《Journal of Materials Chemistry B》：Stem cell-derived nanovesicles delivered by responsive hydrogels for refractory wound therapy
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难愈性创面的动态微环境包含一个复杂的病理系统，其特点是相互关联的因素，如持续性感染、慢性炎症和组织修复受损。这些病理因素显著阻碍愈合过程并对患者生活质量产生负面影响。干细胞来源纳米囊泡（SC-NVs）提供多种修复功能，包括抗菌活性、免疫调节、血管生成、增强细胞
难愈性创面的动态微环境包含一个复杂的病理系统，其特点是相互关联的因素，如持续性感染、慢性炎症和组织修复受损。这些病理因素显著阻碍愈合过程并对患者生活质量产生负面影响。干细胞来源纳米囊泡（SC-NVs）提供多种修复功能，包括抗菌活性、免疫调节、血管生成、增强细胞增殖和迁移以及无瘢痕愈合，从而展现出巨大的组织再生潜力。然而，纳米囊泡的局部给药受到组织滞留性差和清除速度快限制，这制约了治疗效果并需要重复给药。水凝胶凭借其优异的生物相容性、高含水量和可调节的理化性质，代表了有前景的药物递送载体。本综述系统地探讨了难愈性创面的微环境特征以及SC-NVs对抗这些特征以促进愈合的治疗机制。值得注意的是，纳米囊泡可被智能水凝胶系统负载，以响应创面微环境信号，并通过动态键断裂或结构转变实现按需释放，从而增强治疗精准性。最后，研究人员讨论了这些集成平台在临床转化中的关键挑战，并概述了其在难愈性创面精准诊断和治疗中的未来应用。
论文主体内容总结
1. 引言
难愈性创面，如糖尿病溃疡、压疮和感染性烧伤，是全球重大的公共卫生问题。其预后受多种因素影响，包括病因、深度、面积和感染程度。创面内大量坏死组织、富含蛋白的渗出液以及受损的局部血液供应为细菌定植和生物膜形成提供了有利条件。持续性感染驱动过度的炎症反应，不仅抑制创面愈合，还可能导致危及生命的并发症，如败血症和多器官衰竭，从而增加发病率和死亡率。伤口愈合是一个高度协调的生物学过程，依赖于多种细胞类型（如成纤维细胞、角质形成细胞和免疫细胞）和生物活性因子（如生长因子和细胞因子）的复杂协同作用。该过程的失调可导致愈合延迟和病理性瘢痕形成，严重影响患者功能恢复和生活质量。干细胞疗法是近年再生医学进展下的可行选择。其中，干细胞来源纳米囊泡（SC-NVs）因其从前体细胞继承的多种修复功能、低免疫原性、可忽略的致瘤风险以及便于储存运输等优势而受到极大关注。然而，游离纳米囊泡在难愈性创面治疗中存在局限性，包括组织滞留率低和代谢清除率高。水凝胶敷料作为组织修复支架，因其高含水量、良好的物理性质和优异的生物降解性，在难愈性创面管理中引起了广泛兴趣。
2. 难愈性创面的病理微环境
伤口愈合是一个动态的病理过程，通常经历三个重叠阶段：炎症期、增殖期和重塑期。在炎症期，创面区域发生凝固性坏死和细胞死亡，并激活免疫反应，导致促炎细胞因子释放。在增殖期，成纤维细胞广泛生长并在转化生长因子-β（TGF-β）等因子影响下合成胶原，同时内皮细胞在血管内皮生长因子（VEGF）等信号指导下形成新血管，构建肉芽组织。在重塑期，通过创面基质内胶原重塑和降解的动态平衡实现组织功能恢复。然而，在愈合过程中若未能有效控制感染，病原体会过度激活炎症反应，增加血管通透性，阻碍新形成的血管网络输送氧气和营养，导致组织持续缺氧。缺氧和持续性炎症信号驱动成纤维细胞向肌成纤维细胞的失调转化，导致胶原沉积和排列紊乱，最终形成病理性瘢痕组织。因此，深入了解难愈性创面愈合过程的影响机制对制定靶向治疗策略至关重要。
2.1. 感染
皮肤受损后，其屏障功能受损，导致坏死组织积聚、富含蛋白的渗出液滞留和毛细血管通透性增加，共同创造了利于病原体定植和增殖的微环境。最常见的创面感染病原体包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、念珠菌属和曲霉菌属。它们定植于创面，破坏正常愈合过程，并进一步抑制免疫反应。长期病原体定植促进生物膜形成，阻止角质形成细胞和成纤维细胞迁移，严重延迟创面闭合和上皮化。目前临床对创面感染的管理严重依赖局部或全身性抗生素和抗真菌剂，但生物膜的结构复杂性和微环境的屏障功能阻止了传统药物有效渗透和根除病原体。因此，纳米囊泡和水凝胶作为靶向药物递送载体具有相当大的潜力。
2.2. 炎症
在难愈性创面中，损伤相关分子模式（DAMPs）和病原体相关分子模式（PAMPs）局部积聚，通过模式识别受体激活先天免疫反应，触发适应性免疫反应，诱导大量炎症细胞因子和趋化因子释放，并招募免疫细胞至创面，引起炎症反应。适度的炎症有助于清除坏死组织和病原体，并为后续血管生成和肉芽组织形成奠定基础。然而，由DAMPs/PAMPs驱动的TLR4/MyD88/核因子κB（NF-κB）信号轴的持续激活可导致炎症介质在创面微环境中过度积累。这种不受控制的炎症反应不仅阻碍上皮化并加剧组织损伤，还可能引发全身性炎症反应，其特征是毛细血管渗漏和大量活性氧（ROS）释放，显著增加继发感染、多器官功能障碍和瘢痕形成的风险。因此，重塑创面的炎症微环境对于克服难愈性创面的治疗挑战至关重要。
2.3. 血管损伤
血管生成受损、组织缺氧、神经损伤和细胞外基质形成异常是阻碍创面愈合的关键因素。伤口损伤后，受损的血管系统立即阻止氧气输送至创床，并减少促血管生成因子，从而加剧缺氧和氧化应激。在短期缺氧期间，缺氧诱导因子-α（HIF-α）的表达增加，从而上调血管内皮生长因子（VEGF）表达。VEGF激活内皮一氧化氮合酶（eNOS）以促进一氧化氮（NO）合成，从而增强内皮细胞迁移和增殖。同时，缺氧微环境直接刺激角质形成细胞，增加其VEGF表达，并驱动内皮细胞毛细血管腔形成。然而，难愈性创面的血管生成常常失调。例如，在糖尿病中，高血糖和脂肪酸水平抑制HIF-1α的稳定性和功能，导致HIF信号激活不足和对缺氧的适应性反应受损。在静脉溃疡中，过度的促炎细胞因子诱导过度且紊乱的血管生成，形成渗漏、迂曲且无功能的血管。通过适时、适当地调节相关信号通路以恢复血管生成稳态，可以优化创面微环境以促进愈合并减少纤维化等不良后果。
2.4. 瘢痕
伤口愈合是一个高度动态的过程，涉及一系列复杂的细胞和生化事件，包括急性炎症反应、细胞增殖，最终形成以新生血管形成和未成熟胶原沉积为特征的纤维性瘢痕组织。在难愈性创面愈合过程中，多种因素的干扰常常阻止真皮组织完全再生为正常的皮肤结构。病理性瘢痕，如增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，通常表现出新生毛细血管数量增加。这些血管结构不成熟且通透性高，导致血浆成分持续渗漏到细胞外基质（ECM）中。外渗的纤维蛋白原作为早期信号分子，直接激活TGF-β/Sma和MAD相关蛋白（SMAD）信号通路，从而促进成纤维细胞活化和异常胶原沉积。此外，内皮细胞可经历内皮-间质转化（EndoMT）转变为肌成纤维细胞，直接加剧纤维化过程并促进瘢痕形成。目前的瘢痕干预方法，如硅酮凝胶、激光疗法和压迫疗法，通常因疗效不一致、成本高和治疗周期长而受限。
3. 干细胞来源纳米囊泡在难愈性创面愈合中的作用
干细胞来源纳米囊泡是由磷脂双分子层组成的囊泡结构，直径在30至1000纳米之间，具有低免疫原性和良好的靶向能力。根据来源，纳米囊泡可分为多种类型，其中源自胚胎干细胞（ESCs）、体细胞干细胞（SSCs）、诱导多能干细胞（iPSCs）和间充质干细胞（MSCs）的纳米囊泡因其从细胞源继承的优异促愈合能力而受到极大关注。它们不仅可以携带天然生物活性分子，如蛋白质、脂质和核酸，还可以通过工程化负载外源物质。一旦其内容物被递送到受体细胞，纳米囊泡可以调节多种生物过程，包括细胞增殖、分化、迁移和免疫调节。
3.1. 干细胞来源纳米囊泡的抗感染活性
由于局部屏障功能丧失和免疫微环境破坏，难愈性创面极易受到细菌感染。抗菌药物如光敏剂、抗菌肽和抗生素对病原体感染（包括金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和冠状病毒）已证明具有显著疗效，但它们通常无法在创面达到并维持有效的治疗浓度。纳米囊泡凭借其固有的磷脂双分子层结构成为药物递送的优势载体。目前使用干细胞来源囊泡进行药物递送的策略主要包括两种方法：表面修饰和内部负载。表面化学修饰是将适配体、抗体或肽等配体通过连接反应或脂质组装锚定在囊泡表面，实现精确的组织或细胞特异性靶向。内部负载利用囊泡内腔和膜稳定性，通过直接孵育、超声处理、机械挤出或电穿孔封装治疗剂。例如，研究人员开发了功能化纳米囊泡和复合纳米平台，在感染创面模型中展示了消除细菌、降低活性氧水平、促进M2巨噬细胞极化和加速再上皮化的功效。
3.2. 干细胞来源纳米囊泡的炎症调节功能
伤口愈合过程中的炎症通常发生在损伤后的头三天。适度的炎症通过清除微生物和降解受损组织来加速愈合过程。然而，失调的炎症是难愈性创面的一个标志，会显著延迟愈合过程，促进瘢痕形成，并可能导致功能障碍。在伤口愈合的初始阶段，M1巨噬细胞通过分泌促炎细胞因子和趋化因子来招募和激活免疫细胞，促进病原体和坏死碎片的清除。随后，巨噬细胞表型从促炎M1型转变为修复性M2型。M2巨噬细胞通过分泌抗炎因子参与血管生成和组织重塑。因此，维持M1和M2巨噬细胞之间的动态平衡对于最佳伤口愈合至关重要。M1向M2转化的受损会导致难愈性炎症状态。间充质干细胞来源的细胞外囊泡（MSC-EVs）可以通过递送微小核糖核酸和必需蛋白质来调节巨噬细胞极化，促进M2巨噬细胞极化，抑制促炎细胞因子分泌并促进组织修复。此外，干细胞来源纳米囊泡还可以通过减弱氧化应激来减轻炎症和组织损伤，例如通过激活核因子E2相关因子2（NRF2）通路或递送靶向Src的miR-146a来实现。
3.3. 干细胞来源纳米囊泡的血管生成功能
皮肤具有高度血管化的结构。然而，难愈性创面常表现出显著的微血管功能障碍，其特征是内皮功能降低、毛细血管通透性增加和局部灌注不足，导致创面微环境内严重的氧气和营养剥夺。因此，促进新生血管形成已成为优化创面修复的治疗策略。该过程包括两种主要机制：血管生成和血管发生。内皮细胞是血管发生的主要介质，通过增殖、迁移和成管作用逐步构建功能性微血管网络。蛋白质组学分析显示，间充质基质细胞来源的外泌体含有血管内皮生长因子、转化生长因子-β1、白细胞介素-8和BHLH转录因子1等对其促血管生成活性至关重要的因子。例如，人脐带间充质干细胞来源的外泌体可递送Wnt4，激活β-连环蛋白信号通路，从而增强内皮细胞增殖、迁移和成管作用。优化干细胞培养策略（如三维培养）可以增强纳米囊泡的促血管生成能力。除了间充质干细胞来源的外泌体，胚胎干细胞和诱导多能干细胞来源的外泌体也显示出血管生成潜力。在难愈性创面中，神经血管网络损伤是导致持续愈合失败的主要病理机制之一。功能化纳米囊泡在增强神经血管再生方面显示出功效。
3.4. 干细胞来源纳米囊泡的促增殖和迁移特性
难愈性创面的修复需要成纤维细胞、血管内皮细胞和表皮细胞等多种细胞类型的协调增殖、迁移和功能同步。干细胞来源纳米囊泡作为生物活性分子的天然载体，可以通过递送功能性蛋白质和核酸来协调修复过程。例如，它们含有高浓度的血小板衍生生长因子、表皮生长因子和成纤维生长因子，可驱动成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，增强收缩力和基质分泌，同时促进表皮细胞迁移和增殖，从而加速再上皮化。除了直接使用天然纳米囊泡，预处理干细胞以增强囊泡功能是一种补充治疗策略。例如，用硅酸钙刺激脂肪来源干细胞可增强其分泌的外泌体的功能。在糖尿病创面的病理微环境中，持续的高血糖应激促进衰老修复细胞的积累。利用工程化的细胞外囊泡可以减轻衰老细胞负荷，促进细胞增殖和迁移。研究人员还致力于整合抗菌效应与促增殖机制，通过同时抑制细菌感染和刺激细胞增殖来增强整体创面愈合功效。
3.5. 干细胞来源纳米囊泡减少瘢痕形成
难愈性创面愈合常常以病理性瘢痕形成为结局，其特征是异常的肉芽组织转化和由TGF-β/SMAD2信号通路介导的过度胶原沉积。研究表明，脂肪来源干细胞外泌体可通过调节III型与I型胶原的比例、TGF-β3与TGF-β1的比例以及基质金属蛋白酶-3与金属蛋白酶组织抑制剂-1的比例，并调节成纤维细胞分化来减轻瘢痕形成。间充质干细胞来源的纳米囊泡富含微小核糖核酸，可以通过抑制与TGF-β/SMAD2信号通路相关的过度α-平滑肌肌动蛋白和胶原沉积来抑制肌成纤维细胞的发展，从而预防瘢痕形成。为了重现自然伤口愈合的时间过程，研究人员开发了双层水凝胶，通过顺序释放小细胞外囊泡来促进快速无瘢痕伤口愈合。表皮干细胞来源的细胞外囊泡也具有减轻瘢痕形成的能力，例如通过递送miR-200s抑制ZEB1和ZEB12的表达，或通过富含miR-203a-3p抑制PIK3CA表达并抑制PI3K/AKT/mTOR通路。
4. 基于干细胞来源纳米囊泡的响应性水凝胶用于创面治疗
难愈性创面表现出自我修复能力受损，这归因于其复杂的病理微环境，其特征是pH失调、氧化应激、酶活性异常和病原体感染。理想的水凝胶敷料应兼具保护屏障和局部药物递送平台的功能，并具有刺激响应特性以调节微环境。作为高亲水性三维聚合物网络，水凝胶表现出优异的生物相容性、可降解性、多孔结构和可调节的机械性能，是负载干细胞来源纳米囊泡的理想平台。常见的将外泌体封装进水凝胶的策略包括混合-交联、原位凝胶化和物理掺入。此外，水凝胶可以可逆地改变其理化性质以响应外部刺激，从而实现精确控制的释放动力学。
4.1. pH响应性水凝胶
pH是创面愈合过程中的一个重要动态指标，直接反映组织再生状态和感染严重程度。完整的健康皮肤维持弱酸性微环境。皮肤屏障破坏后，创面微环境表现出特征性的pH波动。持续性感染会通过细菌产生氨和组织坏死导致pH向碱性偏移。为了解决难愈性创面中的病理性pH动态，研究人员设计了智能pH响应性水凝胶，通过将酸响应性键合结构或去质子化结构整合到载药水凝胶中，实现按需降解和精确的药物释放。例如，研究人员设计了基于普朗尼克F127/羧甲基壳聚糖/没食子酸/细胞外囊泡的多功能水凝胶系统，其希夫碱键赋予其优异的pH敏感性，能够在酸性感染创面环境中控制细胞外囊泡的释放。尽管pH响应性水凝胶通过监测创面pH的实时波动实现了智能药物释放，但单一的pH响应策略总是不足以适应难愈性创面的所有阶段。向多功能设计发展将能够针对异质性创面微环境的精准治疗平台。
4.2. 酶响应性水凝胶
创面愈合过程以多种水解酶和蛋白酶的动态时间变化为特征，其表达和活性在炎症期、增殖期和重塑期受到精确调控。这种高度有序且阶段特异性的酶表达模式为开发刺激响应性
