系和野生型植株一起进行淹水试验，以研究该基因的功能。结果表明，在淹水胁迫下，SAB23敲除突变体的内源GA₄水平显著降低，导致生长迟缓、种子成熟延迟和结实率降低。因此，SAB23通过介导GA₄水平来调节水稻的耐淹性。

5.4. 耐盐碱性研究

在水稻1号染色体QTL上发现了一个盐胁迫响应基因 OsSalT。研究结果将 OsSalT与植物适应性胁迫响应联系起来，并证明其通过依赖于脱落酸和赤霉素酸的途径发挥作用。当它在植物模型中被过表达时，它们对干旱和盐的抵抗力增强。此外，用 OsSalT转化的植物表现出更好的种子萌发、更早的开花和更强的根系生长。利用优良的三系恢复系基因R192作为育种受体，采用CRISPR/Cas9靶向 OsRR22，这是水稻耐盐性的一个主效基因。为了确定幼苗的耐盐性，在它们长出三片叶子时，将它们暴露在0.4%和0.8%的NaCl溶液中。该研究的结果为未来提高水稻耐盐性的努力建立了一个标准；具体来说，由CRISPR/Cas9产生的具有 OsRR22突变的新型种质在这方面显示出潜力。

WRKY转录因子家族在植物中非常突出。除了控制植物生长发育外，它还参与调节植物应对生物和非生物胁迫的能力。PtWRKY39过表达的转基因株系在萌发和苗期表现出抗旱性和耐盐碱性。在根部灌溉胁迫下，表型分析表明，在经受盐碱土浸提液和氯化钠处理的七叶期转基因幼苗中，转基因株系与野生型 (WT) 相比表现出明显优越的生长。这项工作的结果表明，在营养生长期过表达 PtWRKY39基因的转基因植物能更好地调节其对干旱、盐和碱的抵抗力。AT1基因在水稻的耐盐碱机制中起着至关重要的作用。研究发现，当作物受到盐碱损害时，细胞会产生ROS。适量的ROS可以作为信号分子调节代谢反应，如植物气孔关闭和病害防御。然而，过量的积累会破坏作物细胞中活性氧的平衡，影响作物的生长发育。水通道蛋白可以将细胞内多余的活性氧“泵”到细胞外，并且只有磷酸化的水通道蛋白具有此功能。AT1基因抑制水通道蛋白的磷酸化；通过基因编辑敲除 AT1可以增强水稻的耐盐性。

基因编辑通过缩短育种周期和促进新种质的开发来加速育种。这些应用促进了作物性状，包括提高产量和改善品质，同时通过增强对病害、虫害以及非生物胁迫的抵抗力来增强作物的韧性。

5.5. 重金属耐受性研究

近年来，由于土地污染，越来越多的重金属在土壤中积累，对作物产生一系列毒性效应。育种者通过基因编辑探索抗逆基因，例如利用CRISPR-Cas9对涉及重金属耐受性的基因进行靶向敲除、替换或表达调控，以减轻重金属对作物的影响。Zhou等人利用CRISPR-Cas9编辑小麦的表观基因组，从而增强其重金属胁迫耐受性，并阐明了其响应重金属胁迫的基因功能。利用野生型水稻和通过CRISPR/Cas9技术产生的 Osnramp5突变体水稻，研究了镉 (Cd) 胁迫对水稻生长的影响。丛枝菌根真菌 (AMF) 可以调节植物根系对重金属离子的吸收。研究发现，镉处理上调了水稻叶片中 OsNRAMP5基因的表达。值得注意的是，接种 Rhizophagus irregularis(Ri) 显著抑制了镉从水稻根部向叶片的转运，这可能归因于AMF介导的重金属转运调节。此外，Osnramp5突变体中的镉含量显著低于野生型水稻，表明 OsNRAMP5基因是控制水稻中镉离子转运的关键调节因子。这种涉及靶向基因敲除的基因编辑方法有效减少了作物中镉的积累。此外，OsNRAMP家族在水稻对重金属胁迫的耐受性中起着至关重要的作用。研究表明，OsNRAMP1突变体通过调节ROS和重金属离子转运来增强作物耐受性；OsNRAMP2突变体调节重金属离子向植株地上部分的转运，从而减少其在籽粒中的积累；而 OsNRAMP3/4/6/7通过调节微量元素稳态来增强抗逆性。

OsHMA家族是作物响应重金属胁迫的关键调控枢纽。研究结果表明，OsHMA2突变体可以同时转运必需营养元素锌和有毒重金属镉，从而促进镉向植株地上部分的转运；与 OsHMA2的转运功能相反，OsHMA3是抵御镉毒性的第一道防线，阻止其向上运输；OsHMA4基因的功能缺失突变导致更多的铜被转运到籽粒中，导致籽粒中铜含量过高；而过表达 OsHMA5显著增加了铜向地上部分的转运，而敲除 OsHMA5则降低了地上部分的铜含量。

重金属以离子形式在根部被植物吸收并向上转运。油菜 (Brassica napus) 因其能够积累高浓度的重金属而被认为是植物修复的有希望的候选者。Zhang等人利用CRISPR-Cas9