第二代生物燃料作物——皱叶油菜（Brassica carinata）高效农杆菌介导转化技术的开发

《Plant Molecular Biology》：Development of efficient Agrobacterium-mediated transformation of a second-generation biofuel crop, Brassica carinata

　　摘要
Brassica carinata（B. carinata）是一种有前途的非食品生物燃料作物，在适宜的管理条件下具有生产低碳强度生物燃料的潜力。然而，B. carinata需要对其许多农艺性状进行广泛的遗传改良才能广泛应用于农业系统。通过基因编辑或基因修饰快速改良它需要稳健且具有基因型灵活性的转化方案，因为现有的方法有限，并且仅应用于狭窄的种质基础，这阻碍了更广泛的遗传改良工作。在本文中，我们评估了五种不同B. carinata基因型的子叶柄在不同细胞分裂素处理下的芽再生能力。在测试的基因型中，再生效率在五个B. carinata基因型之间存在显著差异。在子叶柄中瞬时表达GUS报告基因证实了高转化效率，四种基因型的表达频率从96.4%到100%不等。一致地，这四种基因型的稳定转化效率至少达到了5%，最高效率为12%。有趣的是，转化效率和再生效率并不相关，表明后者在选择压力下不能作为转化效率的可靠指标。通过PCR验证了转基因整合，并使用数字滴液PCR进行了拷贝数分析。此外，从选定的转基因事件中获得的T1幼苗表现出对草甘膦的抗性，而野生型幼苗则表现出死亡。总体而言，这项研究提出了一种显著改进且可重复的农杆菌介导的B. carinata转化方法，为这种有前途的生物燃料作物的快速遗传改良和性状开发提供了可能性。

引言
Brassica carinata（B. carinata），通常被称为埃塞俄比亚芥或阿比西尼亚芥，是十字花科植物的一种。它是最古老的栽培叶类蔬菜和油料作物之一，起源于东非，特别是埃塞俄比亚（Maxted等人，1997年；Vaughan和Geissler，2009年）。最近，B. carinata作为一种有前途的油料作物出现，具有支持可持续农业和低排放可再生燃料及生物产品的潜力（Seepaul等人，2021年）。与许多传统油料作物不同，B. carinata表现出较强的非生物胁迫耐受性，这归因于其强大的主根系统、高效的水分利用能力和有效的养分吸收机制（Zoong Lwe等人，2021年；Limbalkar等人，2021年）。这有助于在水资源有限的情况下维持稳定的生物量和繁殖生产，使其成为资源受限农业环境中的首选作物（Gesch等人，2015年；Seepaul等人，2019年）。除了其农艺韧性外，B. carinata还在促进环境可持续性方面发挥着重要作用。作为一种冬季覆盖作物，B. carinata可以整合到双季种植实践中，从而在不影响食物产量的同时支持土壤健康（Bennett，2022年）。此外，其广泛的根系结构有助于土壤中的碳封存，而作为可持续航空燃料（SAF）的原料使用则显著减少了航空业的温室气体排放（Karami等人，2024年）。从B. carinata种子中提取的油含有高量的芥酸和亚油酸，非常适合转化为替代燃料，包括SAF和可再生柴油，这些燃料与现有的燃料基础设施和发动机兼容（Seepaul等人，2021年）。此外，提取油后剩余的富含蛋白质的粕料可用作高价值的牲畜饲料，而其他工业应用如生物塑料、生物润滑剂和生物农药也扩展了其生物经济潜力（Taylor等人，2010年）。随着对B. carinata的兴趣增加，通过现代生物技术方法促进其广泛应用变得至关重要。农杆菌介导的转化将有助于建立B. carinata的功能基因组学和定向性状改良的稳健框架。然而，关于这种作物的遗传转化的研究仅限于少数基因型（Babic等人，1998年；Chaudhary等人，1998年）。根据已发表的有限报告，所使用的外植体类型和选择剂对转化效率有深远影响（Babic等人，1998年；Chaudhary等人，1998年）。Chaudhary等人（1998年）报告使用子叶柄作为外植体并使用卡那霉素作为选择剂时，B. carinata Braun（C90 ? 1089）的转化效率为22%。同样，Babic等人（1998年）报告使用卡那霉素作为选择剂时转化效率为30-50%。然而，当使用L-膦酰胺（L-PPT）作为植物选择标记时，转化效率显著下降至只有1-2%（Babic等人，1998年），这表明选择剂的选择对转化结果有显著影响。在这两项研究中，都使用了子叶柄和下胚轴作为外植体；然而，子叶柄的反应最好，而下胚轴的转化效率未进行量化，但据指出较低（Babic等人，1998年）。在这两项研究中，使用的具体基因型是C90 ? 1089和C90 ? 1163，均由加拿大研究人员开发。早期在B. carinata中的再生研究表明，可以从下胚轴外植体成功再生芽（Yang等人，1991年），并且可以从下胚轴衍生的原生质体中完全再生植物（Narasimhulu等人，1992年）。这些研究证明了B. carinata的体外再生和农杆菌介导的转化，Babic等人（1998年）建立了稳定的转化方案，并通过分子分析和T1代遗传验证了该方案。随后，农杆菌介导的转化被用于性状改良，包括通过发夹RNA介导的内源FAD2基因沉默结合异源Crambe abyssinica FAE的表达，显著增加了B. carinata种子中的芥酸含量（Mietkiewska等人，2008年）。最近，在B. carinata cv. Pusa Gaurav中展示了简化的植物内方法，如花浸染法，实现了大约1.5%的转化效率，但此后没有后续报告（Verma等人，2008年）。对51个B. carinata种质的全面体外再生筛选显示，不同基因型之间的芽再生能力存在广泛差异（Gil-Humanes等人，2011年）。总体而言，这些研究表明虽然B. carinata适合农杆菌介导的转化，但成功高度依赖于基因型，并受到外植体选择、选择系统和转化方法的限制，从而限制了现有方案在多种种质中的广泛应用。对于特定基因型有效的转化方案可能对其他基因型无效，从而降低了该方法的多功能性和广泛适用性。例如，用于一种玉米自交系的方案不能应用于另一种（Brettschneider等人，1997年）。缺乏展示可重复性、稳定遗传或整合到现代基因编辑流程中的后续研究。为了解决这一关键瓶颈，我们评估了五种代表广泛遗传背景和表型多样性的B. carinata基因型的再生潜力，使用子叶柄作为外植体，在器官发生的不同阶段评估了不同浓度植物生长调节剂（PGRs）的效果。此外，我们展示了使用农杆菌介导技术在四种不同基因型中成功实施遗传转化的情况，采用了L-PPT作为选择标记。我们使用L-PPT作为选择标记的可重复转化方法预计将促进遗传改良，并支持通过基因编辑开发B. carinata品种的未来发展。

材料与方法
植物材料
B. carinata的种子DHN1和DHN2从澳大利亚的Nufarm获得。基因型ATC 94023（以下简称AGG1）和ATC 94024（AGG2）从澳大利亚Horsham的Australian Grains GeneBank获得。基因型52648（DW3）由澳大利亚新南威尔士州初级产业部（DPI）的Harsh Raman博士提供。B. carinata种子使用氯气进行消毒。简要来说，将100毫升商用漂白剂（White King premium漂白剂，次氯酸钠42克/升；氢氧化钠9克/升；氯4%（w/v）与3毫升浓盐酸混合，在干燥器中消毒3.5小时。消毒后的种子无菌转移到30毫升塑料容器中，并在室温下储存以供进一步使用。

种子萌发和外植体制备
大约15粒消毒后的种子接种到半浓度的MS培养基（Murashige和Skoog，1962）上，其中含有0.8%的琼脂（pH 5.8），并在23-24°C下，25-30微摩尔米^-2秒^-1的弱冷白光下，16/8小时（光照/黑暗循环）培养五天。长度达5毫米的子叶柄（CPs）无菌分离出来，用于与农杆菌一起进行再生和转化。

初步筛选再生潜力和优化
为了评估五种B. carinata基因型的再生潜力，从五天大的幼苗上切下的CPs在含有3%蔗糖的愈伤组织诱导培养基（CIM）上培养，其中添加了6-苄氨基嘌呤（BAP）（0.5毫克/升或1.0毫克/升）或噻唑uron（TDZ）（0.5毫克/升或1.0毫克/升），以及三种不同的抗氧化剂：L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号C7352）、抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号A7506）和谷胱甘肽（Sigma-Aldrich，目录号G6013），培养两周后，切除CP的子叶部分，将叶柄部分重新接种到CIM上再培养两周（图1；周期3）。在CIM周期结束时，将形成愈伤组织的叶柄转移到芽诱导培养基（SIM）上再培养两周。再生的芽和少量愈伤组织转移到芽生长培养基（SOG）上，该培养基旨在促进芽的伸长和进一步发育。所有培养基（CIM、SIM和SOG）的成分，包括生长调节剂和抗氧化剂添加剂，详细列在表1中。

农杆菌与CP外植体的共培养
本研究中使用了来自pcAMBIA系列的二元载体p1305.1（补充图1S A）进行GUS（β-葡萄糖醛酸酶）检测，以测试外植体的转化适宜性。它包含由CaMV35S启动子驱动的GUSPlus-His6报告基因（β-葡萄糖醛酸酶）中的催化酶内含子，并含有NOS终止子（https://www.snapgene.com/plasmids/plant_vectors/pCAMBIA1305.1）。为了生成稳定的转基因B. carinata，使用了二元载体pBSV-004（补充图1S B；Petrie等人，2012），其中包含膦酰胺乙酰转移酶（PAT）基因，该基因赋予对草甘膦的抗性（Basta抗性）。二元载体（p1305.1和pBSV-004）被转化到农杆菌（AGL1）（Nagel等人，1990）中。在LB琼脂板上生长的单个农杆菌菌落接种到含有卡那霉素（50毫克/升）和利福平（25毫克/升）的10毫升LB液体培养基中，并在28°C下摇摆培养过夜。农杆菌细胞的处理方法按照Belide等人（2011年）的描述进行，并用于感染 freshly isolated的CPs（Belide等人，2013年所述）。简要来说，过夜培养的细菌细胞被沉淀、洗涤并重新悬浮在10毫升MS培养基中（调整至OD 600 = 0.45），加入2%的葡萄糖，在28°C下培养4小时，加入100微摩尔的acetosyringone（AS）。为了最佳诱导vir基因，最终添加 spermidine 至1毫摩尔的浓度，并再培养两小时，按照Belide等人（2011年和2013年）的描述进行。新鲜分离的CPs（大约30个）用12.5毫升这种农杆菌培养物感染5-6分钟。受感染的外植体被印在无菌滤纸上以去除多余的细菌，然后置于共培养培养基中（表1；周期1）在23–24°C下黑暗环境中培养两天（图1；周期1）。

**组织化学GUS检测**
组织化学GUS检测按照Jefferson（1987年）的方法进行。受农杆菌感染的外植体被浸泡在新鲜制备的X-Gluc染色溶液中（2 mM X-Gluc溶解在0.1% [v/v]的二甲基甲酰胺和0.1 M NaPO?缓冲液中，pH 7.0），并通过真空渗透约60秒。样品随后在37°C下暗处孵育过夜。染色后，去除X-Gluc溶液，并将组织在24°C的80% [v/v]乙醇中脱色约8小时以去除叶绿素。显示GUS表达的蓝色染色外植体使用Leica立体放大显微镜（M60）进行检查和成像。在叶柄区域底部染色的外植体被标记为阳性转化。

**从外植体中选择和再生转基因芽**
与农杆菌共培养两天后，外植体被转移到预选培养基中（周期2；表1），并在23–24°C下光照条件下（16小时，45–50 μmol m?2 s?1）培养3–4天。培养3–4天后，受感染的外植体被转移到CIM培养基中（周期3；表1），并在23–24°C的凉白光（16小时，45–50 μmol m?2 s?1）下培养两周。在CIM培养两周后，去除扩展的子叶部分，然后将愈伤组织化的叶柄转移到新鲜的CIM培养基中（图1，周期3）。再过两周，将愈伤组织化的叶柄转移到SOG培养基中（周期4；表1），然后转移到SOG培养基中（周期5；表1），并继续培养两周。对于AGG1基因型，添加了Iota-carrageenan和CaCl2·2 H2O以评估其对过度水合作用的影响。这些添加剂不是标准SOG培养基的组成部分，但作为补充处理使用。从每个外植体中分离出约1厘米长的芽初始段，并在芽伸长培养基中（周期6；表1）继续培养四周（两周后进行继代培养）。来自单个外植体的所有芽都被视为克隆，并相应地进行维护。绿色且健康的芽（2–3厘米长）被转移到生根诱导培养基中（周期7；表1），并继续培养四周，或直到观察到从切口端长出大量的根。具有健全根系的幼苗被转移到温室中，植物被培养至成熟。该方法的不同步骤的示意图如图1所示。

**DNA提取和通过数字滴液PCR（ddPCR）分析转基因拷贝数**
转基因芽的基因组DNA按照Mieog等人（2013年）的方法分离，转基因（PAT）拷贝数按照Petrie等人（2020年）的方法确定。高移动性群（HMG）基因是芸苔属植物基因组中的一个拷贝（Weng等人，2004年），被用作参考。使用QuantaSoft?软件（Bio-Rad）分析来自转基因芽的数字滴液PCR（ddPCR）数据，以确定PAT转基因的拷贝数。

**谷氨酸胺叶面施用和抗除草剂性**
为了测试抗除草剂性，将具有不同转基因拷贝数的三种不同B. carinata基因型的T1种子（这可能影响PAT表达和抗性水平）以及未转化的种子播种在含有土壤的白色托盘上，并在24°C下、16/8小时的光照周期条件下控制生长大约三周。将商业谷氨酸胺除草剂（SureFire，PCT holdings Pty Ltd）稀释至0.05%，并均匀喷洒，直到叶片表面明显湿润，以确保非转化的亲本系和T1转基因幼苗叶片完全覆盖。初次喷洒后2–3周重复施用除草剂。

**统计分析**
包括平均值和标准偏差在内的再生和转化实验数据使用SigmaPlot（版本12）进行分析。不同基因型和处理之间的再生和转化频率差异在P < 0.05时被认为是统计显著的。

**表1 不同步骤中使用的培养基成分**
**图1**
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
**全尺寸图像**
B. carinata转化协议不同步骤的示意图（在BioRender中创建。Kaines, S. (2025) https://BioRender.com/undefined）

**结果与讨论**
短暂的GUS表达证实了子叶叶柄的可转化性
为了评估不同基因型外植体的可转化性，我们在四种B. carinata基因型中进行了短暂的GUS表达检测。选择这些外植体作为本研究的外植体，因为它们在农杆菌介导的转化过程中表现出色，适用于包括油菜在内的芸苔属植物，并且在这些外植体中始终支持高频率的再生和转化（Cardoza和Stewart 2003；Bhalla和Singh 2008；Chaudhary等人1998）。所有测试的四个基因型都观察到了高表达频率（96.4%–100%）（表2）。短暂的GUS表达的一致性表明农杆菌介导的感染和T-DNA的转移是成功的，这突显了这些外植体是适合转化的理想选择。本研究使用的构建体（p1305.1）在GUS编码序列中包含一个过氧化物酶内含子，这阻止了农杆菌中的报告基因表达，并将GUS活性限制在真核植物细胞中。这种设计确保了组织化学染色反映了植物自身的表达，而不是细菌的背景，从而验证了检测的特异性，并证明了在染色前省略抗生素洗涤步骤的合理性。

**表2 不同B. carinata基因型外植体中的短暂GUS基因表达**
**全尺寸表格**

**优化细胞分裂素浓度以促进愈伤组织衍生芽的再生**
从在低凉白光（25–30 μmol m?2 s?1）下生长五天的幼苗（五个基因型）中分离出外植体，并将其接种到添加了BAP或TDZ的CIM培养基上，浓度有两种不同（总共四种处理）。在早期关于B. carinata的再生研究中，主要使用的细胞分裂素是BAP，可以单独使用（Gil-Humanes等人2011）或与生长素如picloram联合使用（Narasimhulu等人1992）。选择BAP和TDZ是因为它们在芸苔属植物中诱导芽再生方面已被证明有效（Ravanfar等人2017；Yu等人2010）。接种约15天后，在外植体周围观察到深绿色的愈伤组织形成。切除外植体的子叶部分（上部），并将愈伤组织化的叶柄部分重新接种到CIM培养基上，再培养两周。在CIM培养一个月后，大多数基因型的外植体都形成了绿色的器官发生愈伤组织。再生效率（计算为：再生的芽数 / 接种的外植体数）× 100，显示BAP的表现略优于TDZ，在三个基因型中接近100%的愈伤组织诱导频率（表3）。在测试的基因型中，AGG2表现出最高的再生潜力，TDZ（Tr-2: 1.0 mg/L）处理平均每个外植体产生了19.6 ± 5.3个芽，所有外植体都产生了芽（100%的再生率）。BAP处理在AGG2上也表现良好，每个外植体产生了约12.0个芽。同样，DHN1在所有处理中的再生能力也很强，TDZ（0.5 mg/L）处理最好，每个外植体产生了12.5 ± 6.7个芽。另一方面，DW3和DHN2在所有处理中的再生潜力较低，平均每个外植体产生的芽少于五个。尽管DW3在大多数处理下都有100%的愈伤组织形成率，但它每个外植体平均只产生了2.1–4.2个芽，这表明虽然它能启动器官发生，但随后芽的形成受到限制。AGG1表现中等，几乎所有处理下的愈伤组织形成率都接近100%，但每个外植体产生的芽数量少于AGG2和DHN1。通过Tukey HSD事后检验来确定哪些细胞分裂素处理在不同基因型中产生了统计上显著的芽再生响应。结果显示AGG2表现出最显著的响应，TDZ处理（Tr-1和Tr-2）明显优于BAP处理。Tr-1与Tr-3（p = 0.03）、Tr-2与Tr-3（p < 0.001）以及Tr-2与Tr-4（p = 0.01）之间观察到显著差异。AGG1在TDZ（Tr-1）处理下也显示出适度但统计上显著的改进，与BAP处理相比。在测试的基因型中，DW3的整体再生能力较差；然而，Tr-3（0.5 mg/L BAP）与Tr-1相比明显较差（p = 0.03）。相比之下，DHN1和DHN2在不同处理之间没有统计上的显著差异。我们的结果表明，B. carinata的再生潜力很大程度上取决于基因型，这与先前的研究结果一致（Gil-Humanes等人2011）。本研究不仅证实了外植体的适用性，还提供了关于五个先前未被表征的基因型在体外再生反应方面的定量数据。AGG2和DHN1每个外植体的最大愈伤组织诱导和芽形成效率远高于现有的B. carinata研究报道，表明这些基因型及其最佳培养基条件的潜力。Narasimhulu等人（1992）从下胚轴原生质体中实现了22–74%的再生率，每个愈伤组织最多产生约6个芽。同样，Gil-Humanes等人（2011）使用子叶外植体评估了51个基因型，发现平均每个外植体产生2.9个芽，只有少数基因型的芽数量超过6个。相比之下，我们的研究一致地实现了接近完整的愈伤组织反应，并且芽的数量显著更多。包含抗氧化剂、在外植体转移到新鲜培养基上的精确时间以及细胞分裂素类型的调整可能有助于观察到的更好的器官发生反应。

**表3 使用不同浓度的细胞分裂素对再生效率的影响**
**全尺寸表格**

**优化后再生出稳定转基因B. carinata的过程**
接下来，我们尝试使用图2中显示的过程对四种B. carinata基因型进行稳定的农杆菌介导的转化。从五天大的幼苗中切下的外植体（图2a）与携带二元载体pBSV-004（Petrie等人2012）的农杆菌共培养，该载体含有赋予Basta（谷氨酸胺）抗性的PAT基因。用于再生的处理是Tr-2，因为这是大多数基因型的最佳或第二最佳处理，并被添加到共培养、预选和愈伤组织诱导培养基中（周期1、2和3；表1）。共培养的外植体在共培养培养基上生长2天后仍然保持绿色（图2b），而非转化的野生型外植体在CIM上生长两周后变白并萎缩（图2c），这证实了使用的选择浓度是适当的。共培养培养基中的绿色外植体被转移到预选培养基中，并孵育2–3天。在CIM培养两周结束时，出现了带有芽的绿色愈伤组织（图2d），这些芽在SOG培养基上进一步发育成芽（图2e）。生根后，植物被转移到土壤中（图2f和g），并通过PCR检测再生植物中是否存在转基因来验证PAT基因的存在。基于此，根据每个基因型中转基因阳性再生芽的数量计算转化效率（表4）。所有PCR阳性的芽都在生根诱导培养基上成功生根，生根阶段没有观察到损失。发现不同基因型的转化效率差异很大。DHN1显示出最高的转化效率（12%）。尽管其再生能力较低（表3），DW3的表现也相当好（9%），而AGG2的再生能力最强（表3），但其转化效率仅为5%。另一方面，AGG1的转化效率非常低（1%），这可能是由于愈伤组织表现出过度水合作用的影响。先前，Iota-carrageenan在红花和桉树转化协议中成功控制了愈伤组织的水合作用，并在两种情况下都提高了转化效率（Belide等人2011；Whitehouse等人2002）。因此，对于AGG1基因型，我们在培养基中添加了Iota-carrageenan和CaCl2（周期3；表1），以减少愈伤组织的水合作用，而没有对再生产生任何不利影响，并显著提高了转化效率5%。因此，四种B. carinata基因型的转化效率至少达到了5%。有趣的是，尽管AGG2和DHN1表现出最强的再生能力，但转化效率并不完全遵循相同的趋势。例如，尽管DHN1和DW3的再生反应适中到较低，但它们的转化效率分别达到了12%和9%。相比之下，具有最高再生能力的AGG2转化效率仅为5%。本研究的结果表明，在选择压力的作用下，再生能力并不能作为成功转化的可靠指标。虽然表现出能够产生多个芽的基因型通常有助于通过农杆菌介导的转化，但再生效率与转化率之间的关系仍然存在差异（Park等人，2012年）。

表4. 不同B. carinata基因型的转化效率

图2. 该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

图2. 转基因B. carinata植物的选择和再生。a. 5天大的、黄化的幼苗是愈伤组织的来源；b. 在共培养基上的转化愈伤组织；c. 对照组：未转化的野生型（AGG2）愈伤组织，在含有5毫克/升PPT的CIM培养基上；d. 在含有5毫克/升PPT的SIM培养基上产生绿色芽的转化愈伤组织；e. 在含有5毫克/升PPT的SOG培养基上从转化愈伤组织诱导出的多个芽；f和g. 成熟的转基因植物（AGG2），分别培养了6周和10周。

再生效率在所有基因型中都保持较高水平（95.4–100%），对于Tr-2（1毫克/升TDZ），这表明愈伤组织存活率和芽诱导频率的基因型差异很小。相比之下，第5轮时每个愈伤组织块产生的平均芽数在不同基因型间有显著差异，从DW3的3.0±3.0到AGG2的19.6±5.3不等。尽管存在这种差异，但芽的再生能力与转化效率之间没有正相关关系。因此，尽管AGG2表现出最高的芽增殖能力，但其转化效率却很低（5%），而DHN1和DW3的转化效率较高（分别为12%和9%），尽管它们的芽数量适中到较少。这些结果表明，仅凭再生特性不足以预测转化的成功，这支持了这样的结论：控制T-DNA传递、整合或对选择反应的基因型特异性因素是决定转化效率的主要因素。

在B. carinata中，很少有研究明确探讨再生与转化效率之间的关系。Babic等人（1998年）报告称，B. carinata的高转化频率与转化愈伤组织的高效再生有关，而非未转化细胞。重要的是，他们的研究还表明，在培养的第一周内直接从子叶柄上发育出的大多数芽并未发生转化，这表明早期和大量的再生并不一定对应于T-DNA的成功整合。

在其他芸苔属植物中也观察到了类似的现象，包括油菜（Brassica napus），在那里，再生效率最好被看作是一个允许性前提，而不是稳定转化效率的可靠预测因素。基于子叶柄或下胚轴外植体的广泛使用的农杆菌介导的转化系统，在优化培养条件后通常可以实现高再生频率；然而，转化效率在不同基因型之间仍有很大差异，并且主要受下游过程的影响，如农杆菌敏感性、T-DNA传递、稳定整合以及在选择压力下的存活（Moloney等人，1989年；Bhalla和Singh，2008年；Bates等人，2017年）。

因此，即使在不同基因型中再生表现始终很高，再生指标（例如再生百分比或每个外植体的芽数）与转化效率之间的明显正相关关系往往是弱的或不存在的。这很可能是因为主要的限制步骤发生在芽诱导之后，或者独立于芽诱导发生，包括基因型特异性的防御反应和对选择压力的不同敏感性（Bhalla和Singh，2007年；Cao Chu等人，2020年）。总体而言，芸苔属植物的转化文献支持这样的解释：达到高再生阈值可以通过增加可用于筛选的芽数量来提高实验产量，但不一定能增加独立转化事件的比例，后者主要受基因型×感染和选择生物学的影响（Bates等人，2017年；Cao Chu等人，2020年）。

转基因拷贝数和除草剂抗性的验证

在B. carinata转化后，使用数字滴定PCR（ddPCR）测量了四个不同转化基因型的28个独立T?系的PAT基因拷贝数（图3）。转基因拷贝数（CNV）范围从1到8，这意味着大多数转基因植物具有多个插入事件，这是农杆菌介导转化的典型特征（Jupe等人，2018年）。

为了评估PAT转基因是否赋予了除草剂抗性，对三种不同基因型（AGG2、DHN1和DW3）的T1植株喷洒了两次0.05%的草甘膦铵。喷洒后，转基因植株保持绿色并继续生长，而非转化的对照株则出现黄化并最终死亡（图4a-c）。这证明PAT转基因在B. carinata中可以传递对草甘膦铵的抗性。

图3. 该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

图4. 0.05%草甘膦铵叶面喷洒对转基因T1幼苗的影响。WT幼苗位于面板的左侧，转基因T1幼苗位于面板的右侧，包含三种不同基因型：a DHN1，CNV=1.97；b DW3，CNV=2.67；c AGG2，CNV=1.98。

结论

这项研究显著增强了B. carinata的基因工程工具箱，引入了一种利用愈伤组织作为外植体的可重复再生和转化方法。通过系统优化激素组合（特别是细胞分裂素）并加入缓解组织过度水化的物质，我们在多个基因型中实现了高频率的芽再生。记录的转化效率得到了分子检测和T1后代的功能性除草剂抗性的支持，证实了该方案在遗传多样性背景下的有效性。

据我们所知，这是首次系统评估多个B. carinata基因型的再生效率、转化能力、分子验证和性状表达的报告。除了概念验证之外，所建立的平台在加速B. carinata性状改良方面具有巨大潜力，适用于各种应用。它可以直接用于工程化与气候适应性相关的性状（例如耐旱性、耐霜冻性和耐盐性），以及除草剂抗性和提升的油含量和组成。