针对特定位点的原位金属化处理：利用线框DNA折纸技术实现可逆荧光切换

《ACS Nano》：Site-Specific In Situ Metallization of Wireframe DNA Origami for Reversible Fluorescence Switching

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DNA折纸纳米结构的可寻址性使得能够以纳米级精度实现功能性材料的定位。基于DNA折纸技术的金纳米颗粒因其可调的光学和电子特性而受到了广泛关注。在这项研究中，我们开发了一种自下而上的纳米制造策略，该策略将含有碘苯衍生物的合理设计的化学接头整合到线框DNA折纸模板中，以引导金离子的捕获和原位还原，从而实现定位金属化。随后，我们将荧光染料Cy3引入金属化的折纸模板中，通过能量转移展示了距离依赖性的荧光淬灭现象。作为概念验证，我们还展示了该混合系统的动态可编程性，通过链置换反应移除了荧光团，实现了荧光的完全恢复。

**引言**
无机纳米材料的光学、电子和磁学性质强烈依赖于其组成、尺寸、形状和空间排列。因此，大量研究工作集中在开发具有可定制特性和狭窄尺寸分布的无机纳米颗粒上，这些纳米颗粒可用于多种应用，包括纳米光子学、(2)电子纳米器件、(3,4)催化系统、(5?7)以及生物医学科学。(8?10) 由于DNA折纸具有内在的可寻址性和纳米级可调性，它已成为自下而上制造无机材料（如二氧化硅、(11?13)磷酸钙、(14)以及金属和金属氧化物纳米颗粒)(15?19)的有希望的模板。最近的研究还展示了使用DNA模板组装三维(3D)金属、金属氧化物和半导体框架的方法，(20)以及利用原子层沉积等技术对DNA折纸晶体进行均匀无机涂层。(21) 这些基于折纸的方法突显了DNA纳米结构在引导构建具有高空间精度、结构均匀性和精确形态控制的复杂纳米结构方面的潜力。(17,22)

有两种主要策略用于引导基于DNA折纸的金属化。第一种方法是通过将外部合成的纳米颗粒与折纸结合，利用从折纸突出的互补DNA链进行杂交。(23?26) 这些纳米颗粒可以作为种子，通过在其上原位还原金属盐来进一步生长。(27?29) 第二种策略涉及设计一个成核位点，使金属前体聚集，然后使用特定的还原剂将其还原为相应的纳米颗粒。(15,16,30?33) 许多此类策略都集中在金纳米颗粒上，因为它们具有独特的特性，如局域表面等离子体共振、(34,35)可调的光学性质、(36?38)以及易于表面功能化。(39?42) 通过DNA杂交将预合成的金纳米颗粒连接到DNA纳米结构上，形成高度有序的等离子体组装体。(43?47) 然而，随着DNA结构的复杂性增加，这种策略可能会受到外部纳米颗粒扩散的立体阻碍。例如，在复杂的3D DNA晶格系统中，将纳米颗粒插入内部结合腔可能非常困难甚至不可能，导致位点占用率降低和组装效率低下。因此，原位纳米颗粒合成提供了一种替代策略，通过在折纸模板上直接创建局部化学环境来促进金属前体的成核和还原，从而可能提高制造复杂等离子体系统的位点选择性和组装产量。先前的研究探索了通过卤离子介导的金纳米颗粒生成。(48,49) Pigliacelli等人在2019年报道了通过C–I键活化苯丙氨酸碘苯来合成金纳米颗粒的方法。(50) 然而，这种键活化化学尚未被用作在DNA折纸模板上原位合成金纳米颗粒的正交策略。

受此启发，我们开发了一种基于碘离子的金属化策略，使用自制的碘苯衍生物与DNA（Iodo-DNA）结合，以实现直接在线框DNA折纸支架上控制大小的金纳米簇的定位生长（图1a）。然后，我们将荧光染料Cy3引入金属化的折纸模板中，并通过能量传递展示了距离依赖性的荧光淬灭（关闭“荧光”）。最后，我们利用趾部介导的链置换反应（TMSDR）(51,52)从折纸系统中移除荧光团，从而有效地重新激活荧光（打开“荧光”）（图1b）。使用外部合成的金纳米颗粒-DNA缀合物修饰的线框折纸纳米结构作为参考系统，比较了金属化效率、邻近诱导的荧光淬灭以及随后的TMSDR介导的荧光恢复与原位金属化的纳米开关（图1c）。

**结果与讨论**
**合成与设计**
我们首先设计了一种八边形、蜘蛛网状的线框DNA折纸纳米结构，直径为145纳米，厚度为2纳米，通过折叠长M13mp18支架DNA（7249个碱基）并使用短固定链实现。该折纸模板设计有16个单链捕获链，分布在最内层的八个臂上。然后，我们设计并合成了含有两个碘苯（2-IB）当量的树状大分子，作为还原剂，用于将Au(III)转化为Au(0)（图2a）。详细的合成方案包含在支持信息中（方案1，合成方案）。评估了这种定制合成分子在各种缓冲系统（包括HEPES-Mg2+和TAE-Mg2+）中形成金纳米簇的能力。当该分子与HAuCl4在HEPES缓冲液中孵育4小时时，观察到从无色到紫色的可见颜色变化（图S1）。当100 μM的2-IB与500 μM的Au(III)反应时，在500–800纳米范围内出现了特征性的等离子体吸收峰，证实了金纳米簇的形成。单独的2-IB或Au(III)没有观察到等离子体带，表明纳米簇的形成需要这两种成分（图2b）。在这个系统中，HEPES既起到稳定剂的作用，也起到弱还原剂的作用，(53,54) 生成初始的还原态金物种，从而激活2-IB的C–I键。这种激活可能通过先前文献中强调的几种机制进行。(50,55,56) 激活的C–I键随后促进Au(0)物种的生成，并作为金纳米颗粒形成的成核位点。我们的实验数据表明，在金纳米颗粒形成过程中，HEPES和2-IB都是必需的。

**图2**
(a) 示意图展示了Iodo-DNA与线框折纸模板结合的机制，以在折纸中心引导金纳米簇的定位生长；(b) UV–vis吸收光谱显示了当100 μM的2-IB与500 μM的HAuCl4在1 mM HEPES-12.5 mM Mg2+缓冲液中处理时出现的等离子体带（黑线）；红色和蓝色图表分别显示了在同一缓冲系统中使用500 μM的HAuCl4和100 μM的2-IB的对照实验。在这些对照实验中看不到等离子体带。(c) 用Iodo-DNA修饰的折纸模板的AFM图像和高度分析，显示修改部位的厚度约为1.5纳米，没有明显的高度增加；(d) 用50 μM的HAuCl4处理并在25 °C下振荡5小时的Iodo-DNA修饰的折纸，修改部位的高度增加了2.4纳米；96.4%的折纸显示成功金属化（N = 166）；(e) 用50 μM的HAuCl4处理并在30 °C下孵育5小时的Iodo-DNA修饰的折纸，修改部位的高度增加了1.6纳米；(f) 用250 μM的HAuCl4处理并在25 °C下振荡10分钟的Iodo-DNA修饰的折纸，修改部位出现了较大的高度增加，为6.6纳米（刻度尺：300纳米）；(g) 5 nm AuNPs与硫醇修饰的DNA结合的示意图以及相应的UV–vis光谱，显示DNA在260纳米处的特征吸收和AuNPs在520纳米处的吸收；(h) 通过与八个突出的捕获链杂交将AuNP-DNA与折纸模板结合的示意图；(i) 带有突出捕获链的线框折纸模板的AFM图像（刻度尺：300纳米）；(j) AFM图像显示AuNPs与模板的成功结合，产率为100%（N = 245，刻度尺：300纳米），以及AFM高度分析显示修改部位的高度增加了6.8纳米。

**2-IB衍生物的后续处理**
该2-IB衍生物随后通过Click反应在1:1的水/DMSO反应混合物中与二苯并环辛炔-四乙二醇（DBCO–TEG）修饰的单链DNA（18 nt）结合。所得到的2-IB修饰的DNA（Iodo-DNA）通过HPLC纯化，并通过MALDI-TOF光谱进行表征（图S2）。

**在线框DNA折纸模板上的原位定位还原Au(III)**
在确认2-IB衍生物分子成功促进了金盐向纳米簇的还原后，我们在具有16个单链捕获链的区域用Iodo-DNA修饰了线框DNA折纸（表S1和图S3）。将3 nM : 6 nM的支架/固定链DNA混合物在含有12.5 mM Mg2+的1 mM HEPES缓冲液中退火。原子力显微镜（AFM）图像显示了折纸纳米结构的组装，且在修改部位没有观察到显著的高度增加（图2c和图S4）。然后，这种混合折纸未经进一步纯化直接用50 μM的HAuCl4处理，并在25 °C下振荡5小时。对单个代表性折纸的AFM分析显示，线框折纸最内层的位置高度增加了2.4纳米，该位置设计用于捕获Iodo-DNA。96.4%的折纸在预定位置成功金属化（图2d和图S5及S8）。有趣的是，即使在24小时后，纳米簇仍然局限于线框折纸的中心核心，没有进一步的过度生长，表明还原反应完成并形成了稳定的纳米簇（图S10）。使用双链DNA而不是Iodo-DNA修饰的线框折纸进行了阴性对照实验。在这种情况下没有观察到显著的金属化，表明Iodo-DNA对金属生长是必需的（图S6）。接下来，我们研究了温度调节对金属化反应的影响。将修饰后的折纸在略微升高的温度30 °C下与Au(III)盐孵育5小时后，观察到折纸中心的金属生长略小且更均匀。这通过AFM高度分析得到证实，金属化位置的高度增加相对较低，为1.6纳米（图2e和图S7及S11）。这表明仔细调节温度可以帮助控制成核速率和最终纳米颗粒的大小。最后，我们还研究了用非常高浓度的Au(III)盐（250 μM）处理折纸的效果。AFM分析显示，反应仅10分钟后，折纸模板就被金属完全覆盖，表明反应速率随浓度增加而增加（图2f和图S12）。发现用Iodo-DNA修饰的中心核心的金属化程度最高，随后金属向线框的外层生长，形成了覆盖其余模板的较薄的金层。通过AFM分析，在折纸的中心位置观察到金属纳米簇的生长，垂直高度为6.6纳米（图2f）。我们还修改了折纸设计，使其具有不同的Iodo-DNA接头密度，以研究这对产量和颗粒大小的影响，如图S13所示。原子力显微镜（AFM）分析表明，随着碘化DNA手柄密度的增加，纳米团簇的大小和金属化产率也随之提高，这表明这种金属化策略具有可编程性。在折纸模板上附着金纳米颗粒后，我们通过将外部合成的金纳米颗粒（AuNPs）整合到折纸模板中，构建了一个参考系统，以比较其与我们原位金属化系统的行为。为此，我们首先使用硫醇修饰的DNA（20个核苷酸，带有T-10间隔序列）通过Au–S键合将市售的5纳米直径AuNPs功能化（详见“材料与方法”部分）。这些带有DNA链的AuNPs显示了DNA在260纳米处的特征吸收峰，而AuNPs本身在520纳米处有吸收峰（图2g）。设计的折纸框架包含八个突出的单链捕获DNA（10个核苷酸），这些DNA与AuNPs上的修饰DNA链互补。未经纯化的折纸模板（3纳摩尔浓度）随后用48纳摩尔的AuNPs处理，并在13小时内从45摄氏度逐渐冷却至15摄氏度，以实现AuNPs的成功功能化（图2h）。对带有捕获链的折纸模板进行AFM分析未显示出明显的高度增加（图2i），而经过AuNPs修饰的模板则显示内部核心有6.8纳米的高度和约40纳米的直径，表明每个折纸模板捕获了多个AuNPs，功能化效率几乎达到定量水平（约100%）（图2j及图S15和S16）。

通过原位金纳米团簇生长的Cy3荧光时间依赖性淬灭现象，金通过从Cy3（供体）向金属转移能量来淬灭Cy3染料荧光的能力，在基于金的生物传感器设计中非常重要，用于检测特定分析物。（57,58）基于我们特定的金纳米团簇沉积策略，我们接下来利用DNA折纸的可编程性，以纳米级精度定位荧光团，构建了一个能够实现可逆“开”和“关”状态的荧光纳米开关。作为初步演示，我们将Cy3-DNA插入到折纸框架内部核心的碘化DNA修饰位点附近，从而实现了荧光“开”状态（图3a）。Cy3-DNA的构型设计使得Cy3染料与折纸模板处于同一平面，以促进金与Cy3之间的有效相互作用。随后，用50微摩尔的HAuCl4处理带有荧光团的折纸，以在预定位置控制形成金纳米团簇（图3b），这与图2d中显示的金属化条件一致。荧光光谱用于分析从加入Au(III)开始（0小时）到5小时期间Cy3荧光的时间依赖性淬灭过程（图3c和图S17）。在520纳米的激发波长下，大部分荧光淬灭发生在第一个小时内，表明Au(III)还原为Au(0)的反应在这个时间尺度上几乎完成。

为了研究加速金属化的效果，我们使用250微摩尔的HAuCl4处理了一个类似的Cy3修饰折纸模板，以诱导金属过度生长（图3d），如之前在图2f中所展示的。样品在520纳米的波长下被激发，并在反应开始后1小时内监测荧光淬灭情况。正如预期的那样，大部分Cy3荧光在加入Au(III)盐后的前10分钟内被淬灭（图3e和图S17）。这些结果表明，增加Au(III)浓度会加速纳米团簇的形成，导致荧光迅速且几乎完全淬灭。

DNA折纸的可编程性使得能够精确控制荧光团与金属纳米簇之间的空间距离。当Cy3位于金纳米簇最近时，淬灭效率最高，并且随着距离的增加而降低。此外，淬灭效率还取决于金纳米簇的大小和形态。基于此，我们比较了原位生成的金纳米簇与外部合成的AuNPs结合到折纸框架上的淬灭效率。我们首先修改了我们的折纸框架（带有碘化DNA），在距离折纸中心点三个定义的距离处（d-1（最近）、d-2（中间）和d-3（最远）分别引入Cy3染料。在加入Au(III) 5小时后，比较了荧光淬灭效率（图4a–c和图S19）。对于这些原位金属化的模板，随着荧光团距离中心的增加，荧光淬灭程度增加（黑线与未金属化的对照组（红线）相比）。当荧光团位于d-1（约23.5纳米）时，淬灭程度最大，归一化荧光强度从1降低到0.47（±0.05，N = 3）。在中间距离d-2（约36.5纳米）时，荧光强度从1降低到0.64（±0.05，N = 3），而在最远距离d-3（约55.5纳米）时，荧光强度从1降低到0.83（±0.03，N = 3）。因此，淬灭效率遵循预期的顺序d-1 > d-2 > d-3（图4d）。在相同的实验条件下，对Cy3-折纸系统进行了阴性对照实验，以确认在没有碘化DNA的情况下没有显著的发射强度淬灭现象（图S18）。

接下来，我们设计了三个用外部合成的5纳米AuNPs修饰的折纸框架模板，Cy3位于相同的距离d-1、d-2和d-3（图4e–g和图S20）。最大淬灭效应再次出现在d-1位置，归一化荧光强度从1降低到0.40（±0.10，N = 3）。在d-2位置，荧光强度从1降低到0.68（±0.06，N = 3）；在d-3位置，荧光强度从1降低到0.89（±0.06，N = 3），同样遵循d-1 > d-2 > d-3的顺序。接下来，我们设计了三个用外部合成的5纳米AuNPs修饰的折纸框架模板，Cy3也位于相同的距离d-1、d-2和d-3（图4e–g和图S20）。在加入Au(III) 5小时后，观察到最大的淬灭效应（图4h）。与原位金属化系统一致，同样遵循d-1 > d-2 > d-3的距离依赖性趋势。值得注意的是，原位生成的金纳米簇的淬灭效率与商业购买的AuNPs相当，进一步验证了我们自制特定位点还原策略的稳健性和空间可控性。

最后，我们设计了一个动态DNA折纸系统，其中Cy3荧光团可以从金属化模板上被置换，从而恢复被淬灭的荧光。为此，在Cy3-DNA链中引入了一个8个核苷酸的捕获结构域，该结构域与折纸上的突出捕获链杂交。加入120纳摩尔的入侵链（C-DNA），由于TMSDR作用，Cy3-DNA链从DNA折纸上被置换到溶液中，使金属化折纸的荧光得以恢复（图5a）。光谱分析显示，Cy3修饰的对照组（位于d-1）在原位金属化后处于“开”状态，归一化强度为I = 1，随后降低到0.55（±0.04，N = 3）（“关”状态）。随后加入C-DNA导致Cy3-DNA从折纸框架上被置换，荧光完全恢复，归一化强度为I = 1.07（±0.07，N = 3）（图5b和图S21）。为了对比，还准备了一个用外部合成的AuNPs修饰的折纸框架模板，Cy3位于d-1位置。在这个系统中，加入C-DNA导致Cy3-DNA从模板上被置换，荧光得以恢复（图5c）。荧光光谱显示，Cy3修饰的对照组在AuNP附着后荧光“开”（I = 1），随后被淬灭到0.55（±0.14，N = 3）；加入C-DNA后，Cy3-DNA从折纸框架上被置换，荧光完全恢复（I = 0.99 ± 0.02，N = 3）（图5d和图S22）。

在这项工作中，我们首次展示了设计和组装了一种蜘蛛网形状的折纸DNA框架支架，作为原位金属化的模板，使用我们自制的碘化DNA结合物作为HEPES缓冲液中的位点特异性成核剂。这种自下而上的纳米制造方法依赖于创建一个局部的、定制的化学环境，使得C–I键在DNA折纸模板上的预编程位置高效地形成金纳米簇。然后，我们利用这一平台展示了位于金属化位点附近的Cy3荧光团的时间依赖性荧光淬灭现象。系统地改变荧光团与金属之间的距离发现，当Cy3距离金纳米簇最近时，淬灭效率最高，并且随着距离的增加而降低。此外，淬灭效率还取决于金纳米簇的大小和形态。基于此，我们比较了原位生成的金纳米簇与外部合成的AuNPs结合到折纸框架上的淬灭效率。我们首先修改了折纸框架（带有碘化DNA），在距离中心点三个定义的距离处（d-1、d-2和d-3）引入Cy3染料。在加入Au(III) 5小时后，比较了荧光淬灭效率（图4a–c和图S19）。对于这些原位金属化的模板，随着荧光团距离中心的增加，荧光淬灭程度增加（黑线与未金属化的对照组（红线）相比）。当荧光团位于d-1（约23.5纳米）时，淬灭程度最大，归一化荧光强度从1降低到0.47（±0.05，N = 3）。在中间距离d-2（约36.5纳米）时，荧光强度从1降低到0.64（±0.05，N = 3）；而在最远距离d-3（约55.5纳米）时，荧光强度从1降低到0.83（±0.03，N = 3）。因此，淬灭效率遵循预期的顺序d-1 > d-2 > d-3（图4d）。在Cy3-折纸系统上进行了阴性对照实验，以确认在没有碘化DNA的情况下，发射强度没有显著淬灭现象（图S18）。

接下来，我们设计了三个用外部合成的5纳米AuNPs修饰的折纸框架模板，Cy3同样位于d-1、d-2和d-3位置（图4e–g和图S20）。最大淬灭效应再次出现在d-1位置，归一化荧光强度从1降低到0.40（±0.10，N = 3）。在d-2位置，荧光强度从1降低到0.68（±0.06，N = 3）；在d-3位置，荧光强度从1降低到0.89（±0.06，N = 3），同样遵循d-1 > d-2 > d-3的顺序。值得注意的是，原位生成的金纳米簇的淬灭效率与商业购买的AuNPs相当，进一步验证了我们自制特定位点还原策略的稳健性和空间可控性。

最后，我们设计了一个动态DNA折纸系统，其中Cy3荧光团可以从金属化模板上被置换，从而恢复被淬灭的荧光。为此，在Cy3-DNA链中引入了一个8个核苷酸的捕获结构域，该结构域与折纸上的突出捕获链杂交。加入120纳摩尔的入侵链（C-DNA），由于TMSDR作用，Cy3-DNA链从DNA折纸上被置换到溶液中，使金属化折纸的荧光得以恢复（图5a）。光谱分析显示，Cy3修饰的对照组（位于d-1）在原位金属化后处于“开”状态，归一化强度为I = 1，随后降低到0.55（±0.04，N = 3）（“关”状态）。随后加入C-DNA导致Cy3-DNA从折纸框架上被置换，荧光完全恢复，归一化强度为I = 1.07（±0.07，N = 3）（图5b和图S21）。为了对比，还准备了一个用外部合成的AuNPs修饰的折纸框架模板，Cy3位于d-1位置。在这个系统中，加入C-DNA导致Cy3-DNA从模板上被置换，荧光得以恢复（图5c）。荧光光谱显示，Cy3修饰的对照组在AuNP附着后荧光“开”（I = 1），随后被淬灭到0.55（±0.14，N = 3）；加入C-DNA后，Cy3-DNA从折纸框架上被置换，荧光完全恢复（I = 0.99 ± 0.02，N = 3）（图5d和图S22）。最终，我们使用TMSDR实现了一个可编程的荧光开关，该开关能够将荧光团从模板上移除，并可逆地恢复被淬火的金属折纸的荧光。总结来说，我们报告了一种通过碘化作用在极其温和的反应条件下原位生成均匀金纳米团簇的策略，使得这种方法能够很容易地与生物系统兼容。先前的研究使用紧密堆积的折纸模板来生长高密度的金属纳米粒子阵列。(15,30,59) 我们的线框系统具有8重对称性，这使得捕获探针可以以期望的密度对称排列，使其成为点特异性生长可控金属纳米团簇的理想模板。此外，它们在低盐条件下的稳定性使它们成为生理环境中生物医学应用的理想候选者。(60) 这种原位还原方法可以应用于上述其他紧密堆积的折纸系统，通过调整探针密度和实验条件，有效地生成用于各种纳米电子应用的高密度纳米团簇图案。与传统的染料-淬灭系统相比，等离子体折纸系统能够对染料相对于金属纳米粒子的位置进行纳米级的控制。8重对称线框折纸的独特几何特性允许在中心纳米粒子团簇周围排列多个荧光团，从而在单个平台上实现多种分析物的多重检测。总体而言，这项工作建立了一种多功能且化学上正交的自下而上的纳米制造策略，扩展了DNA折纸在生物传感和光子学应用中的功能范围。

**材料与方法**

**2-IB的合成**
所有试剂级化学品均从Oakwood Chemicals和MilliporeSigma（美国）购买。TLC分析使用涂有硅胶-60 F254的铝板进行。柱层析使用200–400目硅胶进行。所有实验步骤均使用去离子超纯水（18.2 MΩ·cm）进行。使用Bruker Avance光谱仪记录1H和13C NMR光谱，以四甲基硅烷（TMS）作为内标。Bruker Ultra fleXtreme MALDI-TOF质谱仪用于MALDI-TOF分析。

**DNA与金纳米粒子的结合**
从Ted Pella购买了5纳米大小的柠檬酸包覆的金纳米粒子（AuNP）。硫醇-DNA（5′-thiol-TTTTTT TTTTGATTGACAGC-3′）从Integrated DNA Technologies购买。为了形成AuNP-DNA混合物，准备了60 nM的AuNP、30 μM的硫醇-DNA和350 μM的十二烷基硫酸钠，总反应体积为300 μL。该混合物在30°C和800 rpm下振荡1小时。之后，每小时向混合物中加入5 μL的2 M NaCl，持续6小时。然后以800 rpm振荡过夜。接着在15,000 rpm和4°C下离心1小时，使AuNP-DNA在管底形成沉淀物，弃去上清液。将沉淀物重新溶解在300 μL的超纯水中。这些离心步骤重复两次。第三次离心并弃去上清液后，将沉淀物溶解在25 μL的超纯水中。使用Thermo Fischer NanoDrop分光光度计测定AuNP的浓度和吸光光谱（AuNP的消光系数为11,000,000）。

**线框DNA折纸的制备**
使用来自New England Biolabs（目录号N4040S）的M13mp18单链DNA（7249个碱基）作为折纸的支架。DNA连接链以100 μM的浓度从Integrated DNA Technologies购买，并按原样使用，无需进一步纯化。用于碘化DNA捕获的线框折纸在含有12.5 mM醋酸镁的1 mM HEPES缓冲液中退火。用于AuNP结合的捕获链的线框折纸在含有12.5 mM醋酸镁的1X TAE缓冲液中退火。将含有支架DNA（3 nM）和连接链（6 nM）的混合物在适当的缓冲液中放入Eppendorf PCR热循环仪中，加热至95°C，然后以恒定速率缓慢冷却至4°C，具体步骤为：94–86°C每5分钟降低1°C，85–70°C每5分钟降低1°C，70–40°C每15分钟降低1°C，40–25°C每10分钟降低1°C，最后保持在4°C。

**碘化DNA的结合**
加入96 nM的碘化DNA（与组装好的折纸的捕获链互补），将混合物加热至35°C，然后逐渐冷却至4°C，整个过程持续8小时。退火协议如下：35–26°C每15分钟降低1°C，25–10°C每20分钟降低1°C，最后保持在4°C。

**AuNP的结合**
加入48 nM的AuNP-DNA（与组装好的折纸的捕获链互补），将混合物加热至45°C，然后逐渐冷却至15°C，整个过程持续13小时。退火协议如下：45–20°C每30分钟降低1°C，18°C保持10分钟，16°C保持10分钟，最后保持在15°C。

**Cy3-DNA的结合**
将6 nM的Cy3-DNA加入未纯化的折纸中，并将混合物加热至30°C，然后以每10分钟降低2°C的速率逐渐冷却至10°C。Cy3-DNA（5′-Cy3 CATCGGTGGCAGTACGTCTCGC-3′）与线框折纸模板上的突出互补链杂交。之后将混合物保持在4°C。

**AFM成像和凝胶电泳**
使用Bruker的Dimension FastScan AFM在“ScanAsyst in Liquid”模式下进行AFM成像。成像使用Bruker的ScanAsyst-Fluid+探针。

**AFM成像样品制备**
向新鲜切割的云母（Ted Pella）表面加入10 μL的1X TAE/Mg2+缓冲液，形成均匀层。然后均匀地将8 μL的折纸样品沉积在缓冲液层上。将混合物在室温下孵育10分钟，使其附着在云母表面。接着用70 μL的1X TAE/Mg2+缓冲液冲洗以去除多余的连接链。此冲洗步骤重复三次。最后，向云母中加入70 μL的1X TAE/Mg2+缓冲液和3.5 μL的100 mM NiCl2溶液，然后立即进行成像。

**凝胶电泳**
使用0.9%的琼脂糖凝胶在1X TAE/Mg2+缓冲液中制备折纸组装体。将凝胶放入室温水浴中，施加75 V电压2小时。使用GelRed染料进行凝胶染色，并使用1 kb的DNA梯子（来自IBI）进行凝胶条带分析。

**荧光光谱**
使用配备Peltier细胞架的Horiba Jobin Yvon荧光仪进行稳态荧光光谱测量，使用石英比色皿（体积50 μL，光程10 mm）。荧光测量在520 nm的激发波长下进行，发射范围为535至700 nm。平均值±标准差基于三次独立实验计算得出。