关于登革病毒NS3 ATP酶与3′-叠氮-3′-脱氧胸苷相互作用的机制及其抑制作用的研究：计算生物学与生物物理学方法

《ACS Omega》：Insight into the Interaction and Inhibition of NS3 ATPase of Dengue Virus with 3′-Azido-3′-deoxythymidine: Computational and Biophysical Approaches

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登革病毒（DENV）的NS3蛋白具有高度保守性，在病毒复制过程中起着至关重要的作用，因此被视为潜在的抗病毒靶点。本研究通过生物物理研究和ATP酶抑制实验观察了DENV-4的NS3蛋白与3′-叠氮-3′-脱氧胸苷（AZT-TP）之间的相互作用，并结合了计算机模拟方法进行了进一步分析。荧光和时间分辨实验显示NS3荧光团的静态淬灭现象显著。表面等离子体共振（SPR）研究显示其具有强烈的结合亲和力，表现为较高的结合速率（ka）和较低的解离速率常数（Kd）。等温滴定量热法（ITC）测量结果表明NS3与AZT-TP之间存在强且自发的结合，其热力学参数合理。ATP酶抑制实验表明AZT-TP以剂量依赖的方式降低了NS3 ATP酶的活性，表明其具有抑制潜力。分子对接分析显示NS3与参与NS3解旋酶/ATP酶活性的保守残基之间存在显著的结合（结合自由能约为-8.0 kcal/mol）。分子动力学（MD）模拟显示NS3与AZT-TP复合物没有发生明显的构象变化，并且在结合位置上保持稳定，轨迹几乎呈线性，持续时间可达200纳秒。使用MMPB(GB)SA计算的总吉布斯自由能和不同相互作用的贡献进一步验证了生物物理和对接结果。研究表明AZT-TP可能与参与ATP酶活性的残基直接结合，为探索AZT-TP作为NS3抑制剂在抗病毒治疗中的应用前景提供了有希望的数据。

1. 引言
登革热是一种由节肢动物传播的疾病，每年导致数百万例感染。(1) 该病通常表现为亚临床症状，有时会发展成威胁生命的状况，特征包括血浆渗漏、血管通透性和器官损伤。由于缺乏特异性抗病毒药物，治疗主要依赖于支持性护理，这在全球范围内造成了重大的公共卫生问题。(2,3) 在过去二十年里，全球感染人数增加了10倍，从50万例增加到520万例。(3) 2023年，登革热病例大幅增加，多个地区同时爆发疫情，甚至包括以前未受影响的地区。(3) 这可能是由于登革热与其他具有类似症状的节肢动物传播疾病的共存而导致的误诊。(4?6) 尽管已采取措施控制媒介蚊子（如埃及伊蚊和白纹伊蚊）的繁殖环境并消灭幼虫，但DENV新变种的快速出现严重阻碍了登革热的根除。

DENV具有一个开放阅读框（ORF），含有正链单链RNA（ssRNA），基因组大小约为11 kb。病毒多聚蛋白通过共翻译和翻译后修饰产生三种结构蛋白和七种非结构蛋白（NSPs）。这些结构蛋白和非结构蛋白在感染宿主细胞的内质网（ER）中进一步折叠成其天然状态。DENV的NSPs主要参与病毒复制、组装以及逃避宿主细胞的免疫反应。(2) 多功能NS3蛋白是一种约69 kDa（618个氨基酸）的可溶性胞质蛋白，存在于感染细胞中。其C端（181–618位）包含三个亚结构域和八个结构基序，这是超家族II解旋酶的关键特征。亚结构域I和II（残基181–481）在催化核心区域具有保守的Walker基序，由六个平行β折叠片组成，两侧各有一个α螺旋。而亚结构域III（残基482–618）由四个平行α螺旋组成，周围环绕着三个短α螺旋和两个反平行β链（图1）。NS3的ssRNA结合位点就位于此结构中，这是NS3蛋白的一个独特特征。(7,8) ATP底物结合口袋位于亚结构域I和II之间。(9?11) 亚结构域III与亚结构域I和II相互作用，形成了另一个底物结合口袋——RNA结合裂隙。(9?11)

图1
(a) 登革病毒基因组及其结构蛋白和非结构蛋白。
(b) NS3蛋白的N端和C端以及三个亚结构域。
(c) 亚结构域I（基序I、Ia、II和III）和亚结构域II（基序IV、IVa、V和VI）的高度保守基序。

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C端具有解旋酶、ATP酶和RTP酶活性，在DENV复制和病毒包封过程中起关键作用。研究表明，NS3蛋白的突变，尤其是C端区域的突变，会使其失去功能，从而抑制病毒复制和存活。(9,12) N端（1–180位）包含一个β桶结构和一个β链，以及夹在其中的催化三联体。该结构域作为类胰凝乳蛋白酶的丝氨酸蛋白酶发挥作用，需要辅因子NS2B才能正确折叠成功能形式。(7) NS2BNS3复合物中的Ser135残基催化肽键的水解。此外，研究显示NS2B-NS3复合物能抑制感染初级树突状细胞中I型干扰素的产生。(13?15) NS3是正黄病毒科（Orthoflaviviruses）中高度保守的蛋白质（约70%），使其成为高通量分子筛选的理想靶点。(7,16,17) 药物发现是一个繁琐且耗时的过程；通过计算机模拟方法进行初步筛选并使用生物物理方法进行验证，可以快速、经济地识别和开发潜在候选药物。(18?20) 此外，重新利用已批准的抗病毒药物也可以加速初步筛选过程。FDA批准的抗病毒药物3′-叠氮-3′-脱氧胸苷（AZT）是一种HIV抑制剂，其结构与胸腺嘧啶分子相似，还能阻止核酸链的磷酸二酯键形成。(21) AZT的活性形式是3′-叠氮-3′-脱氧胸苷三磷酸（AZT-TP）。已有少数研究使用生物物理技术确定了正黄病毒（包括DENV、寨卡病毒、丙型肝炎病毒）的NS2B/NS3蛋白酶与潜在抑制剂的结合和热力学性质。(22?25) 因此，在本研究中，我们通过光谱学、酶抑制实验和计算机模拟分析了AZT-TP是否可以作为NS2B47-NS3（bNS2BNS3）蛋白C端域的ATP酶/解旋酶抑制剂。

2. 方法论
2.1. 全长NS3蛋白的纯化
pNIC基础的bNS2B47NS3构建体由新加坡南洋理工大学的Dahai Luo实验室提供（Addgene质粒#155320）。纯化过程遵循已发表的方案，并进行了少量修改。(26) 将质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌细胞中。在0.75 mM IPTG（Merck, USA）诱导下实现最大表达。收获的细胞经裂解后，使用Ni-NTA亲和层析纯化，并用10 mM Tris（pH 7.5）、100 mM NaCl和2%甘油进行透析。纯化后的蛋白质通过SDS-PAGE验证，并使用Amicon Concentrator（Merck, USA）以10 kDa的截留值进行浓缩。(27) 浓缩后的蛋白质进一步使用HiloadTm 16/600 Superdex 75 pg（GE Healthcare, USA）凝胶过滤层析纯化，结合?KTA-pure柱（Cytiva, MA, USA）。

2.2. 荧光结合测定
通过荧光淬灭实验测量AZT-TP浓度增加时bNS2B47NS3荧光团荧光强度的降低。使用Jasco FP-6200荧光光谱仪（日本）在25 ± 1 °C下测量bNS2B47NS3蛋白的固有光谱，比色皿路径长度为1 cm。通过固定激发和发射光狭缝宽度为10 nm，测定不同AZT-TP浓度下bNS2B47NS3蛋白的荧光强度变化。激发波长为280 nm，发射光谱记录范围为300–430 nm。(28?30) 使用Stern–Volmer方程计算Stern–Volmer常数（Ksv）：
$$ F_0 = F - Ksv \cdot [C] $$
其中 $ F_0 $ 是加入淬灭剂前的荧光强度，$ F $ 是加入淬灭剂后的荧光强度，$ Ksv $ 是Stern–Volmer淬灭常数。进一步使用方程（2）计算结合位点数（n）和结合常数（Ka）：
$$ \log F_0 - \log F = \log k_a + n \log [C] $$
其中 $ F_0 $ 是加入淬灭剂前的荧光强度，$ F $ 是加入淬灭剂后的荧光强度。同时，使用R2值评估拟合优度。

2.3. 时间分辨荧光光谱（TRFS）
TRFS测量配体存在下荧光团荧光衰减寿命的变化及构象变化。(31) 使用配备脉冲纳秒LED的光谱仪（Horiba Jobin Yvon IBH Ltd., UK）进行时间分辨荧光测量。bNS2B47NS3蛋白的激发波长设为280 nm，发射波长设为343 nm。记录的寿命数据达到10,000计数峰值。仪器响应函数（IRFs）通过时间校准为114 ps/通道获得。所有样品测量均在25 °C下进行，使用路径长度为1 cm的石英比色皿。

2.4. 等温滴定量热法结合研究
使用VP-ITC MicroCal ITC量热仪（MicroCal Inc., USA）在25 °C下研究bNS2B47NS3蛋白与AZT-TP之间的双分子相互作用和热力学参数。按照已发表的方案，用Tris-NaCl缓冲液（pH 8.0）对bNS2B47NS3蛋白进行滴定。(32?36) 简而言之，bNS2B47NS3蛋白、AZT-TP、10 mM Tris和100 mM NaCl缓冲液（参考缓冲液）在热真空室中脱气10分钟。随后分别将bNS2B47NS3蛋白（6 μM）、参考缓冲液和AZT-TP（120 μM）小心加入样品池、参考池和旋转注射器中，避免搅拌过程中产生气泡。设定搅拌速度为307 rpm，滴定总次数为26次，每次注射10 μL AZT-TP。曲线拟合采用顺序结合模型。此外，还进行了配体缓冲液滴定，并从蛋白质-配体热图中减去稀释热。最终数据分析使用MicroCal Origin 8.0软件获得熵变（ΔS）、结合常数（Ka）和焓变（ΔH）。标准误差（SE）也由软件计算。

2.5. 表面等离子体共振测量
使用Biacore X100 SPR仪器（Cytiva, Marlborough, MA, USA）研究bNS2B47NS3蛋白（配体）与AZT-TP（分析物）之间的生物分子相互作用。系统用10 mM Tris（pH 8.0）和150 mM NaCl缓冲液进行预处理并稳定基线。80 μg/mL的bNS2B47NS3蛋白使用10 mM Tris和150 mM NaCl缓冲液固定在Ni-NTA传感器芯片上。将不同浓度的AZT-TP（2 μM至30 μM）在相同缓冲液中通过传感器芯片，温度为25 °C。结合和解离的接触时间分别设为120秒和90秒，确保系统流速为10 μL/min。使用Biacore X100评估软件的简单1:1稳态模型获得AZT-TP与bNS2B47NS3蛋白的亲和力和动力学参数。标准误差（SE）也由软件计算。

2.6. ATP酶活性抑制实验
按照已发表的方案进行ATP酶活性抑制实验，测量ATP水解后释放的游离磷酸盐，同时进行了少量修改。(8,37) 实验使用Corning公司的96孔板（最终体积50 μL）。bNS2B47NS3蛋白（100 nM）与2 μM poly(U)、50 mM Tris–HCl（pH 7.5）、0.25 ng/μL牛血清白蛋白（BSA）、0.05% Tween 20和1.5 mM Dithiothreitol（DTT）在30 °C下预孵育15分钟。随后加入逐渐增加浓度的AZT-TP（Tris–HCl缓冲液），并在30 °C下孵育15分钟。加入2 mM MgCl2和10 μL ATP（Sigma-Aldrich, USA）启动反应。反应混合物在30 °C下孵育30分钟后，向每个孔中加入新鲜制备的10 μL孔雀石绿试剂（1%孔雀石绿溶液溶于1 M HCl，与4%钼酸盐和0.025% Tween 20混合），并在室温下孵育20–30分钟。测量是在650纳米波长下使用Thermo Scientific公司的Multiskan FC微孔板读数器进行的。在没有NS3蛋白的情况下，也读取了非酶促ATP水解的背景吸光度。剩余的ATP酶活性是通过公式3来确定的：
剩余活性(%) = (A/A° × 100)
其中A和A°分别表示添加了AZT-TP和未添加AZT-TP时NS3的ATP酶活性。结果以重复实验的平均值±标准差报告。

2.7 分子对接
进行了分子对接实验以确定配体与蛋白质的结合取向。仔细分析了DENV-4的NS3蛋白（PDB ID：5YW1）中缺失的原子、添加的水分子和链断裂，并使用PyMol（v1.7.4.5）进行了必要的校正。（38,39）移除了配体（BPTI），并通过Swiss Model在线服务器（https://swissmodel.expasy.org/）对蛋白质进行了建模以添加缺失的残基，随后使用Swiss-PDB Viewer（v4.1）进行了能量最小化。（40?42）使用AutoDock工具（v1.5.7）将网格中心点设置为X = 53.725, Y = 8.884, Z = 24.634。盒子尺寸（?）设置为X = 28, Y = 24, Z = 32，覆盖范围为8，目标是参与蛋白质解旋酶/ATP酶/RTP酶活性的NS3蛋白的C末端。使用obabel最小化了AZT-TP（CID:72187）的3D结构的能量。（43）对于最终的对接，使用了AutoDock Vina，并使用PyMol（v1.7.4.5）和Discovery studio软件（v4.5）进行了可视化。（39）

2.8 分子动力学（MD）模拟
使用GROMACS（v2023）进行了广泛的MD模拟研究，以说明AZT-TP与NS3蛋白结合的作用。（44,45）模拟中使用了由简单点电荷（SPC）水分子组成的盲立方盒子（边缘距离1纳米），并采用了charmm36-July2022力场。因此，在溶剂系统中，它完全覆盖了NS3蛋白和配体结合的NS3复合物。此外，该系统使用反离子进行了中和。系统使用最陡下降步长50000步进行了最小化。使用V-rescale恒温器方法在300 K下进行了100 ps的粒子数（N）、体积（V）和温度（T）平衡。随后，在1 bar的压力和300 K的温度下，使用C-rescale barostat和V-rescale恒温器方法进行了100 ps的NPT（粒子数、压力、温度）生产模拟。（46?48）使用SHAKE算法约束了包括氢原子在内的共价键。（49）每10 ps记录一次模拟坐标。（50）模拟在NPT集合条件下进行了200 ns，保持恒定的1 bar压力和300 K的温度。模拟后，使用GROMACS软件分析了生成的轨迹。为了分析NS3蛋白和AZT-TP结合的NS3复合物的结构变化和实时行为，计算了均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、溶剂可及表面积（SASA）和回转半径（Rg），并进行了二级结构分析。（51,52）此外，还计算了配体的平均RMSD。结果以GROMACS软件提供的平均值±标准差报告。此外，还使用gmxMMPB(GB)SA amber基工具评估了最后5000帧的复合物结合自由能。

3. 结果与讨论
DENV有四种抗原不同的血清型，并且由于感染宿主体内非中和抗体的交叉反应，与抗体依赖性增强（ADE）的二次感染相关。（53）因此，二次感染通常很严重，这使得疫苗开发具有挑战性。此外，同时感染多种DENV血清型的宿主更有可能出现严重并发症。（54）因此，针对DENV进化保守区域设计抗病毒药物是抗击登革热病毒感染的最有效方法。NS3蛋白在所有正黄病毒属成员中都是进化保守的，包括DENV。由于RNA病毒（包括DENV）具有高突变率，针对NS3蛋白进行抗病毒开发将有助于减少治疗失败。已有研究报道了全长NS3蛋白以及未连接的N端和C端结构域的晶体结构。（26,55）C端结构域具有解旋酶/ATP酶活性，已被证明独立于N端蛋白酶活性。然而，一些研究也报道了N端残基和连接区在C端活性正确折叠和功能中的作用。（12,55,56）Luo等人的研究表明，蛋白酶结构域位于C端亚域I和II的ATP酶活性位点旁边，即亚域间的连接区（残基169–179）以及围绕ATP酶结合位点的两个环。（12,55）相反，如果将分子绕垂直轴旋转180°，会显示出额外的负电荷。因此，这两个结构的相邻可能导致通过长程静电相互作用优化核苷酸底物向ATP水解位点的分布。这一结构特征可以与NS2B18NS3的核苷酸结合亲和力相比增加10倍相关联。（56）Xu等人的另一项研究也报道了蛋白酶结构域（残基161–618）对C端活性的显著影响。（57,79）最近，Phoo等人提出了一种双价构建体bNS2B47NS3，其与天然NS2B-NS3在复制复合物中的相似性更高。作者得出结论，这种构建体可以用于高通量筛选潜在的抗正黄病毒化合物，而不是甘氨酸连接的NS2B-NS3变体。（26）因此，在当前研究中，使用多种生物物理和计算机模拟方法进行了AZT-TP与DENV-4的NS3蛋白的结合和抑制研究。

3.1 bNS2B47NS3蛋白的纯化
含有全长bNS2B47NS3蛋白的pNIC载体被转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，并在18°C下用0.75 mM IPTG诱导过夜。收集诱导培养物，进行细胞裂解，然后通过Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析进行纯化。使用SDS-PAGE分析和UV–可见光谱验证了bNS2B47NS3的纯度和浓度（支持信息图S1和S2）。

3.2 不同光谱和量热方法的相互作用研究
蛋白质-药物相互作用在药物开发过程中至关重要，因为它们提供了关于药物如何与特定蛋白质结合的见解，并决定了其效力。光谱研究还在实时提供关于蛋白质构象变化和相互作用机制的分子级细节方面发挥着关键作用。所有实验都经过优化，并至少进行了2-3次。

3.2.1 荧光结合测量
荧光光谱是一种生物物理技术，有助于确定蛋白质芳香氨基酸周围环境的变化。（58,59）荧光淬灭是研究荧光团和淬灭剂之间相互作用的常用方法之一。（35,60）淬灭是指由于配体与生物分子中的荧光团相互作用导致生物分子荧光强度降低的现象。（61）淬灭涉及不同类型的分子相互作用、复合物形成和能量转移。根据荧光团的能量状态，荧光淬灭有两种不同类型：静态淬灭是由于荧光团和淬灭剂的结合形成了基态复合物，而动态淬灭是由于淬灭剂与荧光团之间的碰撞。芳香氨基酸苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）作为敏感的荧光探针，有助于探索三级结构和蛋白质-配体相互作用的变化。（30）NS3蛋白含有14个Trp、20个Phe和15个Tyr氨基酸。图2显示了在298 K下用AZT-TP滴定的bNS2B47NS3蛋白的发射光谱。bNS2B47NS3蛋白在pH 8.0时的λmax为343 nm，当AZT-TP结合时，荧光强度降低，但λmax没有蓝移或红移，表明其天然结构未发生变化，bNS2B47NS3-AZT-TP复合物稳定形成。随着AZT-TP的连续添加，bNS2B47NS3蛋白的强度逐渐降低（图2插图）。使用方程1和F0/F与[Q]的线性回归图，在298 K的温度下确定了结合参数Stern–Volmer常数（Ksv）（图3a），这表明AZT-TP对NS3蛋白有显著的淬灭作用。结合常数（Ka）使用双对数图和方程2确定。图3b显示AZT-TP与bNS2B47NS3的结合具有很高的亲和力，Ka为4.0 × 104 M–1，n为0.911。

图2. NS3蛋白与AZT-TP的荧光结合测量。插图显示了在不同AZT-TP浓度下bNS2B47NS3蛋白的荧光强度。

3.2.2 时间分辨荧光研究
时间分辨荧光研究用于研究在配体存在下的蛋白质结合、淬灭和折叠。荧光团的寿命测量提供了其指数衰减，这取决于荧光团的类型。在动态淬灭中，荧光寿命会发生显著变化，而在静态淬灭中，荧光寿命保持稳定。（31,62）进行时间分辨荧光研究以补充bNS2B47NS3荧光团与配体的结合结果和机制。使用非线性最小二乘重卷积对bNS2B47NS3荧光团的衰减曲线进行了分析。在AZT-TP存在下，bNS2B47NS3蛋白和bNS2B47NS3的衰减曲线使用多指数函数进行了拟合。分析了加权残差和χ2值以确定计算拟合的显著性。表1和图4显示了NS3荧光团的荧光寿命（τavg）在添加AZT-TP后没有显著变化。τavg值在2.6到2.1 ns之间，表明bNS2B47NS3荧光团与AZT-TP的结合机制为静态淬灭。

表1. 不同AZT-TP浓度下bNS2B47NS3荧光团的荧光衰减曲线

3.2.3 等温滴定量热（ITC）结合研究
在药物发现过程中，评估配体亲和力可以表明该配体可能是针对目标疾病的潜在候选物。ITC是一种强大的生物物理技术，可以从一系列精心控制的实验中分析结合事件的热力学参数。蛋白质和配体之间的相互作用会导致复合物的形成或解离，从而在样品细胞中释放或吸收热量。这种热量变化用于反应的热力学表征，包括结合/关联常数（Ka）、熵变（ΔS）、焓变（ΔH）、结合位点数（n）和结合的自由能变（ΔG）。（63）图5显示了在绝热条件下用AZT-TP滴定的bNS2B47NS3蛋白的ITC等温线。图5的上方面板显示了每次将AZT-TP注入bNS2B47NS3蛋白样品细胞的情况。bNS2B47NS3–AZT-TP结合过程中释放的热量与峰值下的面积成正比。图5的下方面板显示了根据两站点顺序结合模型拟合的数据，每摩尔注入物的积分热量与AZT-TP与bNS2B47NS3蛋白的摩尔比之间的关系。等温线显示了bNS2B47NS3蛋白与AZT-TP形成稳定复合物的放热反应（图5）。表2显示了从ITC研究中获得的热力学和结合参数。ΔG的负值（分别为?8.72 × 103和?4.5 × 103 cal/mol）表明bNS2B47NS3–AZT-TP反应是可行且自发的，意味着平衡向产物形成方向移动。因此，蛋白质与AZT-TP的结合可以通过有利的放热焓（ΔH < 0）和熵变（ΔS < 0）来表征，这有助于提高结合位点的亲和力。ΔS和ΔH的负值表明bNS2B47NS3蛋白质与AZT-TP复合物之间形成了氢键。ITC数据表明，AZT-TP与bNS2B47NS3蛋白质之间存在显著的结合，其结合常数分别为2.60 × 10^5和1.12 × 10^4（针对位点1和2）。先前的研究报道了DENV的NS2B/NS3蛋白酶与EGCG的双相结合ITC结果，由于EGCG结合导致蛋白质构象变化而产生快速吸热反应，以及反映NS2B/NS3蛋白酶-EGCG复合物稳定的缓慢放热结合事件。(64)图5显示了用AZT-TP滴定的NS3蛋白的ITC等温线。上图表示每次注射作为样品细胞中滴定的AZT-TP的峰值。下图描绘了每次注射释放的热量与AZT-TP与NS3蛋白摩尔比的函数关系。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片表2. 从ITC研究中获得的AZT-TP与bNS2B47NS3蛋白质顺序结合的热力学和结合参数位点结合常数（Ka），M^-1焓变（ΔH），cal/mol熵变（ΔS），cal/mol/deg吉布斯自由能（ΔG），cal/mol12.60 × 10^5 ± 1.6 × 10^-4–3.246 × 10^5 ± 8.88 × 10^-3–1.06 × 10^-3–8.72 × 10^-321.12 × 10^4 ± 8.2 × 10^-2–4.217 × 10^5 ± 5.97 × 10^-4–1.40 × 10^-3–4.5 × 10^-33.2.4. 表面等离子共振（SPR）结合研究SPR是一种相对较新的无标记技术，能够实时测量受体（蛋白质、抗体等）与分析物（药物）之间的分子相互作用。(65,66) 由于它是一种基于光学的方法，它可以检测传感器表面附近折射率的变化，并测量受体-分析物相互作用的结合亲和力和动力学。(65,66) 在His标记的bNS2B47NS3蛋白质（受体）的情况下，使用NiCl2将镍离子加载到NTA传感器芯片上，因为组氨酸的咪唑环与Ni^2+离子结合，从而将bNS2B47NS3蛋白质固定在传感器芯片上。(65,66) 分析物AZT-TP从低浓度流向高浓度，并与固定的bNS2B47NS3蛋白质结合，导致结构变化，从而改变折射率。这种反射角度的变化与结合到bNS2B47NS3-固定芯片上的AZT-TP分析物量成正比，并由SPR仪器实时检测并表示为响应单位（RU）。高灵敏度的SPR仪器甚至可以检测到微小的折射率变化，并能精确量化。在达到所需的结合时间或芯片上的所有结合位点都被占据后，注入350 mM EDTA溶液以解离蛋白质-AZT-TP复合物，导致RU值下降。SPR响应的变化随时间绘制，从而生成传感器图。结合常数（Kd）和结合（ka）以及解离（kd）速率常数是利用RU曲线计算得出的。(65,67) 此外，AZT-TP的流速以及蛋白质和AZT-TP的浓度是药物相互作用研究中的关键因素。理想情况下，对于使用SPR的药物-蛋白质相互作用，高流速和低分析物浓度有助于最小化空间阻碍、质量传输、拥挤和高容量bNS2B47NS3-固定传感器表面的聚集。(67) 因此，在本研究中，优化了固定bNS2B47NS3蛋白质和AZT-TP的浓度以及流速，以获得它们相互作用的最佳结合参数和动力学。图6a显示了在25°C下80 μg bNS2B47NS3蛋白质与AZT-TP（2–30 μM）结合的SPR传感器图。图6b显示了在25°C下响应与药物浓度的SPR图。传感器图可以揭示bNS2B47NS3蛋白质与AZT-TP分析物之间是否存在特异性结合事件。SPR研究结果表明，随着AZT-TP浓度的增加，响应单位（RU）增加，表明bNS2B47NS3与AZT-TP之间的相互作用和结合增强。结合亲和力（KA）被发现为4.36 × 10^4 M^-1。图7展示了bNS2B47NS3蛋白质与分析物AZT-TP之间的反应动力学与时间的图。分析了AZT-TP与bNS2B47NS3的结合和解离动力学，结果显示kd为0.03860 s^-1（SE ± 0.10），而Ka观察值为1683 1/Ms（SE ± 95）。较低的Kd值表明bNS2B47NS3蛋白质与AZT-TP之间的结合强度大。此外，当bNS2B47NS3蛋白质的所有可结合位点都被AZT-TP饱和时，观察到RUMax值为77.2。RUMax被认为是理论表面容量。图6(a) 固定在金膜上的bNS2B47NS3蛋白质与逐渐增加的AZT浓度的结合传感器图。流速固定在10 μL/min，解离和接触时间分别为90秒和120秒。(b) AZT与bNS2B47NS3蛋白质的剂量依赖性饱和结合。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片图7. 固定的bNS2B47NS3蛋白质与逐渐增加的AZT浓度的结合动力学。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片因此，根据我们的SPR实验，NS3蛋白质与AZT-TP之间存在显著的相互作用，这验证了其他结合研究的结果。此外，它还提供了关于AZT-TP与bNS2B47NS3的药效学和动力学的信息。关于使用SPR或其他生物物理技术研究DENV的NS3蛋白质与潜在抑制剂的结合亲和力的数据非常有限。然而，一些研究报道了非肽类小分子ITMN-191与Zika病毒和丙型肝炎病毒（属于DENV属；正黄病毒）的NS3蛋白质之间的相互作用，并取得了显著结果。(23,25,68) 与我们的研究类似，Rajagopalan等人和Geitmann等人使用SPR研究了ITMN-191（KA= 1 × 10^7 M^-1）与HCV NS3蛋白质的结合，显示出显著的亲和力和缓慢的解离速率。(23,25) 此外，Moreland等人的研究报道了使用SPR对NS3蛋白质的结合亲和力研究的重要性，以及3F8的类似结合常数（Ka = 3.18 × 10^5 M^-1s^-1），以进一步探索针对DENV的治疗药物。(24) 应注意的是，图中的噪声是由于样品在流动池中的流体动力学来回泵送造成的，但它不影响蛋白质的动力学。上述光谱研究表明，从ITC、SPR和荧光光谱获得的bNS2B47NS3和AZT-TP结合的KA值略有不同，但具有可比性。尽管荧光光谱数据仅处于中等水平，但ITC和SPR的结果是显著的。这种差异源于不同生物物理技术使用的不同原理和拟合模型。ITC测量与总结合事件相关的实时热力学参数，而SPR测量受蛋白质固定影响表面上的高亲和力相互作用的动力学。然而，荧光淬灭对荧光团附近的局部构象变化敏感，可能无法读取总结合事件。因此，我们的生物物理研究证实了bNS2BNS3蛋白质与AZT-TP之间的显著相互作用和结合事件。因此，我们进行了酶抑制试验，以确认获得的AZT-TP结合是否抑制了bNS2BNS3蛋白质的功能特性。3.3. ATP酶活性抑制试验酶活性和抑制试验是确定蛋白质正确折叠、动力学分析和药物发现过程的关键步骤。因此，在本研究中，确定了AZT-TP对bNS2B47NS3蛋白质ATP酶活性的抑制潜力，以确认其结合和潜在的抗病毒效果。C端NS3解旋酶通过解开双链RNA或以单向方式沿着单链RNA移动来充当分子马达，这一过程由ATP水解驱动。与没有核酸的情况下相比，这种ATP酶活性在核酸存在的情况下显著增强。(69) 因此，通过使用孔雀石绿比色法确定了bNS2B47NS3蛋白质在有无不同浓度（5 μM至750 μM）AZT-TP存在下的ATP酶抑制活性。结果中显示的所有数据点都是三次独立实验的平均值±标准差。图8中的图表显示了NS3解旋酶活性随剂量的减少。AZT-TP处理导致ATP酶活性从89.49%（5 μM AZT-TP）降至18.13%（750 μM AZT-TP）。因此，感染宿主体内ATP酶活性的这种减少可能是由多种合理因素引起的。NS3蛋白质的I、II、III和VI基序参与ATP结合和水解活性。(9) I基序形成一个磷酸盐结合环，使残基能够结合NTP的β-磷酸基团。(70) II基序具有DEAD盒元件，它在ATP结合口袋中协调镁离子。III基序将ATP水解与RNA解旋耦合，并与两个RecA样结构域以及I、II和VI基序一起创建一个高亲和力的RNA结合裂隙。(9,71) VI基序（Arg手指）稳定了核酸碱基与ATP酶活性位点中的残基之间的相互作用。(9,72) 因此，阻断上述任何一种活性都会抑制ATP酶活性。在我们的研究中，AZT-TP可能通过中和ATP或RNA 5′-三磷酸寡核苷酸的γ-磷酸基团来直接阻止过渡态的稳定。这导致ATP无法形成ADP + Pi，从而显著降低了NS3解旋酶活性所需的能量。研究表明，单链RNA的存在使ATP水解速率增加了10–100倍。(73,74) 如果AZT-TP的作用类似于别构抑制剂，它可能能够将RNA的结合与ATP水解解耦，导致构象变化和NS3解旋酶失活。(73) 因此，在本研究中，AZT-TP的存在可能抑制了多(U)结合，这可能会触发NS3结构域的构象重排以激活ATP水解的催化核心。此外，AZT-TP的结合可能阻止了β6 - β1′环中必要的构象变化，该环参与催化位点的水合。(75)图8. 随着AZT-TP浓度增加的DENV NS3解旋酶的剩余ATP酶活性。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片3.4. 分子对接为了深入了解AZT-TP可能的结合机制、位置和亲和力，对AZT-TP与NS3蛋白质的C末端进行了分子对接。由于我们的结果显示AZT-TP降低了蛋白质的ATP酶活性，因此选择了显示最高结合亲和力和参与ATP酶活性的残基的结合取向进行进一步分析。NS3与AZT-TP之间的结合显示出显著的相互作用和结合亲和力（?8.0 kcal/mol）。C端残基Lys199、Lys201、Asp284、Glu285和Asn416参与了与配体磷酸基团的氢键形成（图9）。此外，残基Pro195、Gly196、Thr200、Ala234、Val227、Gly414和Ag463参与了范德华相互作用，而Glu230、Asp284和Glu285参与了吸引性电荷相互作用（图9）。这些相互作用（范德华和其他）主要参与AZT-TP–NS3复合物的识别、形成和稳定性，从而支持由氢键驱动的结合亲和力。(76) 据报道，这些相互作用残基在NS3解旋酶活性中起着功能上重要的作用。因此，如果任何配体与这些残基结合，将抑制它们的功能，最终可能减少感染宿主体内的病毒复制。研究表明，II基序的Glu285和Asp284是NTP酶活性位点的关键结构残基。(74) Glu285的羧基团从Mg2+结合位置重新定向到一个更有利的位置，以便在RNA分子存在时协调裂解水。RNA诱导的Glu285变化使其能够作为碱基并从裂解水中接受质子。因此，它增强了水解反应期间攻击基团的亲核性。因此，RNA影响NS3蛋白NTPase活性位点内水分子的位置和动态。这些效应通过RNA结合裂隙的残基传递到NTPase活性位点，这是通过motif II、α2和Lβ3β4的结构重排实现的（75，78）。此外，Wand等人的研究表明，将motif I的残基Lys199和Thr200替换为Ala199和Ala200会消除RNA刺激的NTPase活性以及基础NTPase活性和RTPase活性（73）。这表明NS3解旋酶的NTPase活性和RTPase活性具有共同的催化位点。Sampath等人的另一项研究表明，motif VI的残基Arg463发生突变后，NS3解旋酶的ATPase活性降低了29%，RTPase活性也有类似的降低（12）。进一步地，Gly414的突变仅导致NS3解旋酶的ATPase活性略有下降（12）。另外，Luo等人报告了NS3解旋酶作为NTPase循环的蛋白质-底物复合物的晶体结构。这些结构显示了RNA结合对NTPase活性位点的显著别构影响。例如，RNA底物的存在将motif II中的Glu285的羧基团转变为更有利于水解反应的构象。值得注意的是，Glu285残基的突变会消除解旋酶和NTPase活性（74,77,78）。因此，除了直接针对参与ATPase活性的残基外，还可以通过配体来靶向别构位点以抑制NS3解旋酶。一项研究鉴定出一种潜在的配体suramin，它通过结合到别构位点来非竞争性地抑制NS3解旋酶（79）。Suramin通过与ATP结合位点以外的残基结合，并通过别构或非竞争机制干扰解旋酶的功能来抑制其活性。

图9
(a) C末端NS3蛋白与配体AZT-TP相互作用涉及的残基。
(b) 相互作用的表面视图。

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3.5. MD模拟分析
3.5.1. 均方根偏差（RMSD）和波动（RMSF）
配体与任何受体蛋白的结合都会引起其天然结构的构象变化或不稳定性。构象变化可以通过RMSD来测量，RMSD量化了与参考点的偏差。RMSD通过计算不同对齐分子的原子位置的平均偏差来确定分子的整体稳定性（80,81）。因此，计算了NS3和AZT-TP结合的NS3复合物的平均RMSD，以了解它们在特定PVT条件下的整体结构稳定性、动态行为和构象变化。表3和图10a分别展示了NS3和NS3-AZT-TP对接复合物骨架的平均RMSD值和RMSD轨迹。图表显示，在40 ns内，NS3的RMSD轨迹是稳定的，随后在200 ns的模拟过程中某些位置出现了波动。然而，AZT-TP结合的NS3蛋白的RMSD轨迹几乎是线性的，仅在60–70 ns时出现轻微波动。NS3–AZT-TP复合物的稳定RMSD表明，在200 ns内形成了稳定的复合物。此外，配体AZT-TP的平均RMSD在200 ns的模拟过程中为0.822（SD ± 0.18），低于NS3–AZT-TP复合物的平均RMSD。AZT-TP与蛋白质骨架的RMSD的最小二乘拟合显示在支持信息图S3中。轨迹显示，AZT-TP的平均RMSD总体上是稳定的，仅有轻微波动，并且在整个模拟过程中保持结合。AZT-TP的RMSD在大约10 ns时达到初始平衡，然后在200 ns的模拟过程中出现中等波动。之后，平均RMSD逐渐增加，最终稳定在0.9–1.1 nm左右。这表明结合口袋内的构象发生了重排。此外，它并不导致NS3–AZT-TP复合物中观察到的波动。RMSF测量每个残基/原子从其原始位置的平均波动和灵活性（81,82）。图10b中的图表显示，在200 ns的模拟过程中，AZT-TP结合的NS3残基的平均RMSF值相对较低。参与氢键形成的NS3解旋酶/ATPase残基（Lys199、Lys201、Asp 284、Glu285和Asn416）在AZT-TP结合的NS3复合物中显示出较少的波动。这表明由于AZT-TP结合后原子运动和残基振动的减少，NS3残基的平均波动减少了。这导致配体结合的NS3复合物的灵活性整体降低。

表3. NS3和AZT-TP结合NS3复合物的结构稳定性和构象研究的MD模拟分析

轨迹分析
NS3
NS3–AZT-TP复合物
平均±SD
最小值
最大值
平均±SD
最小值
最大值
RMSD（nm）
0.51
0.24
0.00
0.51
2.63
1.05
0.20
0.00
0.51
3.6
RMSF（nm）
0.37
2.05
0.07
48
1.43
10.31
80.18
0.07
81.21
9
Rg（nm）
2.98
0.02
82.85
23.07
0.05
2.74
33.07
7
SASA（nm2）（2）
314.93
4.12
298.36
331.78
308.95
4.84
293.45
329.15

图10
图10. NS3（绿色）和NS3–AZT-TP（紫色）复合物的图表，显示了（a）均方根偏差（RMSD），（b）均方根波动（RMSF），（c）溶剂可及表面积（SASA）和（d）回转半径（Rg）。

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3.5.2. 回转半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）
SASA确定了暴露在溶剂中的对接复合物的表面积。它决定了配体结合如何影响目标蛋白的折叠和稳定性（83）。NS3蛋白和AZT-TP结合NS3复合物的平均SASA值几乎稳定，仅在约60 ns时AZT-TP结合的NS3复合物略有下降（图10c）。这表明AZT-TP结合后，NS3蛋白的SASA略有下降，这是由于局部构象变化所致。Rg决定了蛋白质和配体复合物在模拟过程中的灵活性、折叠特性、紧凑性、形状和大小的变化（84）。图10d中的图表显示NS3蛋白的平均Rg值是稳定的（表3）。然而，在AZT-TP结合后50 ns时略有增加，但在65 ns后保持稳定（图10d），这意味着AZT-TP结合后结构稳定性略有改变。此外，较低的Rg值表明AZT-TP结合的NS3复合物可能具有更紧凑和更刚性的结构，热力学稳定性更高。

3.5.3. 分子间氢键和二级结构分析
氢键是确定目标蛋白构象动态的重要参数。它提供了关于稳定性、方向性和相互作用特异性的见解，这些都是分子识别中的基本特征（85）。图11中的图表显示了AZT-TP和NS3之间随时间形成的分子间氢键。分析显示，NS3和AZT-TP之间的平均分子间氢键数量为五个，距离在0.35 nm以内的对数为九个。这表明AZT-TP适合NS3的结合位点。图表还显示，在200 ns的模拟过程中，NS3和AZT-TP之间不断形成氢键，没有断裂，表明形成了强而持久的分子间氢键和复合物。

图11
NS3–AZT-TP复合物之间的分子间氢键。

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此外，还确定了天然NS3和AZT-TP结合NS3复合物的二级结构元素随时间的变化以及按残基划分的二级结构含量。例如α-螺旋、β-折叠片和转角等元素被分解为每个时间步长的不同残基。分析显示，NS3和AZT-TP结合NS3复合物的总体二级结构元素是相似的。参与α-螺旋形成的残基数保持不变，参与β-折叠片和卷曲形成的残基数变化很小（支持信息图S4a和支持信息表S1）。通过残基比较NS3和NS3–AZT-TP复合物的二级结构含量，发现NS3蛋白在MD模拟研究过程中与AZT-TP蛋白结合时仍保持完全结构（支持信息图S4b）。

3.5.4. 通过MMPB(GB)SA的结合能
SAMMPB(GB)SA被认为是确定复合物结合自由能和构象的良好选择，因为它们在评分程序中表现有效（86,87）。使用AZT-TP结合NS3复合物200 ns MD模拟轨迹的最后5000帧（对应于最后50 ns）来确定结合自由能，其中复合物的RMSD显示出较低的波动。分析显示，从MMGBSA和MMPBSA获得的AZT-TP结合NS3复合物的总Gibbs自由能分别为-22.87 kcal/mol（SD ± 5.69 kcal/mol）和-25.22 kcal/mol（SD ± 5.96 kcal/mol），这表明配体结合是自发且有利的（图12a和13a以及支持信息表S2和S3）。静电和范德华相互作用/能量是主要贡献因素，支持了我们的对接结果（图12b和13b）。正的溶剂化能量被负的总能量和有利的相互作用所抵消。此外，MMPB(GB)SA的结果补充了我们的生物物理结合研究。

图12
(a) 使用MMGBSA获得的AZT-TP结合NS3复合物的总自由能图。
(b) 显示各种相互作用及其对AZT-TP与NS3结合贡献的图表。

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图13
(a) 使用MMPBSA获得的AZT-TP结合NS3复合物的总自由能图。
(b) 显示各种相互作用及其对AZT-TP与NS3结合贡献的图表。

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4. 结论
本研究描述了AZT-TP与登革病毒NS3蛋白的相互作用和抑制潜力。来自荧光光谱、ITC和SPR的详细生物物理见解揭示了AZT-TP与NS3蛋白的显著结合亲和力和热力学可行性。酶抑制实验显示，在AZT-TP存在下，NS3 ATPase活性呈剂量依赖性下降，表明其抑制潜力。计算机模拟研究表明，AZT-TP与C末端结构域的关键残基相互作用，这些残基参与解旋酶/ATPase活性。这些残基在Orthoflaviviruses（包括DENV）中是保守的。此外，使用MMPB(GB)SA计算的总Gibbs自由能和不同相互作用的贡献进一步验证了生物物理和对接结果。因此，我们建议AZT-TP可能与C末端NS3解旋酶结构域中参与ATPase活性的残基直接结合。由于ATP水解是病毒复制周期中的关键步骤之一，为DENV复制中间体的解离提供最佳能量，抑制ATPase活性可能会影响模板RNA的可用性，从而减少复制和病毒颗粒的组装。因此，这些初步发现为进一步探索AZT-TP在体外和体内环境中对NS3蛋白C末端结构域的抑制潜力提供了线索。