使用稳定同位素标记技术结合液相色谱-质谱（LC–MS）方法，对经D-乳酸处理的细胞模型中的胺类次级代谢物组进行分析

《Analytica Chimica Acta》：Stable isotope labeling LC–MS for profiling the amine submetabolome in a D-lactate treated cell model

　　陈月强|董晓霞|刘莉|陈秀萍|冯晨国|詹丽星|苏月|张芳|郭银龙
上海中医药大学跨学科整合医学研究所，中国上海蔡伦路1200号，201203

**摘要**
**背景**
胺类亚代谢组的改变与细胞代谢状态密切相关，对于理解干预条件下的代谢调节非常重要。本研究采用稳定同位素标记衍生化结合液相色谱-质谱（LC-MS）技术来表征细胞胺类亚代谢组的变化。通过优化色谱分离和细胞代谢淬灭程序，提高了胺类代谢物的分离性能，并在采样时更准确地保留了代谢状态。

**结果**
将建立的该方法应用于D-乳酸处理的BEAS-2B细胞模型，以评估不同化合物干预条件下的胺类亚代谢组变化。结果表明，硒代蛋氨酸（SeMet）和小檗碱可以缓解D-乳酸引起的胺类亚代谢组异常，并显示出与体内实验观察到的肿瘤抑制趋势一致的代谢调节效应。

**意义**
总体而言，这种分析策略能够表征复杂生物样本中的胺类亚代谢组，为基于代谢组的细胞代谢变化研究提供了可靠的方法学参考。

**引言**
肿瘤细胞在肿瘤发生和进展过程中并非孤立存在，而是与周围肿瘤周围细胞进行持续的双向相互作用。通过塑造微环境，肿瘤细胞影响肿瘤周围细胞的表型和功能状态，进而反过来影响肿瘤的增殖、侵袭性和代谢行为[1]，[2]。在肿瘤-肿瘤周围细胞相互作用背景下，乳酸不仅是肿瘤微环境（TME）中的关键代谢信号分子，还充当连接肿瘤和肿瘤周围细胞的代谢桥梁。与L-乳酸相比，D-乳酸在人体酶中的代谢效率较低，因此容易积累[3]。D-乳酸的过度积累会增加游离H+浓度，从而降低pH值并引起微环境酸化。当其在培养系统中的浓度超过2 mM时，细胞外pH值会下降。此外，D-乳酸能够穿过细胞膜进入细胞，导致细胞内酸化并参与TME的调节[4]。Han等人证明，D-乳酸可以促进肝细胞癌中肿瘤相关巨噬细胞的M2极化，表明其在TME中的调节作用[5]。在我们之前的工作中，我们发现D-乳酸处理正常肺上皮BEAS-2B细胞可以模拟肿瘤周围细胞的代谢状态。D-乳酸干预后，包括谷氨酸、精氨酸和谷胱甘肽在内的胺类代谢物水平显著改变，表明胺类代谢物是D-乳酸诱导的代谢变化的关键功能指标[6]。胺类代谢物作为细胞氮源和信号分子，广泛参与蛋白质合成、信号转导、细胞增殖和能量代谢。这些代谢物的失调已被证明会促进肿瘤细胞生长[7]。例如，谷氨酰胺是肿瘤细胞维持其恶性表型所消耗最多的氨基酸[8]。此外，丝氨酸和甘氨酸是蛋白质合成的关键氮源和碳骨架[9]，而其他氨基酸（如天冬氨酸）是细胞增殖的必需底物，其缺乏会显著抑制肿瘤细胞的代谢和增殖[10]。例如，神经递质γ-氨基丁酸作为连接氮代谢和能量代谢的关键中间体，参与代谢循环并为肿瘤细胞代谢提供底物[11]。此外，γ-氨基丁酸还可以作为信号分子促进肿瘤增殖[12]。多胺代谢物在肿瘤发生中也起着重要作用，参与肿瘤细胞增殖，其水平的改变与肿瘤进展密切相关[13]。此外，精胺水平的升高可以通过激活下游调控轴促进肿瘤细胞生长和侵袭[14]。大多数先前的研究分析的是单个氨基酸的代谢变化，而肿瘤细胞中的代谢异常通常涉及多个途径和代谢物的协调改变[15]。与关注单一代谢物的变化相比，检查功能相关的代谢物类别能更好地捕捉全局代谢特征，反映肿瘤代谢网络的复杂性[16]。基于上述背景，建立了D-乳酸处理的BEAS-2B细胞模型来模拟肿瘤周围细胞的代谢特征，并开发了LC-MS分析方法来表征D-乳酸干预下细胞内胺类代谢物的变化。

随着质谱技术的不断进步，胺类代谢物的分析方法取得了显著进展。然而，由于大多数胺类代谢物具有高极性、色谱保留性差和电离效率低等固有物理化学性质，其在复杂生物基质中的检测仍然具有挑战性[17]。目前报道的胺类衍生化试剂（如丹磺酰氯（Dansyl-Cl）、9-芴基甲基氯甲酸酯（Fmoc-Cl）、Dabsyl-Cl和Marfey试剂）常用于改善色谱分离和增强质谱响应，从而优化分析性能[18]。化学同位素标记结合质谱分析已成为提高胺类代谢物检测灵敏度、选择性和定量准确性的有效策略[19]。这种方法已广泛应用于定量代谢组学，实现高覆盖率和高精度代谢物分析[20]。该方法能够对氨基官能团进行同位素编码，显著增强质谱响应，同时适用于靶向和非靶向代谢组学工作流程[21]，[22]，[23]。最近的综述系统总结了胺类代谢物的衍生化策略及其在LC-MS分析中的优化，进一步推动了该领域的方法学发展[24]。此外，稳定同位素标记策略在蛋白质组学领域也取得了显著进展[25]，如TMT[25]、iTRAQ[26]和DiLeu[27]等方法已广泛应用于胺类代谢物的定量分析，显著提高了定量准确性和分析通量。此外，新型衍生化试剂（特别是针对氨基官能团设计的高反应性试剂）的不断开发显著改善了色谱分离和检测灵敏度。这些分析进展使得在复杂生物样本中分析胺类代谢物成为可能[28]，[29]。同时，结合单步衍生化和稳定同位素标记内标的质谱方法越来越多地用于胺类代谢物的高通量和准确定量。在我们之前的工作中，我们开发了一个基于同位素编码吡啶盐衍生化（DMMIC）的代谢组学平台来检测多种胺类代谢物[30]。相比之下，上述衍生化试剂通常依赖质子化在电喷雾电离过程中产生信号。DMMIC衍生化策略引入了季铵基团（N-取代的吡啶inium），使衍生化产物永久带正电荷，从而无需依赖质子化即可实现电离。这一特性显著增强了目标分析物的质谱响应。该方法应用于肿瘤和肿瘤周围组织，以表征胺类代谢物通路特征，并扩展到谷胱甘肽相关代谢物，动态评估肿瘤组织和细胞模型中的谷胱甘肽合成[31]。这些研究表明，胺类亚代谢组学是识别肿瘤代谢失调的关键功能指标，为表型驱动的研究提供了坚实的框架，表征了TME内的复杂代谢相互作用和潜在治疗靶点。

**总结**
本研究建立并优化了一种基于稳定同位素标记的LC-MS分析平台，用于表征D-乳酸处理后BEAS-2B细胞中胺类代谢物的变化，并进一步分析了不同化合物干预条件下的胺类代谢物变化。

**试剂**
[d0]-/[d3]-DMMIC根据先前报道的方法合成。除非另有说明，所有试剂均购自Adamas Life（上海，中国）。吉非替尼、阿拉ント乳酸酮、白藜芦醇、超氧化物歧化酶、卡达蒙宁、异鼠李素和L-2-氯苯丙氨酸购自BiDe（上海，中国）。三辛和GLO I抑制剂购自Macklin（上海，中国），NADH I抑制剂购自Yuanye（上海，中国）。人参皂苷Rb1、水飞蓟素和山柰酚购自……

**胺类亚代谢组检测分析方法的建立**
在我们之前的工作中，建立了一种基于DMMIC衍生化结合LC-MS的分析策略，并在细胞和组织样本中进行了验证[30]，[31]。该方法基于DMMIC与LC-MS的组合已在先前研究中得到系统验证[30]，[31]，表现出良好的线性（R2 = 0.9904–0.9998）、精度（日内：1.0%–19.7%；日间：2.2%–21.9%）和准确性（71.8%–108.8%）。此外，该方法具有高灵敏度，检测限为0.5–20 μM。

**结论**
本研究建立了一种稳定同位素标记衍生化LC-MS分析策略，并应用于表征D-乳酸处理后的BEAS-2B细胞中的代谢变化。通过优化色谱条件和淬灭程序，提高了胺类亚代谢物的分离性能，并在采样时保留了代谢状态。利用该方法，表征了不同化合物干预下细胞胺类代谢物的变化。

**作者贡献声明**
陈秀萍：软件、正式分析；董晓霞：可视化、验证、软件、正式分析、数据管理；刘莉：软件、正式分析；苏月：写作-审稿与编辑、监督、软件、资源获取、正式分析、数据管理；张芳：写作-审稿与编辑、监督、资源获取；冯晨国：软件、正式分析；詹丽星：可视化、验证、软件、正式分析、数据管理。

**数据可用性**
数据提供在补充Excel文件中，原始数据已存放在http://dx.doi.org/10.17632/47dtgxytvm.1。

**关于生成式AI和AI辅助技术在本研究中的应用**
在准备本工作时，作者使用了Grammarly和ChatGPT-5来改进语言和可读性。随后，作者根据需要彻底审阅和编辑了内容，对出版物的内容负全责。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

**致谢**
本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号2023YFF0723600）、中国科学院战略性先导科技专项（项目编号XDB0610000）、国家自然科学基金（项目编号22474151）和上海市科学技术委员会（项目编号23ZR1460900）的支持。我们还感谢恩施土家苗族自治州科学技术局的财政支持。