文丘里易环境电离质谱与气相色谱联用技术用于高效高通量定量分析药品中的乙酸残留

《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》：Venturi Easy Ambient Ionization Mass Spectrometry Coupled to Gas Chromatography for High-Throughput Quantitation of Acetic Acid Residues in Pharmaceuticals

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气相色谱与质谱联用（GC-MS）是一种用于分析挥发性有机化合物（VOCs）的强大且成熟的技术。通常，电子电离被用来结合这些技术；然而，它需要高真空条件，并会产生大量的碎片。Venturi easy ambient sonic spray ionization（V-EASI）质谱是一种适用于溶液相和气相样品的环境电离方法，利用高压作为软电离机制。在这项工作中，我们展示了通过 V-EASI 将 GC 与 MS 耦合的原理验证，应用于药品中残留溶剂乙酸的定量分析，以满足质量控制的需求。该系统已实现自动化和优化，每个样品的运行时间约为 70 秒。所开发的方法符合国际协调委员会（ICH）制定的验证指南。由于其快速性、简单性和广泛的应用性，GC-V-EASI-MS 成为实时、高通量 VOC 分析的强大替代方案。

引言

高通量质谱（HTMS）是环境电离的一个有前景的应用，它能够快速分析多个样品，主要用于药物发现和生物测定。(1) 然而，这种方法对于需要常规分析挥发性有机化合物（VOCs）的制药、食品和饮料行业也非常有价值。主要的环境电离替代方法包括：(2) 实时直接分析，(3) 脱附大气压化学电离，(4) 低温等离子体，(5) 以及介电屏障放电。(6) 相比之下，Venturi easy ambient sonic spray ionization（V-EASI）是一种环境电离技术，它结合了 Venturi 效应和 sonic spray 电离，可以在无需电场、激光、电晕放电或其他能量源的情况下直接分析溶液相、气相和表面样品。(6) V-EASI-MS 已成功应用于多个领域，包括天然产物、(7) 燃料、(8,9) 脂质、(10) 以及其他复杂基质。(6) 最近，我们展示了它与液相色谱的集成，用于测定胭脂树种子中的 bixin，(11) 并在HTMS策略中与在线固相萃取结合，用于测定膳食补充剂中的咖啡因，分析时间仅为每个样品 2 分钟。(12) 在这项工作中，我们将基于 V-EASI 的接口作为 HTMS 策略与气相色谱（GC）结合，用于定量药品中的乙酸。乙酸是一种在各个工业领域广泛使用的化学试剂，在制药行业中，它被大量用作溶剂，因此可能作为反应残留物存在。(13,14) 由于其低毒性潜力，美国食品药品监督管理局（FDA）将其归类为第 3 类溶剂，而国际协调委员会关于残留溶剂的指南（ICH Q3C (R4)）规定其可接受水平不得超过 5000 ppm。(15) 当超过这一限制时，需要对该残留物进行鉴定和定量。乙酸定量的其他常见应用包括生物质转化(16) 和发酵食品的分析。(17) 在此背景下，GC-V-EASI-MS 被引入用于复杂基质中乙酸的快速分析，所需样品制备最少，同时提供与传统技术相当或更优的分析性能。

实验部分

化学品
乙腈，HPLC 级（Tedia，美国）；乙酸，纯度 ≥ 99%（Sigma-Aldrich，美国）；超纯水（Milli-Q 系统，Millipore，美国）；氢氧化铵，29%（m/m）（Merck，美国）；以及具有 100% 聚乙二醇固定相的毛细管柱（DB-WAX）（Agilent，美国）。

仪器
组装的 GC-V>EASI-MS 系统由一个三同心管接口组成（图 1 和图 S1），使用直径为 0.35 mm 的不锈钢毛细管同心固定在直径为 0.50 mm 的针头和直径为 0.25 mm 的聚酰胺涂层熔融石英毛细管之间。为了将气相色谱仪连接到离子源，使用了一段长度为 1.5 m、内径为 0.25 mm、膜厚度为 0.25 μm 的毛细管。中间管线连接到由水/乙腈（1:1, v/v）组成的修饰溶液，其中含有 0.1%（m/v）的氢氧化铵。这种组合有效地去除了乙酸的质子，从而提高了其电离效率。该系统使用 C/C++ 编程的 Arduino 微控制器进行自动化控制，并配备两个六通气动阀门，连接件为不锈钢和 PEEK。

图 1
图 1. 用于乙酸分析的气相色谱与 Venturi easy ambient sonic spray ionization 质谱（GC-V-EASI-MS）的示意图。ACN：乙腈，SIM：选择的离子监测。

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所使用的气相色谱仪是 GC-17A（Shimadzu，日本），与单四极杆质谱仪（LCMS-2010 EV，Shimadzu，日本）相连。分离使用 DB-WAX 柱（2 m × 0.25 mm 内径，0.25 μm 膜厚度），载气为氦气，流速为 1 mL min–1。 oven 温度在 100 °C 下保持恒定 1 分钟。质谱仪以负离子模式运行，雾化气体流速为 5 L min–1，分析器和 block 温度设置为 250 °C，检测器电压为 1.40 kV。检测在 m/z 59 处进行选择离子监测（SIM），对应于去质子的乙酸。为了评估该方法与官方方法的准确性，使用了传统的 GC-MS 系统（5975C，Agilent，美国）。

方法
采用 ICH 关于分析方法验证的指南（Q2）(15)。对于乙酸的测定，采用了外部校准方法。为了评估精度，计算了相对标准偏差（RSD），而准确性则通过回收率（%）进行评估，该回收率是根据官方方法（传统 GC-MS）确定的。使用不同已知浓度的利伐沙班（一种用于预防中风的药品）样品，以及纤维素、糊精、乳糖、硬脂酸镁、月桂基硫酸钠、氧化铁、聚乙二醇和二氧化钛的混合物作为赋形剂基质。为了测定利伐沙班中作为残留溶剂的乙酸，使用了浓度范围为 10–100 μg/mL 的溶液，这些溶液在 Milli-Q 水中制备。修饰溶液（0.1%（m/v）的氢氧化铵是在水/乙腈（1:1, v/v）混合物中制备的。

在官方用于评估准确性的 GC-MS 方法中，温度程序从 100 °C 开始，并保持 1 分钟，然后以 50 °C/min 的加热速率升高到 250 °C，并保持 3 分钟，总运行时间为 5 分钟。进样器温度设置为 280 °C，传输线保持在 280 °C，离子源在 280 °C 下运行，分析器设置为 150 °C。分离使用由 5% 二苯基聚硅氧烷和 95% 二甲基聚硅氧烷组成的毛细管柱，柱长 30 m，内径 0.25 mm，膜厚度 0.25 μm，以恒定流速 1.0 mL min–1 和 1.0 μL 的进样体积进行。

结果与讨论
在使用 GC-V-EASI-MS 系统（图 1）测定乙酸的过程中，分析物在气相色谱分离后但在到达质谱仪之前被去质子。从气相色谱仪中洗脱出来后，乙酸在 V-EASI 接口与氢氧化铵发生反应，如图 1 所示。去质子发生在同心管接口内，其中包含 0.1%（m/v）氢氧化铵的水/乙腈（1:1, v/v）修饰溶液与分析物（气相中的乙酸）发生反应，改变了酸-碱平衡，使得质谱能够进行定量检测。样品进样由自动化系统完成。图 2 显示了 55 分钟内的 49 次进样序列，平均每 70 秒进行一次分析。前 35 分钟的进样对应于不同浓度的标准品。在 38 至 55 分钟的时间窗口内，展示了用于回收测试的强化样品。没有观察到峰宽化或饱和现象，即使在低分辨率质谱下也没有证据表明共洗脱。

图 2
图 2. 展示了标准品和样品的连续和顺序进样的色谱图，信号对应于 m/z 59（乙酸根离子）。

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为了确定乙酸作为残留溶剂的定量范围，使用五个校准水平进行了线性评估，每个水平重复三次，总共进行了 15 次测量。对于利伐沙班中乙酸的测定，不需要内部校准，而是采用了外部校准方法。这一选择是由于 GC 耦合的使用，它最小化了基质效应并通过有效的样品分离减少了电离竞争。利伐沙班中乙酸的工作范围确定为 10 至 100 μg/mL，乙酸定量得到的相关系数（R）为 0.994。残差图也在图 S2 中展示；观察到残差分布均匀。应用了 Cochran 检验，得到了一个均方差校准曲线，在整个工作范围内只观察到随机变异。这些结果符合 ICH Q2 指南规定的验证标准。(15)

精度评估了所开发方法工作范围内的测量分散情况。通过计算同一天内（日内精度）和不同天内（日间精度）在三个浓度水平（低、中、高）进行的连续测量的相对标准偏差（RSD）来进行评估。结果在表 S1 中呈现。日内 RSD 值范围为 0.90% 至 7.00%，日间 RSD 值范围为 1.40% 至 5.60%。这些结果符合 ICH Q2 验证指南和 Horwitz 曲线，后者允许乙酸在工作范围内的 RSD 值高达 12.6%。(15) 准确性通过回收率来表示，即官方方法所得值与所提出方法所得值之间的一致性。利伐沙班中乙酸的定量结果在表 S2 中呈现。使用 GC-V-EASI-MS 测定乙酸的回收率范围为 90.7% 至 108.0%，符合 ICH Q2 验证指南。(15)

使用 GC-V-EASI-MS 方法，分析时间缩短至每个样品仅 70 秒，据我们所知，这是迄今为止报道的最快的乙酸定量方法。对于利伐沙班中作为残留溶剂的乙酸，先前报道的方法通常需要约 20 分钟的运行时间。(18) 分析时间的优化并未影响方法性能，因为精度和准确性均符合既定的验证标准。具体来说，使用 GC-V-EASI-MS 定量利伐沙班中作为残留溶剂的乙酸，得到的精度值范围为 0.9% 至 6.5%，回收率为 101.2% ± 4.3%，而文献报道的精度为 0.11% (18) 和回收率为 101.0% ± 0.7%。(17) 因此，尽管分析时间大幅减少，但各项指标仍然保持并与传统方法相当。然而，目前 GC-V-EASI-MS 仅限于有机酸分析物，因为它依赖于色谱分离后的微滴相中的在线去质子步骤，需要进一步的发展来扩展系统的适用范围。另一个限制是在 SIM 模式下使用了低分辨率，因为采用了单四极杆仪器，而不是高分辨率或基于选择性反应监测（SRM）的方法。这降低了方法的选择性和特异性，限制了其在其他基质上的适用性，并且由于可能存在共洗脱，需要对每个样品进行单独评估。

结论
成功展示了使用 V-EASI-MS 与气相色谱联用来电离高极性挥发性化合物的概念。通过 GC-V-EASI-MS 定量乙酸得到的结果符合 ICH Q2 验证指南的要求。本研究中开发的自动化接口将分析运行时间优化至每个样品约 1 分钟，这是迄今为止报道的最短分析时间，同时保持了具有竞争力的分析性能。这种方法扩展了对高极性挥发性化合物的电离覆盖范围，这些化合物涉及多个科学领域，包括制药、食品和饮料、环境监测、健康、微生物学和可再生能源。总体而言，这项研究通过提供一种在常压下实时分析极性 VOCs 的柔和、直接和高通量策略，解决了质谱学中的一个关键挑战，从而扩展了环境电离技术在气相分离中的适用性。这对于复杂矩阵的分析尤其有利，因为它解决咗质谱分析中的一个主要挑战——基质效应。