由哺乳动物启动子活性驱动的Cas9在大肠杆菌中的广泛表达，影响了CRISPR sgRNA文库的构建效果

《Communications Biology》：Pervasive Cas9 expression driven by mammalian promoter activity in E. coli affects representation of CRISPR sgRNA libraries

　　

摘要

CRISPR–Cas9筛选依赖于单导向RNA（sgRNA）文库的均匀分布，以确保基因发现的准确性。然而，在文库制备过程中存在的技术偏差可能会影响筛选效果。我们发现，常用的“一体化”CRISPR载体（同时表达Cas9和sgRNA）在质粒扩增过程中会导致大肠杆菌中Cas9蛋白的非预期表达。这种细菌内的Cas9蛋白表达会产生导向序列特异性毒性，从而导致特定sgRNA的选择性丢失以及文库分布的严重偏斜。我们证实这一现象普遍存在于多种细菌菌株中，并且会影响靶向文库和全基因组文库，包括广泛使用的人类CRISPR文库。从机制上看，这种毒性是由Cas9蛋白的表达引起的，而非质粒的大小；而使用催化活性较低的Cas9蛋白只能部分缓解这一问题。重要的是，将EF-1α启动子替换为小鼠磷酸甘油酸激酶启动子后，可以在细菌中抑制Cas9的表达，同时保持哺乳动物细胞中的基因编辑效率，从而恢复sgRNA的均匀性。这些发现揭示了CRISPR文库制备过程中一个此前未被注意到的偏差来源，并为提高筛选准确性提供了实际可行的解决方案。