基于正向-反向冲洗阀辅助的选择性调节技术（FBF-VAST）在液-液萃取中的应用：调制机制的原理与实验验证
《Analytical Chemistry》：Forward–Backward-Flushing Valve-Assisted Selectivity Tuning (FBF-VAST) for LC × LC: Principles and Demonstration of a Modulation Mechanism
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时间：2026年05月13日
来源：Analytical Chemistry 6.7
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介绍了一种用于全面二维液相色谱（LC × LC）的调制机制，称为FBF-VAST（正向-反向冲洗阀辅助选择性调节）。该技术通过围绕四通阀的简单系统配置实现调制。其原理是对一维（1D）柱进行周期性的正向-反向冲洗，从而实
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介绍了一种用于全面二维液相色谱（LC × LC）的调制机制，称为FBF-VAST（正向-反向冲洗阀辅助选择性调节）。该技术通过围绕四通阀的简单系统配置实现调制。其原理是对一维（1D）柱进行周期性的正向-反向冲洗，从而实现与传递到二维（2D）柱的阶梯梯度同步的分析物保持和释放。调制周期（PM）由正向和反向冲洗时间（tfwd + tbwd）定义，净注射窗口（Δtnet = tfwd – tbwd）将分析物组分送入2D柱。这些过程使用修改了分析物保留特性的对流-扩散方程进行模拟，得到了溶剂和分析物的时空分布图，并通过动画展示了调制机制。通过1D柱模拟和使用两个C18柱在统一二元梯度下的LC × LC实验，证明了独特的选择性调节效果，成功分离出了27-55个目标峰。选择性可以通过调节阀A的开启时间（tfwd）或梯度陡度来有效调整，而无需改变流动相组成或固定相化学性质。重复性研究表明，峰面积的%RSD在5.28-11.77%之间（n = 6）。此外，该方法还支持在线清洗1D柱，可能延长柱寿命并提高稳定性。这种成本效益高且可调的LC × LC策略提供了对色谱选择性和长期稳定性的更好控制，所有这些都在简化的仪器设计中实现。
**引言**
二维液相色谱（2D-LC）是解析生物制药、聚合物、食品和环境样品中复杂或不纯混合物的强大平台。(1?4) 在其配置中，LC × LC通过连接两个柱并使用调制器来增加分离的峰数，从而提高非目标分析的能力。(5?8) 这种方法每单位时间提供更高的峰容量，实现高分辨率和高通量分离。
被动或非聚焦调制仍然是LC × LC中的主要策略，主要是因为其操作简单。(5,9) 然而，这也存在一些缺点，如第一维（1D）和第二维（2D）分离中使用的溶剂不兼容以及峰聚焦的限制。(5,10) 为了解决这些问题，开发了主动调制策略，这些策略能够实现溶剂兼容性和峰压缩。(11) 但这些策略通常需要双泵系统、多通阀设置、辅助捕获柱或专门的低温或膜基设备，其中一些设备无法商业获得或需要复杂的定制。(12,13)
尽管反向冲洗技术最初用于1976年通过强有机溶剂清除1D-HPLC系统柱头上的脂肪残留物，(14) 但此后它也被用于保护HPLC和GC工作流程中的分析柱免受污染。(15,16) 最近，它还被重新用于样品富集（17），并应用于包括HPLC/GC联用(18)和基于入口反向冲洗的GC × GC配置(19)在内的多种平台。开发一种保持仪器简单性的具有反向冲洗功能的LC × LC系统仍然是一个重要的技术挑战。
**案例研究**
红葡萄酒提供了一个具有高度复杂性和重要商业价值的基质。它含有来自植物次级代谢的多种多酚化合物。这些成分显著贡献了葡萄酒的感官品质（如风味、口感、香气）和生物活性。(20) 由于它们的广泛动态范围和结构多样性，一维HPLC技术往往难以分离和定量这些分析物。如果以成本效益高且操作简单的方式实施，高分辨率LC × LC方法可以解决这些挑战。(21?23)
在这里，介绍了一种新的调制策略，称为正向-反向冲洗阀辅助选择性调节（FBF-VAST）。该机制使用单个四通阀周期性地对1D柱进行正向和反向冲洗，从而控制引入2D柱的分析物带的时间和组成。该方法利用冲洗过程中的流动相强度增加，实现了分析物区域的重塑和动态富集，而无需低温冷却或外部捕获盒。FBF-VAST概念的核心在于它仅通过阀定时和梯度设计就能动态调节选择性，即使使用单一流动相系统和固定相化学性质也是如此。这对于希望简化硬件而不牺牲分离能力的实际LC × LC应用来说是一个重要的突破。(24)
该系统还支持分离后的1D柱反向冲洗，允许在每次LC × LC运行后进行在线柱清洗。这一特性有助于防止样品基质（如葡萄酒中的蛋白质或色素）造成的长期污染，减少携带效应，并延长柱寿命——所有这些都不需要额外的泵或切换阀。同一阀配置同时用于调制和维护的双重用途突显了系统的效率、稳健性和实际适应性。据我们所知，这是最简单的LC × LC配置，能够在保持反向冲洗功能的同时实现完全的梯度兼容选择性调节。
**实验部分**
**结果模拟**
FBF-VAST调制的模拟使用Python进行，采用修改了分析物在1D柱上保留特性的对流-扩散方程。正向和反向冲洗周期作为时间依赖的边界条件实现，从而计算出分析和物在空间和时间上的浓度分布。更多方法细节见“理论背景”和“FBF-VAST中流动相梯度动力学模拟”部分。
**化学品和材料**
二氯甲烷（DCM）、乙醇和乙腈购自Merck（德国达姆施塔特），无水硫酸镁购自Panreac（西班牙巴塞罗那）。苯甲酸、咖啡因、咖啡酸、(+)-儿茶素、绿原酸、(-)-表儿茶素、没食子酸、烟酸、对香豆酸、白藜芦醇和香草酸购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。表S1中列出的葡萄酒样品来自泰国、澳大利亚和法国的不同地点。
**样品制备**
将10 mL葡萄酒样品用25.0 mL DCM提取三次，以减少糖类和花青素等高极性成分，从而简化基质并富集提取物中的酚类和其他中等疏水性化合物。(25,26) 有机提取物在无水硫酸镁上干燥后过滤。(27) 使用TurboVap Classic LV自动蒸发系统（Biotage）在N2气体下蒸发溶剂。将10.0 mg的葡萄酒提取物溶解在1 mL乙醇中，并通过W1–W10滤膜过滤后注入LC。选择了一种粗W4葡萄酒溶液，用于1D-LC和2D-LC分析，以研究该方法中的参数效应。
每种标准储备溶液通过将其溶解在甲醇、乙醇或水中制备至1000 mg/L的浓度。
将25.0 mL葡萄酒样品（W6）蒸发至干涸。然后将残渣用5.0 mL乙醇复溶并通过膜过滤器过滤，再进行LC注射。所得溶液称为预浓缩葡萄酒（PW6），用于处理更复杂样品的部分。
**LC仪器**
FBF-VAST LC × LC系统建立在HPLC Agilent 1260 infinity模型（美国加利福尼亚）上，包括一个四通泵（G7111B）连接到一个小瓶采样器（G7129A）和一个多柱恒温器（G7116A），并使用二极管阵列检测器（DAD，G7115A）进行检测。2D系统通过一个控制器四通双位置阀（VICI，瑞士Schenkon）连接：A位置（垂直）和B位置（水平）。反相柱分别为Water AccQ-Tag C18（3.9 × 150 mm，4.0 μm）和Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 × 100 mm，3.5 μm），用作1D和2D柱。
流动相由Milli-Q水（A）和乙腈（B）组成，具有不同的梯度步骤（详见表S2）。流速设置为0.5 mL/min，注射体积为10.0 μL。使用波长为210 nm的UV–vis检测器（DAD WR）检测葡萄酒样品中的分离组分。DAD光谱扫描模式用于获取每个峰的光谱。注射后2分钟激活阀门。
**FBF-VAST LC × LC系统配置**
LC自动进样阀连接到阀调制器的1号端口。1D柱安装在2号和4号端口，2D柱安装在3号端口（图1A）。阀A位置表示正向流动方向（tfwd），阀B位置表示反向流动方向（tbwd）。
**图1**
图1. FBF-VAST LC × LC配置示意图（A），阀切换期间%梯度流动相行为细节（B），以及模拟结果中丙酮检测的流动相跟踪图（C）和实验结果（D）。
**停止流动LC × LC系统配置**
LC自动进样阀连接到阀调制器的1号端口。1D柱安装在2号和3号端口，2D柱安装在4号端口（图S1）。其他部分与FBF-VAST LC × LC系统相同。阀A位置表示1D和2D分离中的流动方向（tfwd），阀B位置表示2D分离中的流动方向（tbwd）。
**梯度流动相斜率的影响**
两个反相柱分别为Water C18和Agilent C18，分别作为1D和2D柱。通过使用五种线性梯度斜率来确定合适的流动相。流动相在5分钟内设置为10%（v/v），然后在第20分钟逐渐增加到90%（GMP1）、80%（GMP2）、120%（GMP3）、160%（GMP4）和230%（GMP5）。每种流动相系统的详细信息见表S2。FBF-VAST LC × LC的阀切换时间设置为tfwd 120秒和tbwd 90秒，停止流动LC × LC的阀A周期为30秒，阀B周期为180秒。注射后2分钟激活阀门。
**调制机制对峰高的影响**
我们比较了FBF-VAST LC × LC和停止流动LC × LC，使用上述阀切换条件研究了五种标准溶液（没食子酸、香豆酸、苯甲酸、咖啡因和白藜芦醇，浓度为50.00 mg/L）的混合物。使用GMP4条件，通过每个标准的峰高计算观察到的百分比增加。
**1D柱中反向流动方向的影响**
研究了FBF-VAST LC × LC机制中的反向流动方向（tbwd）与正常流动方向（tfwd）的影响，遵循图1A中的流动箭头。使用tfwd 120秒和tbwd 90秒进行分离，不使用2D柱。分析了HPLC色谱图中正常和反向柱方向的可分离峰数量。
**阀位置持续时间的影响**
调制周期固定为210秒，同时改变阀切换时间为tfwd 150秒和tbwd 60秒、tfwd 135秒和tbwd 75秒、tfwd 120秒和tbwd 90秒、tfwd 114秒和tbwd 96秒、tfwd 111.25秒和tbwd 98.75秒、tfwd 107.5秒和tbwd 102.5秒。根据2D图分离空间覆盖率和分离峰的数量确定最佳调制周期。
**分离峰计数程序**
将1D调制色谱图转换为2D对照图，并使用基于Python的算法进行峰检测，该算法采用图像分割和轮廓分析。随后通过手动验证纠正了低强度峰、环绕特征和偶尔的错误检测。
**FBF-VAST中1D柱的梯度流动相行为**
通过HPLC-UV–vis传统方法监测1D柱中的梯度流动相行为，(28) 使用Milli-Q水作为流动相A，乙腈作为流动相B，不连接2D柱。注入空白样品（1.0 μL），在265 nm处检测到流动相B中的乙腈，显示出强吸收。
**实验条件研究**
在保持210秒恒定调制周期的情况下，研究了不同的阀切换时间下的FBF-VAST操作。实验参数包括从10%到90%的梯度变化，持续时间不同，并调整了阀门A的切换时间。通过基于Python的算法结合手动验证来计算分离出的峰的数量，以评估每种条件的性能并选择最合适的条件。方法验证通过使用GMP4对W4样本进行六次重复实验来评估FBF-VAST系统的重复性，阀门切换时间设置为tfwd为114秒和tbwd为96秒。评估了选定峰的峰面积和保留时间。使用六个标准品（烟酸、咖啡酸、香草酸、苯甲酸、对香豆酸和咖啡因）在0.02至100.00 mg/L的浓度范围内确定了检测限（LOD）和定量限（LOQ）。应用了选定的条件（GMP4），阀门切换时间设置为tfwd = 114秒和tbwd = 96秒。对于每个标准品，使用最强烈的调制峰来计算相应的LOD和LOQ值。反冲洗技术本研究使用了样品W8，并在LOD和LOQ分析中提到的相同条件下进行了分离过程。在样品引入1D柱后2分钟或5分钟激活阀门，以观察分离性能的差异。在分离后，通过在整个步骤中保持反向流动来应用反冲洗技术，持续时间为60分钟、40分钟或20分钟。应用苯甲酸、咖啡因、咖啡酸、（+）儿茶素、绿原酸、（?）表儿茶素、烟酸、对香豆酸和香草酸作为标准品，在tfwd = 114秒和tbwd = 96秒的条件下，使用GMP4对十个葡萄酒样本进行定性和定量分析。另一种RP柱组合，由Waters C18和Shodex RSpak DE-613（6.0 × 150 mm, 6.0 μm）组成，作为1D柱和2D柱，与使用DCM葡萄酒提取物（W6）和PW6的Waters C18和Agilent C18系统进行分离性能比较。分离在tfwd = 120秒和tbwd = 90秒（使用GMP4）以及tfwd = 110秒和tbwd = 100秒（使用GMP6）的条件下进行。理论背景每个分析物沿柱子的迁移可以通过修改后的对流-扩散方程来建模，以考虑保留效应：???(??,??)???+????(??eff(??,??)??(??,??))=???2??(??,??)???2?C(x,t)?t+??x(veff(x,t)C(x,t))=D?2C(x,t)?x2(1)其中C(x,t)是时间t时位置x处的分析物浓度，D是表观轴向扩散系数。有效迁移速度veff(x,t)通过保留因子k(x,t)来考虑，表示为??eff(??,??)=??flow1+??(??,??)veff(x,t)=vflow1+k(x,t)(2)其中vflow是整体流动相速度。对于梯度依赖的保留，使用线性-对数模型来计算k(x,t)，即log10??(??,??)=???·??(??,??)+?????(??,??)=10???·??(??,??)+??log10?k(x,t)=?a·B(x,t)+b?k(x,t)=10?a·B(x,t)+b(3)其中B(x,t)代表局部流动相组成（%B）。参数a和b是针对每个分析物经验确定的保留系数。由于k(x,t)取决于B(x,t)，因此准确建模流动相组成沿柱子的时空演变对于捕捉分析物传输动态至关重要，这由???(??,??)???+??flow???(??,??)???=?????2??(??,??)???2?B(x,t)?t+υflow?B(x,t)?x=DB?2B(x,t)?x2(4)控制。在柱入口处施加线性梯度变化，根据??inlet(??)=??init,??init+(??final???init)·?????hold??ramp,??final,??< />< />在反向流动（阀门B）期间，由于流动方向的反转，梯度分布变得空间分散并部分混合。由于这种交替的前向-反向调制随着%B程序的增加而进行，检测器信号显示出一系列阶梯状的梯度。在每个阶梯内，观察到一个轻微的负斜率（如图1C中的红色箭头所示），这归因于反向流动将较低%B的段冲回检测器。在研究的条件下，前向流动时间（tfwd）长于反向流动时间（tbwd）。因此，前向移动的%B段完全通过150毫米的出口并被检测到。然而，反向移动的段只部分移动，在接近0毫米出口的柱内留下了可以称为“半个池塘”的%B（见支持信息中的动画）。当流动方向切换回阀门A时，在0毫米入口引入一个新的较高%B段，并与之前剩余的（半个池塘）部分结合，形成一个“完整的池塘”，然后被冲向检测器。这种“半个池塘向后移动”和“一个完整的池塘向前移动”的交替模式在整个调制过程中重复出现，产生了图1C中每个调制周期观察到的特征性信号下降。这些下降发生在每个阀门A周期的末尾，随后在切换到阀门B时信号急剧增加，因为0毫米出口处的较高%B段突然被冲向检测器。我们修订后的解释澄清了第一个信号下降并不是在第一个阀门A周期发生的，而是在第二个及后续周期发生的——反映了第一个完整的%B段首次引入检测路径的时刻。
在FBF-VAST中模拟分析物调制后，使用模拟的移动相空间-时间剖面根据方程2和3计算每个位置和时间点的局部保留因子k(x, t)。结合方程1，相同的数值模拟框架被扩展用于模拟分析物调制剖面。根据给定的初始分析物分布（方程9），使用它们在方程3中的相应a和b参数，对没食子酸、咖啡因、白藜芦醇、对香豆酸和苯甲酸进行了模拟，这些参数是通过在主柱上进行的一维液相色谱（1D-LC）分析实验确定的。提取的参数分别为：没食子酸0.005和0.45，咖啡因0.019和1.32，白藜芦醇0.024和1.60，对香豆酸0.025和1.30，苯甲酸0.030和1.30。FBF-VAST过程生成的分析物剖面有效地模拟了从1D柱洗脱后的柱后调制，如图2所示的五种代表性分析物。为了清晰起见，图S3提供了白藜芦醇调制过程的逐步模拟，相应的分析物移动在视频S1中进一步说明。该图捕捉了单个分析物在连续前向-反向冲洗周期中的时间演变，显示了沿柱的空间峰形和离散时间点的相应检测器信号（图S3A-H）。它展示了分析物是如何周期性移动、保留和释放的，最终产生离散的调制信号。所有分析物的迁移行为在图S4中通过空间-时间-强度图的叠加进一步可视化，提供了它们分离轨迹的全面视图。描述分析物剖面时间演变的动画也包含在支持信息中的视频S2中。此外，在梯度条件下使用相同的固定相并不排除多维分离的正交性。在温度程序控制的GC × GC中也报告了类似的现象，其中有效正交性源于分析物在每个维度中经历的温度差异。（31）尽管使用了相同的固定相，但由于保留对温度的非线性和化合物特异性依赖性，分析物在第一个和第二个维度中遇到不同的温度窗口。类似的原则也适用于LC × LC。尽管使用了相同的固定相和流动相系统，但由于调制引入的时间偏移，分析物在每个维度中经历了不同的溶剂浓度环境（%B）。由于LC中的保留非线性依赖于溶剂组成，这导致维度之间的选择性窗口实际上不同，从而实现了正交性。此外，调制过程通过在第二维分析之前将较宽的1D峰切分为更窄的子峰来增强分离。这些效应共同证明了即使在相同的固定相和梯度条件下也能实现有效的二维分离。
在FBF-VAST操作下，梯度和分析物峰在主柱内通过多个调制周期明显地被调制和重新分布。这证实了该机制允许以时间依赖的、可控的方式动态调制溶剂组成和分析物位置。为此，调制周期（PM）可以定义为tbwd + tfwd，净注射窗口（Δtnet = tfwd – tbwd）将分析物脉冲转移到2D柱上。FBF-VAST调制机制允许分析物在1D柱上暂时保留，然后再转移到第二维度。因此，分析物在两个维度中经历的%B剖面不仅取决于它们的内在tR，还取决于阀门A（tfwd）和阀门B（tbwd）的时机。通过调整这些阀门周期的持续时间，用户可以改变分析物暴露于较高或较低%B条件的时间和方式，从而有效调节选择性。这种效应在模拟的1tR vs tfwd图中得到证明（图2I），其中tfwd的减少通常导致1tR变长，晚洗脱的峰显示出更压缩的表观1tR（彼此更接近）。重要的是，这种选择性行为与通过改变梯度斜率产生的行为不同（图2J）。较平的梯度也会使1tR整体增加，直到与晚洗脱的峰的表观1tR更加分散（彼此更远离）。这种对比行为源于FBF-VAST机制，在前向流动调制周期中，分析物在逐渐增强的（富含%B的）条件下被保留在柱上。因此，晚洗脱的化合物暴露于比在常规梯度下更高的%B值。还值得注意的是，通过tfwd调节的选择性与通过流量变化获得的选择性不同，后者只引起选择性的微小变化（图2K）。此外，分析物1tR的可调性可以在2D分离中导致不同的%B暴露剖面，因为在两个维度中应用了相同的流动相梯度程序。
为了实验验证这种选择性调节能力，配置了一个使用两个传统反相C18柱的FBF-VAST LC × LC系统来分离葡萄酒样品（W4）。第一维度使用了Waters AccQ-Tag C18柱（在1D中分辨出34个峰），而第二维度使用了Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱（在独立1D条件下分辨出29个峰）。这种设置允许直接评估FBF-VAST阀门时机如何影响二维空间中的峰分布和选择性。还应注意的是，由于担心反向流动可能导致柱子损坏、柱内颗粒分布不对称以及降低理论板数等问题，通常不推荐使用反向流动方向。然而，反向流动方向也是一种推荐的柱子清洗技术，称为“反冲洗”。这种方法通过切换阀门位置在收集目标分析物后洗脱非目标分析物来反转流动方向。（32,33）应该注意的是，尽管使用了相同的固定相，但由于分析物在每个维度中经历的温度窗口不同，导致保留行为不同，这是由于保留对温度的非线性和化合物特异性依赖性。尽管使用了相同的固定相和流动相系统，但由于调制引入的时间偏移，分析物在每个维度中经历了不同的溶剂浓度环境（%B）。由于LC中的保留非线性依赖于溶剂组成，这导致维度之间的选择性窗口实际上不同，从而实现了正交性。此外，调制过程通过在第二维分析之前将较宽的1D峰切分为更窄的子峰来增强分离。这降低了局部分析物浓度并提高了紧密洗脱化合物的分辨率。这些效应共同证明了即使在相同的固定相和梯度条件下也能实现有效的二维分离。
图2显示了在FBF-VAST调制下，仅使用1D Waters C18柱的模拟分析物峰形（上方）和相应的检测器信号（下方）。结果显示了注射后不同时间的没食子酸、咖啡因、白藜芦醇、香豆酸和苯甲酸（分别为A-H）。还通过改变FBF-VAST中的1tR来模拟选择性调节：减少tfwd（I），将梯度时间从10%增加到90% B（J），以及在第一维分离期间降低流速（K）。
在FBF-VAST操作下，梯度和分析物峰在主柱内通过多个调制周期被明显调制和重新分布。这证实了该机制允许以时间依赖的、可控的方式动态调节溶剂组成和分析物位置。为此，调制周期（PM）可以定义为tbwd + tfwd，净注射窗口（Δtnet = tfwd – tbwd）将分析物脉冲转移到2D柱上。FBF-VAST调制机制允许分析物在1D柱上暂时保留，然后再转移到第二维度。因此，分析物在两个维度中经历的%B剖面不仅取决于它们的内在tR，还取决于阀门A（tfwd）和阀门B（tbwd）的时机。通过调整这些阀门周期的持续时间，用户可以改变分析物暴露于较高或较低%B条件的时间和方式，从而有效调节选择性。这种效应在模拟的1tR vs tfwd图中得到证明（图2I），其中tfwd的减少通常导致1tR变长，晚洗脱的峰显示出更压缩的表观1tR（彼此更接近）。重要的是，这种选择性行为与通过改变梯度斜率产生的行为不同（图2J）。较平的梯度也会使1tR整体增加，直到与晚洗脱的峰的表观1tR更加分散（彼此更远离）。这种对比行为源于FBF-VAST机制，在前向流动调制周期中，分析物在逐渐增强的（富含%B的）条件下被保留在柱上。因此，晚洗脱的化合物暴露于比在常规梯度下更高的%B值。还值得注意的是，通过tfwd调节的选择性与通过流量变化获得的选择性不同，后者只引起选择性的微小变化（图2K）。此外，分析物1tR的可调性可以导致2D分离中不同的%B暴露剖面，因为在两个维度中应用了相同的流动相梯度程序。
为了实验验证这种选择性调节能力，配置了一个使用两个传统反相C18柱的FBF-VAST LC × LC系统来分离葡萄酒样品（W4）。第一维度使用了Waters AccQ-Tag C18柱（在1D中分辨出34个峰），而第二维度使用了Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱（在独立1D条件下分辨出29个峰）。这种设置允许直接评估FBF-VAST阀门时机如何影响二维空间中的峰分布和选择性。还应注意的是，通常不推荐使用反向流动方向，因为担心它们可能导致柱子损坏、柱内颗粒分布不对称以及降低理论板数等问题。然而，反向流动方向也是一种推荐的柱子清洗技术，称为“反冲洗”。这种方法通过切换阀门位置在收集目标分析物后洗脱非目标分析物来反转流动方向。（32,33）应该注意的是，尽管反冲洗流动是在受控条件下进行的，但前向和反冲洗周期之间的连续交替可能会影响固定相颗粒的组织，可能影响柱子的寿命。鉴于FBF-VAST系统在阀门位置变化时在1D柱中有前向和反向冲洗，（34）柱子连接到没有2D柱的阀门上。1D柱中的前向和反向流动可以从阀门A或阀门B开始。系统可以在仅前向流动或仅反向流动的情况下操作，由阀门位置控制，以评估反向流动与正常前向流动方向的影响。结果表明色谱图一致（图S5），正常流动方向的分离峰数为29个，反向流动方向的分离峰数为28个。结果表明，不同的柱入口对柱性能的影响可以忽略不计。这可能是由于均匀的填充过程和两端对称的柱设计，防止了高压下的异质性和颗粒损失。（35）
研究了不同梯度斜率变化的影响，阀门持续时间设置为tfwd为120秒和tbwd为90秒。这对应于PM为210秒和1D到2D脉冲转移时间为30秒。结果如图3A-E所示。2D控制图结果中的分离峰数关系（图3F）用于确定适当的梯度流动相。在FBF-VAST中，根据GMP1和GMP2条件，流动相太快而无法实现充分分离，如图3A-B所示，大多数化合物在较低的1tR下洗脱。快速梯度还降低了保留，导致2D分离质量较低。当流动相更逐渐增加时（GMP3–5），分离性能得到改善，如图3C–E所示，分离峰数增加，分辨率提高。GMP4（图3D）和GMP5（图3E）在2D空间中显示出良好的分离和分布，分离峰数分别为57个和64个。然而，GMP5需要更长的分离时间，且峰强度较低。因此，GMP4对于分离一定数量的化合物足够有效，被选为进一步研究。
图3显示了在FBF-VAST LC × LC中梯度流动相斜率变化的效果（A–E，从最快到最慢的梯度），使用tfwd为120秒和tbwd为90秒。所有2D控制图的刻度相同。分离峰数与梯度条件的对应图显示在F中。
应该注意的是，开发的FBF-VAST方法（图S6A）的分离性能与GMP3下的停止流动调制（图S6B）进行了比较。停止流动方法是使用相同的4端口阀门进行的，尽管连接方式不同，如图S1所示，阀门持续时间设置为阀门A周期为180秒和阀门B周期为30秒，以获得相同的调制周期（210秒）和1D到2D脉冲转移时间（30秒）。FBF-VAST系统获得的分离峰数略高（46个峰），而停止流动条件下获得的分离峰数为44个峰。FBF-VAST的一个关键优势是压力波动减少，如图S7所示，同时增强了选择性调节能力。此外，FBF-VAST更有效地利用了二维分离空间，与停止流动方法相比，2D轮廓图中的峰分布得到改善（图S6）。相比之下，停止流动方法显示出更高的信号强度（大约高1.2–1.7倍），表明FBF-VAST的灵敏度有所损失。这种效应可以归因于调制过程中引入的非传统%B剖面（图1D），它影响了分析物在第二维度中的聚焦。尽管存在这一限制，但可以通过减少脉冲宽度（PM）来改善带压缩效果，或者通过引入第二流动相流和/或捕获界面来实现溶剂交换，从而在第二维度上获得更传统的百分比B（%B）分布。这样的修改在概念上与主动调制策略相一致，同时保持了FBF-VAST设计的简单性和灵活性。
图4显示了在相同梯度条件GMP4下，通过改变FBF-VAST LC × LC系统中阀门位置持续时间所获得的分离调节结果。调制周期固定为210秒。不同的正向和反向阀门位置持续时间（tfwd和tbwd）显著影响了分离效率。在本节中，我们仅讨论tfwd，因为tbwd可以表示为210-tfwd。一般来说，较长的tfwd可以更早地将脉冲传递到二维柱上，从而在较低的百分比B处实现更强的二维保留。极端情况可以在图4A中看到，其中仅应用了正向流动（无调制），导致强烈的缠绕现象。另一方面，过短的tfwd会在调制期间将化合物更长时间地保留在一维柱上，导致在较高的百分比B处分离效果较弱。极端情况可以在图4G中看到，其整体峰值2tR较低，并且化合物之间的共洗现象明显。
当使用tfwd为120秒时，观察到了最佳条件，这提供了强二维保留和小脉冲传递之间的平衡（见图4D）。
在GMP4条件下应用tfwd = 120秒和tbwd = 90秒时，在等高线图中产生了最多的可分离峰（见图4D），证明了有效的分离和对二维空间的全面覆盖。然而，这种设置也表现出相当程度的缠绕现象。为了减轻这种效应，稍微减少了tfwd，以允许化合物在更强的流动相条件下（在梯度的后期）在第二个柱子上洗脱。因此，选择了tfwd = 114秒和tbwd = 96秒的条件（见图4E），该条件产生了第二多的可分离峰，且没有明显的缠绕现象。
通过将FBF-VAST LC × LC的结果与1D-LC技术进行比较，验证了其有效性。在选定的GMP4条件下（tfwd = 114秒和tbwd = 96秒），评估了包括LOD、LOQ、线性范围和重复性在内的关键分析参数。使用了六种标准品进行评估，分别是烟酸、咖啡酸、香草酸、咖啡因、对香豆酸和苯甲酸，结果总结在表1中。FBF-VAST LC × LC方法的LOD（检测限）和LOQ（定量限）低于1D-LC方法（LOD：0.05–0.13 mg/L；LOQ：0.15–0.39 mg/L）。唯一的例外是烟酸，两种方法产生的LOD和LOQ值相当。两种技术都表现出良好的线性，FBF-VAST LC × LC系统的R2 > 0.98，1D-LC方法的R2也大于0.98。
在选定的FBF-VAST LC × LC条件下（GMP4，tfwd = 114秒，tbwd = 96秒），应用tfwd = 120秒和tbwd = 90秒时，在等高线图中产生了最多的可分离峰（见图4D），证明了有效的分离和对二维空间的全面覆盖。然而，这种设置也表现出相当程度的缠绕现象。为了减轻这种效应，稍微减少了tfwd，以允许化合物在更强的流动相条件下（在梯度的后期）在第二个柱子上洗脱。因此，选择了tfwd = 114秒和tbwd = 96秒的条件（见图4E），该条件产生了第二多的可分离峰，且没有明显的缠绕现象。
在这项研究中，采用了一种反冲洗策略来通过消除分离期后的基质成分来减少总体分析时间。在分离期结束后，通过切换阀门来改变流动方向，从而开始反冲洗操作。检查了不同的阀门激活时间以优化反冲洗操作并提高整体分离性能。如图5C中的W8 2D图所示，与2分钟激活（图5A）相比，5分钟的阀门激活提高了分辨率。基于这一观察结果，我们假设一旦目标分析物在60分钟、40分钟或20分钟内完全分离，就可以随后进行反冲洗操作。如图5B、D和E所示，反冲洗步骤在切换到反向流动后会产生一个大的峰，表明留在柱入口处的化合物被有效去除，而不会被保留在柱内。与不进行反冲洗的分析相比，这种方法产生了明显更干净的基线。在选定的流动相条件下，反冲洗步骤将总分析时间减少了40分钟以上（从190分钟减少到150分钟），同时保持了干净可靠的色谱图。
所选的FBF-VAST LC × LC条件（GMP4，tfwd = 114秒，tbwd = 96秒）被应用于10个混合标准品的定性和定量分析，这些标准品来自10个DCM葡萄酒提取物样本。标准品分为三组：酚酸（苯甲酸、咖啡酸、绿原酸、对香豆酸和香草酸）、黄酮类（（+）儿茶素和（?）表儿茶素）以及其他成分，包括咖啡因、烟酸和白藜芦醇。通过比较210纳米处的保留时间和UV光谱（在DAD扫描模式下）与标准品的保留时间和光谱，识别了LC × LC结果中的峰。对于定量分析，为目标化合物在0.02–100 mg/L的浓度范围内构建了校准曲线，并给出了每个标准的相应线性方程。
分析了三种类型的葡萄酒：7种红葡萄酒（西拉）、1种白葡萄酒（雷司令）和2种果酒（荔枝或山竹）。分离出的目标分析物数量似乎受到水果类型的影响很大，红葡萄酒（西拉）通常显示出最多的化合物数量，其次是荔枝和山竹制成的果酒以及白葡萄酒（雷司令）。如表S4所示，对香豆酸是最广泛检测到的化合物，在所有样本中都有发现，除了果酒W10。在红葡萄酒中，对香豆酸的含量最高（0.017–0.066 mg/g），其次是白葡萄酒W8（0.015 mg/g）和果酒W9（0.008 mg/g）。咖啡酸在泰国红葡萄酒（W3–W6）中被检测到，浓度范围为0.002–0.008 mg/g，但在W7以及澳大利亚（W1）和法国（W2）的红葡萄酒中未检测到。在白葡萄酒W8中观察到较高的含量（0.022 mg/g），而在果酒W9中观察到中等含量（0.004 mg/g）。绿原酸主要在红葡萄酒中被检测到，浓度为0.013 mg/g（W4）和0.016 mg/g（W5），而香草酸的含量较低，范围为0.001–0.003 mg/g（W3–W4和W6–W7）。苯甲酸仅在果酒W10中被检测到，浓度为0.016 mg/g。
在FBF-VAST色谱图中获得了五个峰的六次重复结果，以评估所开发方法的精度。使用DAD检测器的光谱扫描模式确认了峰的身份，示例见图S8和表S3。FBF-VAST分析方法表现出可接受的重复性，峰面积的精度在5.28–11.77% RSD范围内。
在这项研究中，采用了一种反冲洗策略来通过消除分离期后的基质成分来减少总体分析时间。在分离期结束后，通过切换阀门来改变流动方向，从而开始反冲洗操作。检查了不同的阀门激活时间以优化反冲洗操作并提高整体分离性能。如图5C中的W8 2D图所示，5分钟的阀门激活提高了分辨率。基于这一观察结果，我们假设一旦目标分析物在60分钟、40分钟或20分钟内完全分离，就可以随后进行反冲洗操作。如图5B、D和E所示，反冲洗步骤在切换到反向流动后会产生一个大的峰，表明留在柱入口处的化合物被有效去除，而不会被保留在柱内。与不进行反冲洗的分析相比，这种方法产生了明显更干净的基线。在选定的流动相条件下，反冲洗步骤将总分析时间减少了40分钟以上（从190分钟减少到150分钟），同时保持了干净可靠的色谱图。
所选的FBF-VAST LC × LC条件（GMP4，tfwd = 114秒，tbwd = 96秒）被应用于10个DCM葡萄酒提取物样本中10个混合标准品的定性和定量分析。标准品分为三组：酚酸（苯甲酸、咖啡酸、绿原酸、对香豆酸和香草酸）、黄酮类（（+）儿茶素和（?）表儿茶素）以及其他成分，包括咖啡因、烟酸和白藜芦醇。通过比较210纳米处的保留时间和UV光谱（在DAD的扫描模式下）与标准品的保留时间和光谱，识别了LC × LC结果中的峰。对于定量分析，为目标化合物在0.02–100 mg/L的浓度范围内构建了校准曲线，并给出了每个标准的相应线性方程。
使用优化的方法分析了三种类型的葡萄酒：7种红葡萄酒（西拉）、1种白葡萄酒（雷司令）和2种果酒（荔枝或山竹）。分离出的目标分析物数量似乎受到水果类型的影响很大，红葡萄酒（西拉）通常显示出最多的化合物数量，其次是荔枝和山竹制成的果酒以及白葡萄酒（雷司令）。如表S4所示，对香豆酸是最广泛检测到的化合物，在所有样本中都有发现，除了果酒W10。在红葡萄酒中，对香豆酸的含量最高（0.017–0.066 mg/g），其次是白葡萄酒W8（0.015 mg/g）和果酒W9（0.008 mg/g）。咖啡酸在泰国红葡萄酒（W3–W6）中被检测到，浓度范围为0.002–0.008 mg/g，但在W7和澳大利亚（W1）及法国（W2）的红葡萄酒中未检测到。在白葡萄酒W8中观察到较高的含量（0.022 mg/g），而在果酒W9中观察到中等含量（0.004 mg/g）。绿原酸主要在红葡萄酒中被检测到，浓度为0.013 mg/g（W4）和0.016 mg/g（W5），而香草酸的含量较低，范围为0.001–0.003 mg/g（W3–W4和W6–W7）。苯甲酸仅在果酒W10中被检测到，浓度为0.016 mg/g。
黄酮类（+）儿茶素和（?）表儿茶素主要在红葡萄酒中被检测到，（+）儿茶素在W2–W4和W6中的含量相对较高（0.002–0.044 mg/g），在果酒W9中为0.011 mg/g。在白葡萄酒和果酒W10中未检测到。相比之下，（?）表儿茶素在白葡萄酒和两种果酒中的含量分别为0.002 mg/g和0.004–0.005 mg/g，在红葡萄酒W4–W7中的含量为0.002–0.006 mg/g。在其他化合物中，烟酸和白藜芦醇主要在红葡萄酒中被检测到，在白葡萄酒中未检测到。烟酸存在于所有红葡萄酒中（0.004–0.013 mg/g）和果酒中（0.008–0.011 mg/g）。白藜芦醇的分布与烟酸相似，除了在果酒W10中未检测到。其浓度在红葡萄酒中为0.009–0.039 mg/g，在果酒W9中为0.010 mg/g。咖啡因在分析样本中未检测到。
除了上述相同的固定相组合（1D Waters C18 × 2D Agilent C18）外，还使用了一种不同的RP柱（1D Waters C18 × 2D RSpak DE-613）的FBF-VAST LC × LC系统来比较DCM葡萄酒提取物（W6）的分离性能。图6A显示了使用1D Waters C18 × 2D Agilent C18系统（GMP4，tfwd = 120秒，tbwd = 90秒）获得的等高线图。分离显示了良好的峰分布和2D分离空间的有效利用。即使固定相化学性质相似且柱尺寸相当，开发的FBF-VAST方法也提供了足够的选择性调节能力，允许在调制窗口内分离大多数分析物，而没有显著的缠绕现象。相比之下，1D Waters C18 × 2D RSpak DE-613系统（图6B）也显示出良好的分离覆盖范围，但显示出明显的缠绕行为。这种效应可以归因于使用不同固定相结合FBF-VAST机制时，一维和二维分离的选择性存在显著差异。
使用预浓缩的W6（PW6）进一步评估了样品复杂性的影响，W6含有更广泛的化合物。如图6C–F所示，与DCM葡萄酒提取物（图6A和B）相比，色谱图变得更加拥挤。对于1D Waters C18 × 2D Agilent C18系统（图6C和E），峰在2D分离空间中的分布相对较好。虽然图6C是在与W6相同的调制条件下获得的（tfwd = 120秒，tbwd = 90秒），但在图6E中调整了调制时间（tfwd = 110秒，tbwd = 100秒）以改善组分转移并减少潜在的峰重叠。相比之下，1D Waters C18 × 2D RSpak DE-613系统（图6D和F）显示出更明显的峰聚集，特别是在早期的一维组分中，以及在后洗脱的一维组分中增加了缠绕现象。
除了其分析应用外，还对比了所提出的FBF-VAST配置的操作性能和可持续性与其他LC × LC调制策略（表S5）。FBF-VAST系统只需要一个泵和一个四端口阀门，代表了最简单的梯度兼容设计，能够实现正向-反向切换和选择性调节，同时保持反冲洗功能。与被动调制相比，FBF-VAST产生的转移脉冲更窄，并通过正向-反向循环期间的溶剂辅助积累改善了分析物的聚焦（0.5–3.0倍富集）。尽管其聚焦效率低于主动或低温/热调制器，但FBF-VAST显著降低了硬件成本、溶剂和能源使用以及维护需求。值得注意的是，单泵FBF-VAST和被动调制器消耗的总流动相体积相同，为0.5 mL min–1（约每3小时运行90 mL），但它们的有效溶剂利用率有显著差异。在FBF-VAST中，优化的流动反转和最小的冲洗需求将废弃溶剂量减少到约8–23 mL/次运行，而传统被动设置的废弃溶剂量约为30–70 mL。这种效率提升源于精确的脉冲控制，无需额外的泵头或长时间的平衡周期。因此，FBF-VAST 的平均功率（约 20 瓦）也低于典型的被动系统（约 25-30 瓦），后者通常需要辅助驱动或更高的泵头工作压力。相比之下，主动式双泵系统和低温/热调制器虽然能够实现强烈的分析物聚焦（富集倍数 5-100 倍），但由于持续的再平衡和制冷过程，其溶剂消耗量（分别为 150-300 毫升/小时和超过 300 毫升/小时）以及功率需求（超过 200 瓦）要高得多。低温/热设计还需要独立的冷却回路，并且不能仅使用一个泵来运行。总体而言，FBF-VAST 系统获得了最高的可持续性评分（绿色化学得分 = 9-10/12）和最低的生命周期影响，实现了色谱性能、简单性和环境责任之间的平衡。这使得它成为一种实用、可改造且成本效益高的 LC × LC 解决方案，适用于复杂的代谢组学和成分分析，例如葡萄酒分析。
**结论**
FBF-VAST（正向-反向冲洗阀辅助选择性调节）机制为 LC × LC 提出了一种简化且高度可调的调制策略。通过在一个单泵、单阀系统中交替流动方向，它能够在一次连续操作中实现分析物的保留、释放和梯度兼容性。通过调整正向/反向冲洗时间，可以精确控制选择性，从而无需额外的泵或复杂的管道系统。该方法的关键创新在于其内置的反冲洗功能，允许在线进行一维柱子的再生和残留物的去除，而不会中断分析过程——这增强了系统的稳健性并延长了柱子的使用寿命。同样重要的是，集成的机械模拟可视化了溶剂和分析物在每个调制周期中的传播情况，揭示了正向和反向流动如何影响选择性，并为实验设计提供了理论依据和预测能力。使用葡萄酒样本进行的实验结果证实了模型预测的趋势，展示了高重复性和有效的二维覆盖范围。凭借其最小的溶剂使用量、低能耗和自清洁功能，FBF-VAST 为下一代多维液相色谱提供了一个可持续、灵活且基于机械原理的平台。
