基于机器学习的多重生物标志物检测技术，采用聚合物增强的电化学传感器

《ACS Electrochemistry》：Machine Learning-Driven Multiplexed Biomarker Detection with Polymer-Enhanced Electrochemical Sensors

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汗液和唾液中的生物标志物为非侵入性健康监测提供了有前景的途径。电化学传感器具有同时测量这些生物标志物的潜力。然而，它们在混合物中区分单个生物标志物方面存在局限性，因为氧化还原电位经常重叠，导致电流信号无法解卷积。本研究重点使用正交传感材料结合机器学习来区分生物标志物。我们介绍了一种灵活的电化学传感器阵列，该阵列包含用聚偏二氟乙烯（PVDF）或聚（4-乙烯基吡啶）（P4VP）改性的碳花电极，用于检测雌二醇（E2）、抗坏血酸（AA）、血清素（5-HT）和褪黑素（Mel）。这两种聚合物通过改变每种生物标志物的氧化还原电位和电流响应来增强信号多样性并实现峰值分离。通过对450个单一样本和混合物样本进行多输出回归分析，该阵列在从纳摩尔到微摩尔的广泛动态范围内准确预测了浓度（R2 = 0.95）。聚合物分辨分析显示，PVDF改性增强了E2和Mel的检测能力，而P4VP改性则提高了AA和5-HT的定量精度，突显了互补正交传感电极的优势。这一发现进一步得到了特征归因分析的支持，该分析表明机器学习模型依赖于特定于聚合物的电化学特征，直接将性能提升与不同的聚合物-分析物相互作用联系起来。总体而言，这些结果表明，将聚合物改性的正交电极与机器学习相结合，可以在复杂混合物中实现准确的多路传感，为未来的传感器平台开发选择性检测策略奠定了基础。

引言
人体汗液和唾液中含有许多反映体内生物过程的生物标志物。生物标志物浓度的差异可以提供关于健康和疾病状态的见解，使其成为非侵入性疾病诊断和个性化、预防性健康监测的理想选择。(1) 例如，雌二醇（E2）是女性健康所必需的激素(2)，并影响骨骼(3)和大脑(4)等主要器官。(5) 血清素（5-HT）调节情绪，并与抑郁症和创伤后应激障碍等神经系统疾病有关(5)，而外周血清素与代谢健康相关(6)。抗坏血酸（AA）是一种重要的抗氧化剂和营养指标(7)。褪黑素（Mel）影响昼夜节律和睡眠模式(8)。因此，可穿戴传感器引起了越来越多的关注(9?11)。基于碳的电化学传感器是研究最广泛的类型之一，因为它们成本低廉、稳定性高且可逆。近年来，使用金属（氧化物）掺杂(12,13)、高表面积材料(14)和导电聚合物(15)等策略，已经报道了多种电化学神经递质和激素传感器，具有高灵敏度。然而，由于特定生物标志物的共存和氧化还原电位的重叠，准确检测和量化这些标志物仍然是一个重大挑战，因为这会导致无法解卷积的电流信号重叠。此外，由于刚性（例如改性的玻璃碳电极（GCEs）或毒性（如碳纳米管），传感器通常无法满足柔软的皮肤应用机械要求。

传感器阵列为多路传感提供了解决方案。(16) 原则上，每个电极提供独特的信号模式，生成多样且可区分的信号集，从而能够识别和量化各个组分。虽然传感器阵列为实现选择性提供了可行的途径，但其信号读取、处理和解释仍然复杂，尤其是在分析物响应强烈重叠时。因此，机器学习（ML）作为一种强大的补充工具出现，可以从电化学信号中提取多变量信息，并实现超越传统基于峰值的分析的多路量化。最近的研究说明了这一趋势：使用人工神经网络（ANNs）区分了重叠的多巴胺（DA）和5-HT信号，实现了R2 > 0.97和均方根误差（RMSE）< 0.1 μM；(17) 将线性回归模型应用于循环伏安法数据（n = 45），以区分葡萄糖和胰岛素，获得了R2 > 0.98和4–6%的误差；(18) 在工程化传感器表面上使用监督机器学习模型（支持向量机（SVM）、ANN）实现了汗液和唾液中酪氨酸和尿酸的多路检测，达到了R2 = 0.85–0.95；(19) 并使用SVM、ANN和GLMNET回归检测水中的多种有毒物质，报告了23个传感器的RMSE ≈ 0.24 mg L–1。(20) 尽管取得了这些进展，但许多先前的工作受到数据集规模有限、分析物多样性不足以及缺乏明显不同的电极的限制。这些限制可能会阻碍模型泛化，并在应用于实际传感场景时增加过拟合的风险。(21) 这强调了需要更大、更真实和多路的数据集(22,23)，以及改进传感器设计、电极特异性、模型鲁棒性和标准化协议，以便在实际传感应用中部署ML。(24?26)

在我们最近的一项研究中，我们证明了引入聚（4-乙烯基吡啶）（P4VP）和聚偏二氟乙烯（PVDF）聚合物修饰会导致由于这些聚合物对不同生物标志物的吸附和扩散特性不同而产生的特定聚合物峰值偏移。(27) 我们进一步表明，这些聚合物修饰与纳米结构碳花结合使用可提高灵敏度。(28) 在这项工作中，设计了一种基于聚合物改性碳花的传感器阵列，用于检测生物标志物E2、AA、5-HT和Mel（图1a）。传感器阵列是通过将含有相应PVDF或P4VP聚合物的碳花墨水喷涂到可拉伸的聚苯乙烯-嵌段-聚乙烯-嵌段-聚苯乙烯（SEBS）基底上来制造的。我们收集了包含1个、2个、3个和4个分析物混合物的450个测量值的综合数据集，以捕捉真实的混合分析物条件。该平台与结构化的ML框架结合使用，从多路伏安信号中识别分析物浓度。该框架整合了线性、基于核的、集成和神经网络模型，以研究算法灵活性、预处理转换和特征表示如何影响预测性能和鲁棒性。通过基于Shapley Additive explanations (SHAP)的分析确保了可解释性(29)，从而能够识别与预测最相关的信号区域和特定于聚合物的相互作用。这些策略共同解决了在复杂混合物中选择性电化学检测生物标志物的长期挑战，并展示了聚合物正交传感与ML结合在可穿戴设备和即时检测应用中的潜力。

图1
图1. 概念。(a) 目标非侵入性生物标志物：雌二醇（E2）、血清素（5-HT）、抗坏血酸（AA）和褪黑素（Mel）。(b) 传感器设计示意图。(c) 双传感器阵列：每个传感器由8个涂有选择性聚合物的导电碳花电极组成——类型1：PVDF-CF，类型2：P4VP-CF。(d) 电化学传感器的照片。(e–g) 电极的SEM图像及放大视图。(h) 数据采集和ML工作流程。

实验部分
传感器制造和表征
传感器的制造遵循了我们之前工作的协议。(28,30,31) 碳花由丙烯腈前体合成，然后在氮气流下在1500°C下碳化。将制备好的碳花（45 mg）分散在含有相应聚合物（5 mg）的氯仿（100 mL）中（聚（4-乙烯基吡啶）（P4VP，Mw = 60,000 Da，Sigma-Aldrich）或聚偏二氟乙烯（PVDF，Mw = 534,000 Da，Sigma-Aldrich），使用超声波处理以获得均匀的墨水。然后将碳花墨水喷涂到具有预定义可拉伸银电流收集器图案的可拉伸SEBS（Asahi Kasei Tuftec H1052，东京，日本）基底上，使用金属掩模定义电极几何形状。使用导电z轴胶带建立电气连接，将碳花电极与扁平电缆连接器接口。每个传感器包含八个工作电极，均采用相同的聚合物配方（PVDF或P4VP）；仅使用一个电极进行电化学测试。总共制造了5个P4VP改性的传感器（ID：MC302、MC312、MC327、MC329、MC330）和3个PVDF改性的传感器（ID：MC313、MC320、MC325），并纳入本研究。扫描电子显微镜使用FEI Magellan 400 XHR仪器进行，操作加速电压为5 kV，束流电流为100 pA。

电化学测量
电化学测量使用CH Instruments 760E电位计进行，该电位计与CHI200 picoamp增强器和法拉第笼连接以减少电气噪声。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中使用方波伏安法（SWV）进行分析物检测，参数如下：0.025 V脉冲幅度，5 Hz频率，0.004 V步进电位，范围为0–0.8 V（每个迹线产生200个电流值）。使用标准的三电极设置，包括一个铂丝辅助电极、一个Ag/AgCl（3 M KCl）参比电极和分别用PVDF或P4VP改性的碳花工作电极。CHI设置允许同时测量两个电极，每次扫描产生两个相似的电流响应。为了避免后续建模中的冗余信息，仅使用第一个电流迹线进行预处理和ML分析。实验在室温下的1× PBS（pH 7.2）中进行。在测量序列开始时至少收集三次空白扫描，以捕获后续数据预处理的纯PBS响应。17β-雌二醇（>0.97，TCI Chemicals）和褪黑素储备溶液在乙醇中制备，而盐酸血清素（≥98，Sigma-Aldrich）、L-抗坏血酸（≥98，Sigma-Aldrich）、尿酸（≥98，AmBeed）、盐酸多巴胺（≥98，Sigma-Aldrich）和肾上腺素（≥99，Sigma-Aldrich）直接溶解在PBS中。分析物溶液新鲜制备后逐步加入氮气冲洗的PBS中。通常，在每个浓度步骤进行三次连续测量，每次测量之间有60秒的均匀等待时间；对于后续分析，使用这些扫描的平均值。在每次测量之前，传感器用去离子水冲洗。

数据集设计和浓度范围
对于每种聚合物涂层，数据集设计包括多样化的混合物复杂性：每种生物标志物10个单一样本（总共80个），六种生物标志物对每种15个样本（总共180个），四种三重组合每种15个样本（总共120个），四种四重组合每种15个样本（总共30个），以及40个额外随机样本。(35) 总共得到450个样本。表S1显示了跨聚合物涂层和单个传感器的完整数据集摘要，表S2提供了详细的测量和数据参数。浓度范围是根据相关生物流体中抗坏血酸和血清素的报道生理浓度水平选择的（见表S3）；对于雌二醇和褪黑素，由于传感器的灵敏度限制，选择了高于生理水平的浓度。对于PVDF改性的传感器，E2、5-HT和Mel的浓度范围为10–1000 nM，AA的浓度范围为1–10 μM。对于P4VP改性的传感器，E2、5-HT和Mel的浓度范围为100–3000 nM，AA的浓度范围为6–20 μM。

数据预处理、机器学习和性能评估
原始SWV扫描（图S1a，每个迹线200个数据点）经过预处理以减少测量噪声并增强电化学特征。首先，平均最多三个空白PBS扫描并从分析物信号中减去，然后进行Savitzky–Golay（SG）过滤（9点窗口上的三次多项式拟合）以抑制高频噪声，同时保留峰值形状和整体信号形态（图S1b）。本研究中使用的电位计（CHI750E）产生的噪声非常小，高频成分仅占总信号方差的约3.5%（信噪比约为276）。SG平滑在原始信号中提供了大约2倍的噪声降低，在导数域中提供了2.8倍的噪声降低。这些步骤确保模型基于反映真实电化学活动的信号进行训练，而不是仪器或基线漂移的伪影。

为了解决基线变化和峰值重叠问题，评估了三种信号转换策略（图S1c）：通过拟合并减去电压图边缘区域（开始和结束处的10个点）的一阶多项式进行最小中心化基线对齐，以及通过数值梯度（numpy.gradient）计算的一阶导数转换（dI/dV），这增强了峰值对比度并引入了次级极值以提高分析物可分离性。除非另有说明，否则使用了一阶导数转换，因为它产生了最佳性能。对于ML分析，直接使用预处理后的扫描，允许模型从完整的伏安信号中学习，而不假设峰值的固定数量或位置。除了电化学特征外，还包括两个分类变量：传感器标识符（ID号）和聚合物涂层类型。建模任务被构建为监督多输出回归，以预测四种生物标志物（E2、AA、Mel和5-HT）的浓度。为了防止重复测量中的数据泄露，在分割过程中按样本ID对样本进行分组。对于每个随机种子（0, 42, 1337, 2023, 9999），使用GroupShuffleSplit（90/10）生成一个独立的保留测试集。剩余的90%数据用于模型开发，并进行5折GroupKFold交叉验证。训练和验证指标是通过五个交叉验证折叠的平均值计算得出的，每个种子都进行了计算，而测试指标是在相应的保留测试集上评估的。所有报告的性能值都以五个随机种子的平均值±标准差给出。数值特征使用StandardScaler标准化为零均值和单位方差，该标准化器仅基于训练数据拟合，并随后应用于验证和测试集，而分类特征则进行了one-hot编码。实现了六种代表不同学习范式的回归算法，以探索模型复杂性和归纳偏差如何影响从多重伏安信号中的预测：Ridge回归（作为具有正则化的线性建模的基线）、随机森林和XGBoost（适用于非线性表格数据的基于树的集成）、k最近邻（非参数局部模型）、支持向量回归（用于非线性信号关系的基于核的方法）以及多层感知器（MLP，一种能够捕捉复杂非线性的小型神经网络）。超参数使用网格搜索交叉验证在交叉验证循环内进行调整；保留的测试集未用于模型选择。参数范围是根据先前的生物传感ML文献（22,23,32）指导并迭代细化的。对于模型在没有分析物的情况下预测非零浓度的错误情况，使用了图3中所示的零感知两阶段架构进行了缓解。在这种方法中，首先使用多输出二分类（标签：y > 0）将每个分析物分类为存在或不存在，然后使用多输出回归预测浓度。在推理时，根据分类器的决策来控制回归输出，当预测分析物不存在时将其设置为零。这可以抑制“假阳性”，同时保留分析物存在时的回归性能。在评估之前，负浓度预测被裁剪为零，以确保物理上的合理性，当非零的真实样本被预测为零时，这可能会导致100%的相对误差。

预测准确性使用互补指标进行评估。决定系数（R2）量化了解释的方差，而均方根误差（RMSE）强调了较大的残差，这在生物传感应用中尤为重要，因为异常值可能代表传感器伪影。平均绝对误差（MAE）提供了跨分析物的平均预测误差的更易解释的度量。保留了训练和验证分数以评估潜在的过拟合，并使用预测值与真实值对比图来可视化系统偏差。还检查了残差分布，以识别浓度范围内的潜在系统偏差。使用KernelExplainer计算了SHAP特征重要性，每个折叠使用100个解释样本和100个背景样本（从训练集中的200个样本池中随机抽取）。对于代表性的分割（种子=42），计算了SHAP值，并在五个交叉验证折叠中进行了平均。为了评估稳定性，我们验证了特征排名在不同背景样本大小下保持稳定（图S2）。

结果与讨论
可穿戴传感器阵列需要具有皮肤适应性、低成本生产、简单的制造工艺和高通量能力。我们的制造工艺满足了这些要求。传感器设计如图1b所示，包括可拉伸的SEBS基底、导电的可拉伸银互连、正交的碳基电极、SEBS封装层和平坦的电缆连接器。传感电极是通过喷涂包含碳花的电极墨水制成的，这些碳花可以使用PVDF或P4VP（图1c）。这种简单而稳健的制造技术非常适合传感器阵列，并且可以很容易地适应和扩展以包含额外的聚合物修改。图1d显示了封装和平坦电缆连接之前的PVDF-碳花（PVDF-CF）传感电极的照片。SEBS基底是柔性的且适合皮肤，非常适合可穿戴应用。图1e显示了传感电极的代表性SEM图像，图1f是放大视图。碳花的直径约为1微米（图1g），并通过聚合物粘合剂连接。由于碳花在电化学传感中的有益特性，因此使用了碳花，这些特性归因于它们的独特形态、富含缺陷的结构和高导电性。重要的是，尽管聚合物粘合剂并没有均匀覆盖所有碳花，但我们之前已经证明聚合物对电化学性能的影响仍然存在。

数据收集和机器学习工作流程如图1h所示。收集了包含单分析物、2种分析物和4种分析物混合物的450个样本的全面数据集。数据预处理包括空白值减除、过滤和导数转换（图S1）。在预处理数据上训练了包括Ridge回归、多层感知器（MLP）、随机森林（RF）、XGBoost（XGB）、支持向量回归（SVR）和k最近邻（KNN）在内的机器学习算法，并使用表现最好的算法来预测分析物浓度。总体而言，这种模块化平台架构结合了广泛可用的机器学习方法，使得可以轻松集成额外的电极类型，从而丰富特征集，从而便于区分复杂混合物中的更广泛分子。

代表性的伏安图展示了聚合物修改的效果（原始数据见图S3）。为了强调氧化电位的移动，我们在图2a中展示了每个生物标志物的标准化伏安图。每种聚合物-生物标志物对都表现出特征性的氧化电位，反映了聚合物依赖的相互作用。例如，E2在PVDF-CF上显示出明显的氧化峰，位于0.50 V。相比之下，P4VP-CF电极在0.64 V检测到雌二醇。在测试不同浓度时，峰值电流会变化，而氧化电位保持不变。这种显著的140 mV的氧化电位移动是聚合物涂层的特征，对于实现选择性检测至关重要。这可能与扩散和吸附特性的改变有关。

图2
图2. 选择性检测原理。
(a) 单个分析物（E2、AA、5-HT和Mel）的PVDF-CF和P4VP-CF的标准化SWV数据（三种不同的E2浓度）。
(b) 氧化峰电位，PVDF-CF更好地区分了E2（绿色）和Mel（紫色），而P4VP-CF更好地分离了AA（红色）和5-HT（黄色）。误差条代表三个单独制造的传感器。
(c) 成对和(d) 四种分析物混合物的伏安图。

对于5-HT和Mel也观察到了类似的趋势：在PVDF-CF下，氧化峰出现在较低的电位，而在P4VP-CF下则移动到较高的电位。值得注意的是，5-HT表现出两个氧化峰，这可能源于首先氧化为碳正离子，然后氧化为醌亚胺，如先前报道的那样。有趣的是，AA表现出相反的行为：P4VP-CF将峰移动到较低的电位，而PVDF-CF将其移动到较高的电位。请注意，尽管所有测量都是在PBS中进行的，但在人工唾液和不同盐浓度下的雌二醇检测行为与我们之前的工作相似。

这些聚合物诱导的电位移动构成了定量电化学分析的基础，并使机器学习模型能够区分和分解混合物中的重叠信号。两种聚合物之间分析物峰位置的相对分离在图2b中明显不同。在PVDF-CF上，AA和5-HT的峰更接近，而E2和Mel分离得很好。相反，P4VP-CF在AA和5-HT之间提供了清晰的分离，而E2和Mel的峰重叠。这种互补行为突显了通过聚合物修改实现的正交选择性。

这些发现的重要性在分析物混合物测量中变得更加明显。在2种分析物的混合物中，PVDF-CFs将E2和Mel解析为两个独立的峰，与单分析物测量结果一致（图2c，原始数据见图S3e）。同样，P4VP-CFs也分离了AA和5-HT信号。然而，在4种分析物的混合物中，PVDF-CFs无法区分AA和5-HT，而P4VP修饰的电极显示E2和Mel的信号重叠（图2d，原始数据见图S3f）。虽然基本的回归方法可能足以处理图2中显示的示例，但当分析物以非常不同的浓度存在时，如生理样本中常见的情况（例如，当补充维生素C时），反卷积变得越来越具有挑战性。这激发了使用机器学习模型的动机，这些模型可以学习和利用聚合物依赖的峰移动和信号形状来实现稳健的多重生物标志物检测。

图3总结了所提出的机器学习框架在各种分析物、误差指标和模型架构上的预测性能，使用了组合数据集上的导数预处理。图3a-d显示了使用表现最好的MLP模型在代表性训练-测试分割上获得的预测浓度与实验测量浓度的对比（线性轴见图S4a-d）。为了减少错误的非零预测，在没有分析物的情况下应用了分类器门控掩蔽（图S4e）。这种掩蔽导致性能略有提高（即，Mel的测试R2从0.969增加到0.972），因此仅用于图3中显示的分析。对于所有四种分析物，预测值紧密跟随身份线，决定系数（R2）超过0.91。AA的R2略低，可能反映了传感器对这种生物标志物的敏感性降低。对于这个代表性分割，模型在所有生物标志物上的平均R2为0.947。表S4提供了所有六种回归模型和分析物的全面多种子比较，报告了五个随机种子的平均值±标准差，表1中提供了总结。RF和XGB显示出较大的训练-验证R2差距（即，训练R2较高而验证/测试R2较低），这与过拟合一致，而MLP则表现出较小的泛化差距，同时实现了最佳的总体测试指标。

图3
图3. 关键机器学习性能。代表性MLP模型（种子=42）的预测浓度与真实浓度（对数-对数）和R2值：
(a) E2，
(b) Mel，
(c) 5-HT，
(d) AA。
对于这个代表性分割，使用了零感知两阶段架构（分类器→回归器），当分类器预测分析物不存在时，回归输出被设置为零，以抑制错误的非零预测。
(e) E2预测的相对MAE范围（0–10%和10–20%）。
(f) 分析物之间的相对预测误差分布。
(g) MLP模型的学习曲线，显示了训练集大小函数的训练和验证R2。
(h) 与先前报道的电化学机器学习传感研究的比较；请注意，报告的R2指标可能取决于研究是针对校准、交叉验证还是保留的测试集（见表S5）。

表1. 总体模型性能
a模型 R2 MAE (nM) RMSE (nM)
Ridge 0.61 110 20144
RF 0.82 849 279
KNN 0.82 845 376
XGBoost 0.84 847 575
SVR 0.89 241 469
MLP 0.90 840 964
MLP（最佳分割）0.94 731 254

使用组合数据集上的导数预处理，对所有四种分析物和五个随机种子平均的测试指标。最佳分割：MLP种子42，带有分类器门控掩蔽。

对于雌二醇和血清素，即使在数十到数百纳摩尔的浓度范围内，也保持了稳健的预测准确性（图S4f–h），显示出在宽动态范围内的稳定性能。虽然进一步的灵敏度提升对于汗液和唾液中的非侵入式测量是有利的（有时需要的灵敏度在pM范围内），但目前的结果已经表明了强大的预测能力。重要的是，这些数据是使用多个传感器在几天到几周的时间内获得的，无需校准：如图S5所示，观察到绝对峰电流的明显传感器间变化，这可能是由于不同的电化学表面积造成的。相比之下，氧化电位仅显示出最小的变化（即，PVDF-CF为0.532 ± 0.026 V，P4VP-CF为0.679 ± 0.002 V），这表明聚合物诱导的移动具有高度的可重复性。在37天的操作期间，我们观察到E2峰电流降低（从2.45 nA降至0.84 nA），氧化电位增加（即，从0.52 V升至0.60 V）（图S6）。来自同一制造批次的同一基底上的电极之间的几乎完美的重叠（图S7）支持了每个传感器基底使用单个电极进行机器学习训练。尽管存在传感器间变异性和时间漂移，机器学习模型仍能准确预测分析物浓度，这进一步强调了传感器平台和机器学习框架的稳健性。噪声鲁棒性分析进一步表明，当应用SG平滑处理时，模型在额外噪声高达2%的情况下仍保持R2 > 0.79（图S8）。

除了R2之外，还使用平均绝对误差（MAE）评估了预测准确性，例如在图3e中为E2在0–10%和10–20%误差范围内进行了示例性展示。MAE提供了一个补充的、考虑尺度的绝对预测误差度量，并使得定量准确性的直观解释成为可能。大约30%的预测落在0–10%范围内，另外30%落在10–20%范围内。较大的误差可能归因于系统的复杂性（即，测试具有相似氧化电位和不同浓度范围的分析物），以及传感器间的变异性和随时间的变化。这些因素的结合降低了我们传感器的准确性，但代表了一个更现实的方案。所有生物标志物的相对误差分布总结在图3f中，相应的MAE值和标准差报告在图S4i,j中。对于这种代表性的分割，只有E2（4/71个非零样本）观察到超过100%的相对误差。对于AA、5-HT和Mel，最大相对误差恰好达到100%，这是由于负回归输出被裁剪为零所致。尽管个别预测误差可能达到几十个百分点，但模型始终保持了所有生物标志物的浓度依赖性趋势。使用传统的基于峰值的分析方法或单变量分析方法，对于具有如此强烈重叠伏安信号的生物标志物数据集来说，这是几乎无法实现的。重要的是，这些生物标志物的生理变化通常跨越一到两个数量级（例如，昼夜间的褪黑激素水平变化可达100倍），这表明所达到的准确性足以分辨出生物学上有意义的变化。

将我们的工作与现有技术进行比较本质上具有挑战性，因为之前的研究是在高度可变的条件下将机器学习应用于电化学传感器的，包括生物标志物数量、样本大小、传感器类型和测量环境的差异。为了进行有意义的比较，我们关注四个关键参数：样本大小、生物标志物数量、R2值和目标浓度范围（图3h，详细信息见表S5）。我们的工作之所以突出，是因为引入了一个数据集，该数据集不仅规模大得多（450个样本，几乎是大多数先前机器学习研究的十倍），而且更加多样化，涵盖了广泛的浓度范围（低至nM）和复杂的混合物（最多四个生物标志物），同时实现了可比的R2值。尽管我们故意选择了在狭窄电位窗口（0.2–0.8 V）内氧化的生物标志物，这增加了信号反卷积的难度，但我们仍然实现了这一点。然而，需要注意的是，一些先前的研究是在真实的人体液体中进行的，这引入了我们的当前工作未涉及的额外复杂性。

总体而言，我们将我们系统的强大性能归因于使用了聚合物改性的电极修饰，这增强了峰分离并使得信号反卷积更加有效，如图2所示。此外，严格的验证，包括交叉验证和在五个随机种子上的评估，确保了对模型泛化能力的稳健评估。学习曲线分析（图3g）表明，MLP模型的测试R2值尚未随着数据集大小的增加而趋于平稳，这表明额外的训练数据可能会进一步提高预测准确性。通过使用褪黑激素的真实浓度作为代表性例子，进一步评估了潜在的系统性预测偏差（图S4l）。总之，我们的工作结合了聚合物改性的传感器、大型且富含混合物的数据集以及多种子验证，从而能够对多重电化学机器学习性能进行稳健评估，并为研究更复杂的、生理相关的液体提供了基础。

为了探索聚合物改性的重要性，我们分别在PVDF-CF和P4VP-CF数据集上训练了优化后的模型，并比较了它们的性能（图4和表S6）。所有模型都使用相同的超参数搜索空间进行了调整，并且在评估时没有应用分类掩码，以确保公平和一致的比较。请注意，图4的目标是说明聚合物效应，而不是关注绝对性能，因为单独评估聚合物会将数据集减半，而数据分割会降低绝对R2值。

图4
图4. 特征重要性和可解释性。(a) 仅针对MLP模型的导数预处理的R2值；(b) 所有六个模型的平均值（R2 > 0.6）。(c) 所有预处理变换下的ΔR2（RPVDF2 – RP4VP2）热图（R2 > 0.6）。红色阴影表示PVDF的性能更好，而蓝色阴影表示P4VP的性能更好。(d) 使用导数变换信号的PVDF-CF和P4VP-CF数据的所有分析物的前5个SHAP值。(f) 使用MLP模型映射到PVDF-CF和P4VP-CF数据平均导数信号上的前5个SHAP值。

图4a显示了使用MLP模型获得的特定于聚合物的R2值。PVDF-CF在预测E2和Mel方面优于P4VP-CF，而P4VP在预测AA和5-HT方面表现更好，这与图2中的电化学观察结果非常吻合。这种依赖于聚合物的选择性在所有ML模型中都存在（图4b）。热图（图4c）总结了性能差异（ΔR2 = RPVDF2 ? RP4VP2），并揭示了相同的一致趋势：PVDF-CF在检测E2和Mel方面具有优势（红色），而P4VP-CF在检测AA和5-HT方面优于PVDF-CF（蓝色），只有少数例外。重要的是，表S6报告了未应用任何阈值的完整R2值集合，确保了模型性能的完全透明性。此外，热图代表了包括导数（用于图3和4）、最小中心化和多项式在内的三个预处理步骤的平均数据。最小中心化和多项式的性能略低于导数方法，这就是为什么在我们的研究中大部分时间选择了导数方法；然而，如热图和支持表所示，依赖于聚合物的选择性趋势在所有预处理方法中都成立，表明预处理不会改变潜在的电化学信息。请注意，在图4a–c中，只显示了R2 > 0.6的聚合物-生物标志物组合，以强调稳健且实际相关的预测。

总体而言，我们将我们系统的强大性能归因于使用了聚合物多样化的电极修饰，这增强了峰分离并使得信号反卷积更加有效。此外，严格的验证，包括交叉验证和在五个随机种子上的评估，确保了对模型泛化能力的稳健评估。学习曲线分析（图3g）表明，MLP模型的测试R2值尚未随着数据集大小的增加而趋于平稳，这表明额外的训练数据可能会进一步提高预测准确性。通过使用褪黑激素的真实浓度作为代表性例子，进一步评估了潜在的系统性预测偏差（图S4l）。总之，我们的工作结合了聚合物改性的传感器、大型且富含混合物的数据集以及多种子验证，从而能够对多重电化学机器学习性能进行稳健评估，并为研究更复杂的、生理相关的液体提供了基础。

为了进一步研究聚合物特异性选择性，我们将SHAP应用于MLP模型，以评估每个聚合物数据集的特征重要性。SHAP量化了各个特征的贡献，在我们的案例中是电流-电位点，使得可以直接将学习到的模型特征与电化学信号的领域映射起来。图4d,e显示了使用P4VP-CF和PVDF-CF数据集以及导数变换迹线的所有分析物的前五个电压特征，按平均绝对SHAP值排序（额外的SHAP值见图S9）。MLP模型依赖于不同的电压区域来区分不同的分析物，改变聚合物涂层会改变哪些区域被认为是有信息的；具体来说，E2和Mel在P4VP-CF上移动到更高的电位，而在PVDF-CF上只能区分，而AA和5-HT分别在P4VP-CF上移动到更低和更高的电位，从而能够区分它们，这与图2一致。将最具影响力的特征映射到平均信号迹线上（图4f,g）显示，关键的ML特征对应于极值、零交叉点和高斜率区域，即分析物氧化的区域。尽管这些结果基于导数变换数据，绝对电位可能相对于图2有所偏移，但对于多项式变换信号也是如此（图S10），这证实了模型依赖于不同的电位区域来区分不同的分析物，这取决于聚合物涂层。

总体而言，特征分析和SHAP结果强调了聚合物修饰在多重传感中的关键作用，证实了正交传感器阵列对于有效反卷积重叠伏安信号的重要性；这是单一传感器类型无法实现的。至关重要的是，我们的发现为聚合物诱导的选择性如何增强多重传感提供了机制解释，而不是将机器学习作为一个黑箱来应用——这是一个重要的进步，因为许多研究并没有阐明他们的模型为何成功。这项工作展示了如何将电化学直觉与数据驱动的机器学习模型联系起来，并与最先进的阵列进行了基准测试。它还强调了双电极传感器阵列对于四种分析物的潜力，并为通过引入不同的聚合物涂层来扩展到更复杂的数据集提供了路线图。

为了进一步研究聚合物特异性选择性，我们将SHAP应用于MLP模型，以评估每个聚合物数据集的特征重要性。SHAP量化了各个特征的贡献，在我们的案例中是电流-电位点，使得可以直接将学习到的模型特征与电化学信号的领域映射起来。图4d,e显示了使用P4VP-CF和PVDF-CF数据集以及导数变换迹线的所有分析物的前五个电压特征，按平均绝对SHAP值排序（额外的SHAP值见图S9）。MLP模型依赖于不同的电压区域来区分不同的分析物，改变聚合物涂层会改变哪些区域被认为是有信息的；具体来说，E2和Mel在P4VP-CF上移动到更高的电位，而在PVDF-CF上只能区分，而AA和5-HT分别在P4VP-CF上移动到更低和更高的电位，从而能够区分它们，这与图2一致。将最具影响力的特征映射到平均信号迹线上（图4f,g）显示，关键的ML特征对应于极值、零交叉点和高斜率区域，即分析物氧化的区域。尽管这些结果基于导数变换数据，绝对电位可能相对于图2有所偏移，但对于多项式变换信号也是如此（图S10），这证实了模型依赖于不同的电位区域来区分不同的分析物，这取决于聚合物涂层。

总体而言，特征分析和SHAP结果强调了聚合物修饰在多重传感中的关键作用，证实了正交传感器阵列对于有效反卷积重叠伏安信号的重要性；这是单一传感器类型无法实现的。至关重要的是，我们的发现为聚合物诱导的选择性如何增强多重传感提供了机制解释，而不是将机器学习作为一个黑箱来应用——这是一个重要的进步，因为许多研究并没有阐明他们的模型为何成功。这项工作展示了如何将可解释性工具与数据驱动的机器学习模型联系起来，并与最先进的阵列进行了基准测试。它还强调了双电极传感器阵列对于四种分析物的潜力，并为通过引入不同的聚合物涂层来扩展到更复杂的数据集提供了路线图。

这项研究表明，双电极传感器阵列可以有效地区分四种分析物。然而，为了将其应用于可穿戴设备，必须解决几个限制。需要提高雌二醇和褪黑激素的灵敏度，以匹配生理水平。其他分子如多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素以及最关键的尿酸，其特征氧化电位与当前分子重叠（图S11）。需要在不同条件下（例如，离子强度、pH值、人工和真实唾液）进一步评估它们对机器学习模型的影响，以提高其稳健性。最后，我们的模型是在四种分析物上训练的封闭集回归模型，目前无法检测未知物种，这是所有封闭集机器学习传感器系统的固有属性。我们相信，尽管是在一个简化的系统中展示的，但目前的工作提供了一种可行的策略，可以解决电化学传感器的严格选择性限制，并可以提高下一代电化学传感器的稳健性和选择性。

这项研究提出了一种电化学传感器阵列，能够在混合条件下选择性地检测5-HT、AA、E2和Mel。该阵列由用PVDF或P4VP聚合物改性的碳花电极组成，并通过可扩展的过程沉积在可拉伸基底上，使其非常适合用于皮肤应用，并且可以轻松适应更大的阵列。聚合物修饰改变了分析物的氧化电位，产生了独特且可分辨的电化学特征，并生成了优化用于机器学习分析的高质量数据集。我们评估了来自单分析和多分析物混合物的450个方波伏安图，浓度在临床相关范围内。基于机器学习的信号处理实现了0.947的总体R2值，大多数MAE值在30%的误差范围内，足以分辨出生物学上有意义的变化。在测试的六种机器学习算法中，MLP模型的表现最好，这可能是由于它能够捕捉重叠伏安特征中的复杂非线性关系，优于线性模型。特征重要性分析显示，PVDF-CFs对于区分E2和Mel至关重要，而P4VP-CFs能够区分AA和5-HT。SHAP分析进一步证实了模型依赖于与氧化相关的区域，验证了聚合物诱导选择性的机制作用。总之，这项工作表明，聚合物改性的碳电极结合了可解释的机器学习，可以稳健地区分和量化复杂混合物中的多种非侵入性生物标志物。这种方法为扩展到更大的电极阵列和更广泛的分析物面板提供了明确的途径。