基于实时PCR技术的饲料中多种抗生素发酵残留物快速检测方法的开发

《Analytica Chimica Acta》：Development of a Rapid Identification Method for Multiple Antibiotic fermentation Residues in Feed Based on Real-Time PCR

　　

范宇航|郭春涛|张娟|李晓宇|李阳|索德成|杨增玲|陈云林|陈凯|范霞|陈爱良

中国农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，农产品质量安全重点实验室，北京，100081，中国

摘要

背景

抗生素发酵残留物含有抗生素残留物和其他潜在有害成分，当它们被非法添加到动物饲料中时，会带来日益增加的风险。这些残留物的添加会促进抗菌素耐药性的传播、药物积累，并最终威胁食品安全和公共卫生。尽管需要监管控制，但现有的分析方法存在特异性差、准确性低以及在实际应用中适用性有限的问题。因此，迫切需要一种快速、准确且实用的检测方法，以便直接在多种饲料基质中识别抗生素发酵残留物。

结果

我们设计了针对氧四环素、新霉素和阿维菌素产生菌株的核心生物合成基因OxyA、NeoN和AveD的引物-探针对，建立了三种实时PCR检测系统。该检测流程简化了操作步骤，仅需要简单的DNA提取，无需化学清洗或饲料基质预处理。所有反应都在两小时内完成，显示出适合常规监测的高操作效率。敏感性评估表明，即使在饲料中残留物含量低至1%（w/w）的情况下也能可靠地检测到它们，并且没有与非目标抗生素残留物或多种饲料成分发生交叉扩增。人工掺杂的样品验证了该方法在包括豆粕、棉籽粕和复合饲料添加剂在内的多种基质中的稳健适用性。重复性评估进一步证实了其出色的稳定性，检测内和检测间的CV值均低于2%。这些结果共同表明，所开发的检测方法快速、准确且高度适应实际的饲料检测环境。

意义

本研究首次展示了基于菌株特异性生物合成基因的饲料中多种抗生素发酵残留物的实时PCR检测方法。该方法提供了一种快速、灵敏、准确且高特异性的分子工具，可用于现场监管筛查，从而及早发现非法添加的抗生素发酵残留物。这项技术的应用加强了饲料安全监测，有助于预防与抗生素相关的危害并保护公共卫生。

引言

抗生素发酵残留物是在抗生素发酵生产过程中产生的工业废弃物。这些残留物富含粗蛋白、残留抗生素和各种潜在有毒化合物。由于这些残留成分对动物和人类健康存在风险，法规已明确禁止将其用于动物饲料[1]、[2]，并且必须安全处置[3]。然而，由于它们看似具有较高的营养价值，一些企业或畜牧业生产者为了降低成本，非法将这些残留物添加到动物饲料中，作为传统蛋白质来源的替代品。这种做法极具隐蔽性，会带来严重风险，包括破坏动物肠道微生物群、传播抗生素耐药细菌以及药物残留物的积累[3]、[4]、[5]。这些危害可能通过食物链传播，影响人类健康，导致免疫抑制、毒性反应和抗生素耐药性的增加[6]、[7]、[8]、[9]。因此，建立有效的饲料中抗生素发酵残留物检测方法对于确保饲料安全和保护人类健康至关重要。

目前，基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和红外光谱[10]、[11]、[12]、[13]的抗生素发酵残留物分析方法在特异性、准确性和实际应用性方面面临某些挑战。具体来说，由于缺乏准确的特征检测标志物，质谱技术难以有效区分饲料中是直接添加的抗生素还是抗生素发酵残留物。另一方面，红外光谱容易受到复杂饲料基质的干扰，导致准确性降低和实际应用性受限。此外，这些物理化学检测方法通常涉及复杂的操作程序、耗时的样品预处理、对仪器的依赖性强以及高昂的检测成本，无法满足常规监管的实际需求。因此，迫切需要开发一种新型检测方法，该方法应具有高特异性、高准确性、操作简便，并适合在地方实验室应用，从而有效提高抗生素发酵残留物的监管效率。

近年来，分子诊断技术得到了广泛的发展和应用[14]、[15]、[16]、[17]、[18]。实时PCR是一种高度敏感和特异的分子检测技术，通过监测核酸扩增过程中的荧光信号变化来实现目标基因的快速定量分析[19]、[20]、[21]。该方法用户友好，样品预处理要求低，不依赖复杂的提取程序或精密仪器，具有很强的现场应用适应性。它已被广泛应用于医学诊断[22]、食品安全检测[23]、[24]、[25]、环境监测[26]以及转基因生物的鉴定[27]、[28]、[29]、[30]等领域，非常适合在地方实验室和一线监管环境中使用。在工业抗生素发酵过程中，各种生产菌株通常表达特定的生物合成基因，这些基因在其基因组中具有稳定和保守的序列特征[31]、[32]、[33]。尽管后续的抗生素提取过程包括酸碱处理、絮凝和过滤等步骤以纯化发酵液，但生产菌株通常以细胞碎片的形式残留在最终产物中，其基因组DNA片段也可能以相对稳定的状态存在。利用这一特性，可以设计引物和探针来靶向特定抗生素产生菌株的特征生物合成基因。结合实时PCR技术，这种方法能够快速准确地检测饲料基质中未经授权的抗生素发酵残留物。

本研究首次报道了一种基于菌株特异性生物合成基因的饲料中多种抗生素发酵残留物的实时PCR检测方法，设计了针对氧四环素、新霉素和阿维菌素生产过程中Streptomyces rimosus、Streptomyces fradiae和Streptomyces avermitilis表达的关键生物合成基因OxyA [34]、[35]、NeoN [36]、[37]和AveD [38]、[39>的特异性引物和荧光探针。基于这些目标，建立了实时PCR检测方法，整个工作流程如图1所示。利用来自原始生产菌株的抗生素发酵残留物中的DNA片段作为分子标记，这些方法能够通过特异性扩增目标基因序列来快速识别饲料中这些残留物的非法添加。该方法简单可靠，适用于现场应用，并具有广泛的实施潜力，非常适合满足地方监管工作的实际需求。总之，本研究提供了一种基于抗生素产生菌株遗传特征的分子级检测策略，提高了识别非法添加物的能力，增强了监管监督的及时性和覆盖范围，为保障动物源性食品的安全性和加强抗生素发酵残留物的控制系统提供了技术支持。

章节片段

材料与试剂

从中国不同兽医抗生素制造商处收集了多批抗生素发酵残留物，包括氧四环素（三种类型）、新霉素（三种类型）、青霉素（两种类型）、阿维菌素（两种类型）、阿普拉霉素（两种类型）、光谱霉素（两种类型）和泰乐菌素（两种类型）。每个样品在38°C下烘干后，再在室温下储存以备分析。

此外，还使用了各种原始饲料成分和商业饲料

特异性测试

在建立实时PCR检测方法时，确保引物和探针特异性结合到目标基因序列上对于保持检测准确性和可靠性至关重要。因此，进行了特异性验证，以确认设计的寡核苷酸能够准确识别目标DNA序列，同时排除非目标物质的干扰。

结论

本研究首次建立了针对菌株特异性生物合成基因的实时PCR方法，用于监测动物饲料中非法添加的抗生素发酵残留物。基于对发酵副产物中残留微生物DNA的分子识别，建立了针对三种代表性残留物——氧四环素、新霉素和阿维菌素的快速检测系统。该方法表现出高特异性、可靠的检测准确性和操作效率

CRediT作者贡献声明

陈凯：撰写 – 审稿与编辑。陈爱良：概念构思、资金获取、撰写 – 审稿与编辑。范霞：概念构思、撰写 – 审稿与编辑。郭春涛：研究、方法学、撰写 – 初稿。范宇航：概念构思、研究、方法学、可视化、撰写 – 初稿。李晓宇：撰写 – 审稿与编辑。张娟：撰写 – 审稿与编辑。索德成：撰写 – 审稿与编辑。李阳：撰写 – 审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本研究发表的竞争性财务利益或个人关系。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划（2023YFF1104700）的资助。我们衷心感谢在整个实验过程中提供支持的所有人员。