基于双重PCR的诊断方法，通过检测外膜β-桶蛋白来区分Flavobacterium oreochromis和Flavobacterium covae

《Aquaculture》：Duplex PCR-based diagnostics targeting an outer membrane β-barrel protein for differentiation of Flavobacterium oreochromis and Flavobacterium covae

【字体：大中小】 时间：2026年05月13日 来源：Aquaculture 3.9

编辑推荐：

　　Pimwarang Sukkarun|Kamolwan Khianchaikhan|Dung Ho My Nguyen|Channarong Rodkhum泰国那空是贪玛叻市拉贾曼加拉科技大学斯里维贾亚分校兽医科学学院，80240摘要由相近种的Flavobacterium引起的柱

Pimwarang Sukkarun|Kamolwan Khianchaikhan|Dung Ho My Nguyen|Channarong Rodkhum

泰国那空是贪玛叻市拉贾曼加拉科技大学斯里维贾亚分校兽医科学学院，80240

摘要

由相近种的Flavobacterium引起的柱状病（Columnaris disease）是一种影响全球经济重要淡水鱼类的主要细菌性疾病，泰国也不例外。为了有效管理这种病害，进行物种水平的鉴定至关重要，但这一过程受到宿主范围重叠、临床症状难以区分以及传统诊断方法分辨率有限等因素的阻碍。在本研究中，一种编码外膜β桶蛋白的基因被作为物种鉴定的替代分子标记物，并被用于开发针对Flavobacterium oreochromis和Flavobacterium covae（这两种细菌是泰国柱状病的主要病原体）的双链PCR检测方法。基于该基因的比较序列分析和系统发育研究表明，F. oreochromis与F. covae、F. columnare和F. davisii之间存在明显的物种差异，种内一致性高达98.26%以上，种间差异显著。根据物种特异性序列变异，设计了一种双链PCR检测方法：使用保守的前引物和物种特异性的后引物，分别扩增出F. oreochromis的325 bp和F. covae的154 bp的扩增产物。该检测方法具有高分析灵敏度，两种细菌的检出限均为0.1 pg的基因组DNA，并且无与其他系统发育相关或临床相关的非目标细菌的交叉反应。这些发现表明，β桶外膜蛋白基因是一个生物学上有意义且可靠的分子靶标，所开发的双链PCR检测方法可作为水产养殖系统中常规诊断、流行病学监测和疾病管理的实用工具。

引言

柱状病是由几种密切相关的Flavobacterium物种引起的，仍然是全球范围内影响经济重要鱼类的重要细菌性疾病之一（Dong et al., 2015; Chokmangmeepisarn et al., 2021; Nguyen et al., 2025）。这些革兰氏阴性、运动能力强的杆状细菌会感染多种淡水鱼类，导致特征性的外部和鳃部病变，如皮肤侵蚀、鳞片脱落、鳍部腐烂以及鳃部坏死，常常导致高死亡率。致病菌种具有重叠的宿主范围，并具有相似的表型和生化特征，这限制了使用传统诊断方法进行可靠的物种鉴定（LaFrent et al., 2019; Mabrok et al., 2020）。准确的物种鉴定对于公共卫生和兽医学至关重要，因为它是可靠诊断、深入的流行病学分析以及实施有效的疾病预防和控制策略的基础（De Benedictis et al., 2022）。此外，先前的研究（Chokmangmeepisarn et al., 2021; Nguyen et al., 2025）报告了F. oreochromis和F. covae在抗菌素耐药性方面的差异。尽管这两种细菌引起的临床症状通常相似且难以通过表型区分，但对它们进行物种鉴定仍对疫情调查、流行病学监测以及优化水产养殖中的治疗和疾病管理策略具有重要意义。

在之前的研究中（Sayed et al., 2023），通过SDS-PAGE分离后利用质谱技术鉴定了几种分泌的细胞外产物（SEP），其中包括一种含有β桶结构域的外膜蛋白。分泌的细胞外产物被广泛认为对细菌毒力和宿主-病原体相互作用具有重要作用，在黏附、免疫调节和宿主组织损伤过程中起关键作用（Hynes and Sloan, 2016; Kuipers et al., 2018; Mekasha and Linke, 2021; Thunes et al., 2023）。从分子诊断的角度来看，编码功能性重要外膜蛋白的基因是理想的靶标，因为这些基因受到进化约束，在物种内部保持序列稳定性，同时在物种间具有足够的变异以实现对物种的可靠区分。

基于这种β桶外膜蛋白的检测和功能重要性，选择了相应的蛋白质编码基因，对包括F. columnare、F. covae、F. davisii和F. oreochromis在内的密切相关的Flavobacterium物种进行了比较序列分析。这项分析旨在探讨物种内部的和物种间的序列变异模式，并评估该基因作为物种鉴别分子标记物的适用性。由于F. oreochromis和F. covae是泰国柱状病最常见的致病菌，因此进一步开发了一种用于特异性和可靠检测的双链PCR方法。

部分摘录

细菌菌株

本研究使用的所有细菌菌株均来源于素罗坤大学兽医科学学院鱼类传染病卓越中心（CE FID）保存的培养菌株。共有30株Flavobacterium oreochromis（FO）和10株Flavobacterium covae（FCOV）菌株，它们均来自临床诊断为柱状病的鱼类，最初通过16S rRNA基因测序进行鉴定。

基于β桶蛋白基因的Flavobacterium物种的系统发育关系和序列一致性分析

基于外膜β桶蛋白基因的核苷酸序列的系统发育分析显示，这些细菌明显分为两个主要分支。分支I包含三种密切相关的物种：F. covae、F. columnare和F. davisii>，而F. oreochromis形成了一个独立且得到充分支持的分支（分支II）。在分支I内部，菌株进一步分化为各自的亚支。所有F. covae菌株聚集在一起，与F. columnare和F.明显区分开来。

讨论

在本研究中，一种编码外膜β桶蛋白的基因被用作开发双链PCR检测方法的替代分子靶标，该方法能够区分泰国经济重要鱼类中与柱状病相关的密切相关的Flavobacterium物种。基于该基因的系统发育分析明确将F. oreochromis与F. covae、F. columnare和F. davisii区分开来。

结论

总之，本研究证明，编码β桶外膜蛋白的基因是一种可靠的分子标记物，可用于基于比较序列分析区分密切相关的Flavobacterium物种。所开发的双链PCR检测方法能够灵敏且特异性地检测到F. oreochromis和F. covae>，这两种细菌是泰国经济重要鱼类柱状病的主要致病菌。

CRediT作者贡献声明

Pimwarang Sukkarun：数据可视化、方法设计、实验实施、资金获取、数据分析、概念构思、撰写——审稿与编辑、初稿撰写。Kamolwan Khianchaikhan：数据可视化、方法设计、实验实施、数据分析、撰写——审稿与编辑、初稿撰写。Dung Ho My Nguyen：项目监督、资源调配、概念构思、初稿撰写。Channarong Rodkhum：项目监督、资源调配、概念构思。

资金支持

拉贾曼加拉科技大学斯里维贾亚分校（RMUTSV）2025财年的收入预算资助（研究项目编号：4807277）。

致谢

联系信箱：

摘要

引言

部分摘录

细菌菌株

讨论

结论

CRediT作者贡献声明

资金支持

致谢

热点排行