综述：利用单分子F?rster共振能量转移研究纳米尺度运动：最新进展与创新

《Current Opinion in Structural Biology》：Illuminating nanoscale motion using single-molecule F?rster resonance energy transfer: Latest insights and innovations

　　莎拉·N·博特 | 法比安·祖德尔 | 索妮娅·施密德
瑞士巴塞尔大学化学系，马滕斯特拉斯22号，1096号楼，4058巴塞尔

生物大分子的功能依赖于其动态构象变化。虽然静态的三维结构为了解生物分子的空间结构提供了宝贵的见解，但它们缺乏时间分辨率。作为补充，单分子F?rster共振能量转移（smFRET）能够实时记录纳米尺度上的运动，从而在结构和功能之间建立了独特的联系。这篇综述重点介绍了过去两年中的最新生物学发现和方法论进展。首先，通过分子生物学核心领域的例子，我们展示了通过smFRET可以揭示的机制，这些机制补充了传统的结构生物学技术。其次，我们回顾了技术创新，特别是smFRET本身的进展、将其与其他实验的原位整合以及外位互补研究。总体而言，这些进展表明动态结构生物学的时代已经真正到来。

**引言**
生物大分子的运动对所有生命系统都至关重要。特别是分子间的相互作用以及蛋白质和核酸的构象重排[1]，这些都可以利用单分子技术（如光镊、纳米孔或单分子F?rster共振能量转移（smFRET）[2]进行研究。smFRET具有强大的时空分辨率，能够在不拉伸的单分子中沿特定反应坐标检测纳米尺度上的重排，即使这些变化在整个分子集合中是不同步发生的。为此，生物分子会被特异性地标记两种小型有机荧光团——供体和一个受体（图1a），有多种标记策略可供选择[3, 4, 5??]。在兼容的供体和受体荧光团之间，通过它们的转动态偶极矩相互作用可以发生能量转移，这种能量转移率kT与荧光团间距的六次方成反比（kT ∝ r?6）。实际上，这可以实现约2到8纳米的（亚）纳米级空间分辨率，具体取决于所选的荧光团对（图1b）[6]。因此，可以根据两种荧光团的反相关荧光强度或通过FRET引起的供体荧光寿命缩短（即供体处于激发态的时间）来光学检测各种分子运动。

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**图1. 单分子FRET概述：**
(a) 生物分子被特异性地标记有FRET供体（D）和受体（A）荧光团（这里是Argonaute2 [20]，PDB: 4W5N [21]）。
(b) 在其功能循环中，生物分子采取不同的构象状态S1、S2和S3，导致不同的荧光团间距，这些间距可以通过测量的FRET效率及其已知距离依赖性来检测。
(c) 时间分辨的smFRET测量揭示了目标分子访问的构象状态的时间和顺序（卡通表示）。任一荧光团的光漂白（PB）标志着观察的结束。最终结果是描述观察到的构象动态的热力学状态分布和完整的动力学速率模型。

根据研究的生物分子动力学，smFRET测量可以使用共聚焦显微镜或全内反射荧光（TIRF）显微镜进行。共聚焦实验主要用于研究纳秒到几毫秒时间尺度上的快速过程，例如在内在无序蛋白质中的构象变化[7]、跨域运动[8]或折叠路径[9]。为此，自由扩散的分子在通过飞秒大小的共聚焦体积时被依次测量，产生短暂的荧光脉冲，使用点探测器检测。相比之下，TIRF显微镜可以并行观察许多固定在表面的分子在较长时间内的变化，通常使用分辨率≥毫秒的相机探测器。由此产生的smFRET时间迹线可以直接观察较慢的动力学过程（即跨越更高能量障碍的过程），这些过程对折叠蛋白质的功能至关重要[10, 11, 12??, 13]或核糖开关[14,15]。这两种实验都能解析构象和相互作用动态，从而确定动力学速率、状态分布和反应路径（图1c）。此外，单分子FRET轨迹（图1c）可以区分FRET效率直方图中的多个峰值是由不同共存物种的混合（静态异质性）还是由动态转换的物种（动态异质性）引起的。

与smFRET不同，集合实验是对大量分子进行平均，从而导致构象异质性的模糊，并且无法检测稀有状态和可逆的稳态过程（表1）。同样，结构生物学技术如X射线晶体学和冷冻电子显微镜（cryo-EM）提供了最稳定状态的高分辨率静态结构，但由于集合平均而难以解析灵活区域或瞬态状态。尽管较新的方法（如时间分辨冷冻电镜）旨在通过连续的集合平均来解决非平衡条件下的松弛过程，但它们仍然受到该方法固有平均需求的限制[16,17]。因此，在所有热力学条件下（表1），这两类技术在测量随机发生且在整个集合中不同步的生物分子动力学方面都存在根本限制。smFRET克服了这一限制，能够直接观察动态过程，从而补充了静态但空间分辨率很高的三维结构，提供了从纳秒到秒的时间信息。

**表1. 不同技术在各种热力学条件下获得的结果比较。** 时间分辨的单分子技术能够在所有三种条件下解析生物分子动力学，提供热力学和动力学见解。不需要分子同步。集合技术提供时间不变的集合平均，除非系统被驱动出平衡状态以观察平均松弛率（单指数或多指数；时间常数τ是所有共存逃逸率kesc,i的倒数和）。结构生物学技术具有很高的空间分辨率，但通常没有时间分辨率，除非系统被驱动出平衡状态。因此，集合平均的动力学表现为“运动模糊”（即均方根偏差RMSD增加）。单分子技术的独特优势在于它们能够研究所有热力学条件，包括生物细胞和其他环境中的稳态条件。

尽管最近有几篇综述详细介绍了smFRET的理论和技术原理[18,19]，这篇小型综述重点关注了过去两年中的最新生物学发现和技术创新，主要关注图1中所示的单分子轨迹。我们总结了smFRET如何用于揭示生物学核心领域中的生物分子动力学，从DNA转录和RNA翻译到各种系统中的蛋白质构象变化，特别强调了该方法如何在静态结构和动态机制之间架起桥梁。此外，我们还讨论了smFRET工作流程各个阶段的方法论创新，并探讨了将smFRET与互补技术结合以全面理解生物分子动态功能的方法。最后，我们对smFRET在结构生物学中的推动作用进行了总结，总结了取得的重大发现和技术进展，并指出了这一强大技术的未来前景及其下游影响。

**从基因组到蛋白质组：对动态分子机制的洞察**
我们首先介绍了smFRET在分子生物学核心领域的应用，从基因组开始，经过RNA转录和翻译，到蛋白质的功能状态，有时也包括功能失调的状态。

**DNA处理和转录中的动态相互作用**
最近的smFRET研究表明，复制蛋白A（RPA）如何结合和组织单链DNA（ssDNA）。RPA仅导致ssDNA末端到末端的平均距离发生微小变化，暗示部分DNA缠绕在RPA周围[22]。此外，在ssDNA链转移机制（SSB:DNA:RPA，其中SSB是一种单链DNA结合蛋白）中发现了短暂的三元中间体，证实在此过程中ssDNA始终保持屏蔽状态[23]。除了复制之外，smFRET还直接为几种动态DNA修饰机制提供了证据。例如DNA重组机制[24]、Cas12a在DNA结合时的别构激活[25]，或CasX的RNA引导的DNA靶向和切割动力学[26]。FUS的低复杂度结构域FUS-LC是参与无膜细胞器形成的关键驱动因素，这些细胞器与基因组组织和RNA处理有关。共聚焦时间分辨smFRET在液-液相分离过程中揭示，单体FUS-LC存在于紧凑和部分伸展的构象中。相分离诱导链扩展、构象异质性增加以及液滴内结构亚群之间的缓慢转换，这与FUS中分子内和分子间接触的动态切换一致[27]。此外，关于所谓的表达组（即RNA聚合酶（RNAP）、信使RNA和核糖体的复合体，以及它们如何将DNA转录与RNA翻译耦合的问题一直存在（图2a）。通过直接观察表达组的三种状态——解耦、松散耦合和耦合——smFRET揭示了该复合体的物理本质[12]。值得注意的是，即使它们相隔数百个核苷酸，也能观察到RNAP-核糖体的耦合，且smFRET结果表明这种长距离耦合普遍存在，并能有效防止RNAP暂停[12]。

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**图2. smFRET解决了生命各个领域及各种亚细胞位置中的生物分子问题。**
D：供体，A：受体。
(a) ‘表达组’中核糖体（蓝色和黄色）与RNAP（灰色）之间的松散耦合由mRNA（红色）促进，可以跨越长距离。如图所示，smFRET观察到三种不同的群体，显示出核糖体和RNAP之间的不同距离。
(b) mRNA帽识别机制涉及非生产性的帽区分（左）和成功的帽识别（右），由起始因子eIF4E:G（紫色色调）完成，它们在帽附近或远端的mRNA（绿色）上结合。smFRET实验表明，帽远端结合力量弱且持续时间短，而帽近端结合持续时间较长，导致激活和核糖体组装。
(c) 放线菌表面蛋白InlB（蓝色）与哺乳动物MET受体（灰色）结合并诱导其二聚化。这一过程在活细胞膜上进行了空间追踪（左上角面板以绿色线状图示），同时测量smFRET（底部行；荧光强度和FRET效率曲线），以确定MET的定位和寡聚状态。
(d) 通过三色实验观察底物通过ClpB伴侣蛋白的传输，显示双向超快底物传输，A1和A2受体的发射顺序显示了前向方向的75%偏置。

**翻译抑制、启动和终止机制**
翻译可以通过多蛋白复合体选择性沉默。例如，在控制雌性果蝇中masl-2 RNA翻译的抑制复合体中，smFRET揭示了一个协同组装途径，其中Sxl和Unr蛋白相互加速彼此的结合速率超过两个数量级[13]，说明了在这种情况下协同的RNA-蛋白复合体如何调节翻译启动。更一般地，真核生物中翻译启动的主要途径涉及帽识别，由起始因子复合体eIF4F（由eIF4A、eIF4E和eIF4G组成）协调。根据smFRET的结果，现有的教科书观点需要重新评估，发现eIF4G既与帽近端位置也与我们近端的结合位置以不同的动力学相结合。然而，有效的启动需要帽近端结合，这通过抑制复合体的解体和回收来稳定复合体，通过直接观察早期启动步骤得到证实（图2b）[28]。

此外，smFRET还被用于研究翻译延伸过程，包括非天然苯丙氨酸衍生物如何影响三元复合体的形成和核糖体的利用，为合成生物学提供了见解[29]。最终，翻译终止需要I类释放因子（如RF2）来催化终止密码子处的肽链切割。虽然结构快照暗示了可能的中间体，但终止过程中的事件顺序直到最近的smFRET研究才被直接揭示。具体来说，观察到多个RF2结合的中间体，最终聚合并形成一个RF2紧密结合在P位点tRNA上的构象。从那里，RF2可以进入水解活性状态并最终从tRNA上切割新生多肽链[30]。这一多步骤途径很好地展示了smFRET解析短暂结合级联甚至瞬态中间体的能力。

**别构调节和蛋白质的质量控制**
精细调整的构象变化对蛋白质功能至关重要。许多细胞表面受体通过变构机制将细胞外信号传递到细胞内部，其中外部效应物会诱导受体发生构象重构。例如，G蛋白偶联受体（GPCR）mGlu2在神经元兴奋性和突触传递中的核心作用是通过变构调节的。然而，变构的分子机制直到最近的一项共聚焦smFRET研究才得到充分的解释，该研究直接绘制了激动剂诱导的结构域关闭和亚基间重新定位的构象状态，发现仅有正交结构的激动剂能够稳定关闭状态，而完全激活则需要变构调节剂或G蛋白[31]。三色smFRET随后同时报道了这两个构象坐标，揭示了一个隐藏的部分关闭中间态以及协调的亚基运动，展示了smFRET如何以前所未有的分辨率解析多亚基耦合[5]。整合素作为细胞外基质配体与肌动蛋白细胞骨架之间的桥梁，其构象激活发生在配体结合时，从低亲和力的关闭状态转变为高亲和力的伸展状态。这种激活机制涉及不同结构元素的协调伸展和头部结构的打开，对于细胞迁移和粘附非常重要[32]。受体酪氨酸蛋白激酶MET可以被李斯特菌劫持，其表面蛋白InlB与MET结合，导致其二聚化以促进宿主细胞进入。结合smFRET和光漂白后荧光恢复（FRAP）技术，揭示了MET:InlB复合物的不同构象状态和二聚体解离事件，提供了超出静态结构信息的洞察[33,34]。作为细胞蛋白质质量控制的一部分，AAA+解聚酶ClpB通过将其中央孔道穿过聚集的蛋白质来拯救这些蛋白质，先前的研究表明这种过程是由单向的动力冲程驱动的。利用smFRET技术，检测到中央孔道环与ClpB的核苷酸状态之间的变构耦合[35]，以及毫秒级的底物转移[36]。与早期假设相反，研究发现底物转移虽然本质上是双向的，但具有大约75%的前向偏置，并且前向速率快三倍，这与布朗棘轮机制（而非动力冲程机制）一致。由于客户蛋白的穿插过程在能量上非常高效，因此可以解释之前关于酶促激酶和解聚速率之间的一些差异。其他几项smFRET研究还研究了伴侣蛋白的动态，这些蛋白在蛋白质折叠、展开和成熟过程中起着重要作用，包括最近综述的Hsp90和Hsp70家族[37,38]，为此还提出了新的smFRET实验方法。总体而言，从保护复制叉到回收聚集的蛋白质，smFRET帮助揭示了瞬态中间态、异质性路径、协同组装过程、变构机制及其相应的动力学。凭借其独特的时空分辨率，smFRET成为补充甚至有时细化静态结构或集合平均数据得出的机制的重要工具，从而实现对分子生物学核心机制的动态理解。

技术进步
过去两年的方法学进展包括FRET技术的改进，以及smFRET与互补技术的原位和体外结合，如表2所示。表2总结了过去两年在smFRET方面的方法学进展。其中两项研究配有插图（相关技术用粗体标出[53],[65]）。高通量共聚焦smFRET使得能够在96孔板中自动筛选多种实验条件。图改编自参考文献[53]。体外结合冷冻电镜（cryo-EM）和smFRET技术，利用糖受体α3β的电子密度图以及smFRET实验（供体D；受体A）的时间分辨信息，揭示了其灵活的游离状态和 rigid的糖结合状态（图改编自参考文献[65]。

FRET技术改进
•荧光团模型[51,52]
•去噪[47, 48, 49]
•抗漂白试剂[43,44]
•生物正交标记[5,31,39,40]
•荧光团[41,42]
•高通量[53,60,61]

原位与体外结合
•寿命测量[54,56,58]
•定位[33,34,54,55]
•GET[58]
•纳米孔[57]
•分子动力学（MD）模拟[22,33,35,51,57,58,68]
•冷冻电镜[63, 64, 65??, 66]
•核磁共振（NMR）[67]

F?rster共振能量转移特定改进
合适的荧光团和标记策略对于任何smFRET实验都至关重要。新的协议实现了RNA的特异性末端标记[39]和质粒的位点特异性标记[40]。对于多色FRET实验，开发了一种三重生物正交标记策略（使用SNAP-Tag和两种非天然氨基酸分别实现叠氮-炔环加成和Diels-Alder环加成），这导致了先前用双色smFRET无法检测到的GPCR中间态的发现[5]。新的荧光团，如有机荧光团PhoenixFluor555，具有出色的光稳定性和荧光恢复特性，使得测量时间比标准荧光团探针长一个数量级[41]。对于多重实验，描述了一种包含41对分离的DNA供体-受体对的完整调色板。这些所谓的FRET荧光团提供了不同的受体荧光、供体荧光和供体寿命，并能够在核苷酸和蛋白质的异质混合体中同时检测不同目标，同时考虑了它们在不同环境下的微妙光物理变化[42]。此外，为了最小化光漂白效应，报道了一种基于Na2SO3的氧清除系统作为酶基清除剂的替代方案[43]，并且从环状8π电子化合物计算得出了一类新的潜在三重态淬灭剂[44]。作为一种替代不可逆结合荧光团的光稳化方法，使用可逆结合的荧光探针可以持续数小时观察给定分子的构象变化，从而可能带来概念上的新见解和更高的数据可信度[45,46]。

实现最佳信噪比是一个普遍目标，可以通过实验方法实现[47,48]，并通过分析过程中的去噪部分解决[49]。实验上，通过精确的DNA折纸技术在两个金纳米球之间定位FRET荧光团，光子计数率可以提高一个数量级[47]，并且使用光流控天线将发射光高效引导至检测器，光子收集效率提高了5倍[48]。在分析方面，基于深度学习的去噪方法MUFFLE经实验验证可以准确解释smFRET轨迹，所需的光子计数仅为无需去噪时的十分之一[49]，并且在几乎可实现的测量时间方面与早期的SMACKS方法相当[50]。此外，大多数smFRET研究都基于各向同性的偶极子近似：它认为供体和受体之间的相互转换偶极子取向可以用常数κ2= 2/3来近似，当荧光团取向的时间平均与荧光寿命相比是各向同性的且快速时成立。一项结合分子动力学（MD）模拟和共聚焦smFRET测量无序蛋白质的研究量化了这些κ2假设的局限性，同时自由拟合特征时间尺度参数。研究发现，即使荧光团重定向和荧光寿命处于相似的时间尺度（即纳秒级），κ2相关误差也小于FRET效率的实验不确定性[51]。然而，在某些情况下（例如染料的各向异性旋转行为），除非使用更精确的偶极子取向模型，否则可能会出现荧光寿命和FRET效率的不准确性[52]。最后，最近发表了一种自动化多孔板方法进行共聚焦smFRET，可以在多种实验条件下进行筛选[53]。该方法应用于DNA发夹动态、蛋白质折叠和蛋白质-药物相互作用的研究，展示了其在广泛研究问题中的多功能性。总之，过去两年的方法学进展通过改进的探针、标记协议、采集策略和分析方法解决了smFRET实验中的剩余限制。

单分子F?rster共振能量转移与其他技术的结合
光学检测实现的耦合时空分辨率是smFRET的强大优势，使其能够与其他技术进行互补的原位集成，尽管这会增加实验复杂性。通过将单分子跟踪（pMINFLUX）与基于寿命的smFRET相结合，距离范围从4纳米到100纳米变得可测，适用于长距离蛋白质-蛋白质相互作用，并通过DNA折纸技术得到了验证[54]。此外，将smFRET与超分辨率跟踪（SpeedyTrack）结合，可以同时检测分子运动和构象变化，利用电子倍增电荷耦合器件（EM-CCD）的快速垂直电荷转移效应。每次微秒级的曝光后，累积的电荷会逐步转移到存储区域，从而产生一个空间编码的时间序列，该序列以300微秒的帧率捕捉分子运动（即扩散系数）和基于FRET的构象状态，这在DNA发夹结构上得到了验证[55]。接下来，在单分子荧光寿命成像（sm-FLIM）设置中，使用单光子雪崩二极管（SPAD）阵列实现了基于寿命的FRET观测单分子通量约300倍的提升，尽管代价是寿命精度降低了三倍，并且需要较大的光子预算（与时间相关的单光子计数TCSPC相比[56]。此外，纳米孔技术与smFRET结合，实现了无串扰的光电读出。这种方法用于探测纳米孔陷阱中生物分子（这里是核小体）所经历的电场效应，作者还展示了使用优化电压序列实现的未受干扰的捕获[57]。石墨烯能量转移（GET）是一种很好的跨领域结合技术，能量转移从供体荧光团传递到固态石墨烯平面，距离依赖性为r?4（相比之下，点受体的依赖性为r?6）。使用GET技术，可以在石墨烯上的垂直站立DNA螺旋上以亚纳米级分辨率敏感地分辨20°到90°范围内的DNA弯曲，揭示了DNA修复过程中的动态构象变化[19,59]。虽然该技术仅限于刚性且与石墨烯兼容的系统（如dsDNA），但GET只需要一个荧光团（GET供体），并且与FRET互补，其工作范围为7到30纳米。最后，两种类似的技术MUSCLE[60]和SPARXS[61]将下一代测序与smFRET结合，能够在序列空间中进行高度多路化的构象动力学和相互作用研究。它们的潜力通过DNA发夹杂交、Cas9目标DNA解旋和Holiday junction动态的研究得到了证明，其中测试了4096种序列变体的动力学和热力学性质[62]。常采用smFRET与互补技术的体外结合来结合3D结构与时间分辨信息[63, 64, 65??, 66]。例如，通过结合新的冷冻电镜结构和时间分辨的smFRET结果，阐明了染色质重塑蛋白Chd1的功能周期以及翻译起始因子介导的核糖体亚基结合机制[63,64]。这种静态和动态信息的结合还用于研究离子通道蛋白α3β糖受体，发现磷酸化后未结构化细胞内环的压缩与炎症条件下疼痛感觉增强有关[65]。另外，核磁共振（NMR）与smFRET结合，确定了伴侣蛋白SurA的动力学，表明其客户蛋白结合与ATP无关[67]。这里的优势在于NMR和smFRET结合了互补的长度和时间尺度。最后，将MD模拟与smFRET结合，提供了对内在无序蛋白（IDPs）在相分离背景下的动态行为的洞察，表明IDPs的动力学是连续的，而不是由离散的快速或慢速过程组成[68]。

结论与展望
生物分子的职能源于构象转变、相互作用和重排，这些过程通常在群体中不同步发生，因此无法通过集合平均或静态方法区分。基于先前的结构数据，smFRET使我们能够实时并以单分子分辨率观察这些动态变化（图3a）。通过这种方式，它提供了关于基本生物过程如何进展的见解，区分了不同的共存物种（静态异质性）以及构象状态之间的转变和瞬态结合（动态异质性，图3b）。作为独特的工具，smFRET通过解析构象状态及其连接的动力学速率，揭示了控制分子功能的热力学和动力学参数，从而建立了桥梁。

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图3. (a) smFRET直接实时解析了构象动态，例如Argonaute2（PDB: 4W5N [21]）[20]。图中用黄色到红色的渐变显示了卡通轨迹。(b) smFRET可以绘制出生物分子功能背后的复杂能量景观。三种不同的构象状态和不同的能量障碍被示意出来。高能量障碍导致缓慢的动力学，低能量障碍导致快速的动力学。在前往下一个能量最低点的过程中，分子可能会经历（多个）过渡状态。smFRET（单分子F?rster共振能量转移）已被广泛应用于分子生物学的各个方面，从DNA复制和RNA转录到翻译以及众多蛋白质系统。在DNA处理过程中，它揭示了确保基因组稳定性的短暂中间体及多个蛋白质之间的协同作用。在转录和翻译过程中，smFRET发现了RNA聚合酶与核糖体之间的动态长距离耦合，以及控制翻译 initiation 和 termination 的协同组装机制。在蛋白质层面，smFRET阐明了多种膜受体（如mGlu2、整合素、MET）的别构激活机制，直接展示了受体运动如何将外部信号转化为细胞响应。为了克服当前的限制（如信噪比低、光漂白导致观察时间短等问题），研究人员在方法学上取得了显著进展。最新进展涵盖了smFRET工作流程的各个环节：改进的荧光团和标记策略扩展了可研究的目标范围；优化的缓冲条件减少了光漂白现象；自动化的高通量实验设置使得能够高效筛选多种条件；同时，相关技术的整合进一步拓宽了可解决的生物学问题的范围。此外，更通用的人工智能辅助分析流程有望通过自动化（例如数据筛选）进一步简化数据处理过程，并加速基于smFRET的发现。总之，smFRET已成为研究隐藏的生物分子动态的首选方法，其成果充分证明了这一点。随着持续的创新，smFRET将继续揭示生物分子动态和能量学如何驱动生物功能。捕捉那些在静态结构中被平均掉的短暂中间体和稀有状态为新的研究领域打开了大门，例如在药物发现领域，这些状态可能为别构调控提供新的策略。此外，对构象动态的深入理解有助于蛋白质设计和工程，因为平衡整体稳定性和结构灵活性是优化催化循环和开发高效人工酶的关键。总体而言，smFRET是一种多功能技术，能够“让静态结构焕发生机”，为动态结构生物学中分子结构与生物功能之间的关系提供了必要的桥梁。

作者贡献：
SB & FZ：概念设计、初稿撰写、审阅与编辑、数据分析、可视化；
SS：概念设计、撰写、审阅与编辑、项目监督、资金申请。