利用基于质谱成像的酶组织化学技术，对人类皮质醇生成腺皮质腺瘤（CPA）中相对11β-羟化酶（CYP11B1）活性进行可视化分析

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Visualization of relative 11β-hydroxylase (CYP11B1) activity in human cortisol-producing adrenocortical adenoma (CPA) using mass spectrometry imaging-based enzyme histochemistry

　　**摘要**
酶在众多生化反应中起着关键作用，因此有必要评估它们的定位和活性。虽然传统的酶活性检测方法需要针对每种目标化合物使用特定的抗体和比色反应，但最近的一种利用质谱成像的方法通过直接将底物应用于组织切片并检测在这些切片上产生的酶反应产物，实现了酶分布和活性的可视化。值得注意的是，11β-羟化酶（CYP11B1，EC 1.14.15.4）的反应在应激反应、代谢和免疫功能调节中起着关键作用。因此，调控CYP11B1的活性可以显著影响这些生理过程，从而促进药物开发。因此，控制这种酶的活性将有助于开发相关疾病的新疗法。本研究探讨了一种可视化来自轻度自主皮质醇分泌（MACS）患者皮质的皮质醇生成腺瘤（CPA）组织切片中CYP11B1分布和相对活性的方法。通过优化底物和辅酶浓度以及反应时间等关键参数，该方法成功揭示了人类MACS中的相对CYP11B1活性。此外，在来自原发性醛固酮增多症患者的醛固酮生成腺瘤（APA）以及来自皮质腺瘤患者的非功能性肾上腺腺瘤（NFA）中也实现了可视化。本研究中获得的CPA、APA和NFA样本的相对CYP11B1活性与临床信息一致，并与先前报告的血液和尿液中的皮质醇、促肾上腺皮质激素（ACTH）和地塞米松抑制试验结果相符，从而验证了所提出的方法。

**引言**
酶在广泛的生化过程中发挥着重要作用。为了更好地理解这些过程，评估这些酶在生物系统中的分布和活性是必要的。传统的方法，包括免疫组化（IHC）方法和原位杂交，已被用于研究酶的定位[1, 2]。此外，转录组和遗传分析也被用于评估酶蛋白和mRNA的表达水平以及识别基因突变[3, 4]。然而，这些方法无法提供关于酶活性的定位信息。
酶组化是一种用于可视化组织和细胞中酶活性的技术[5, 6]。该技术已被用于在小鼠试验中定位17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-HSDs，EC 1.1.1.51）、3β-HSD（EC 1.1.1.145）和芳香化酶（EC 1.14.14.14）的活性[7]，以及在乳腺癌中定位NADH-亚甲蓝还原酶（EC 1.6.5.2）的活性[8]。尽管酶的分布不一定与酶活性的位置相关，但酶活性的定位与同一生物体内细胞和组织的代谢映射高度相关[5]。因此，酶活性的体内分析是理解生物现象的强大工具。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱成像（MSI）[9]能够实现组织切片中分子的可视化。在使用MALDI-MSI的酶组化中，将标记的底物应用于组织切片以区分内源性底物和产物。然后在最佳条件下进行酶促反应，并检查产生的标记产物以生成反映组织中酶活性分布的图像。该技术已被用于研究小鼠大脑中胆碱酯酶的活性分布[10, 11]以及大豆中谷氨酰胺脱羧酶的活性[12]。此外，研究还在小鼠肾脏中同时检测了多种酶的活性[13]。
线粒体酶11β-羟化酶（CYP11B1，EC 1.14.15.4）定位于肾上腺皮质束连接处和大脑中。它主要作为转换酶发挥作用，在人类中将11β-去氧皮质醇（11-DOC）转化为皮质醇，在小鼠和大鼠中将11-去氧皮质酮转化为皮质酮。这一反应参与了应激反应[14]、代谢[15]和免疫功能调节[16, 17]。调控CYP11B1的活性可以显著影响这些生理过程，使其成为药物开发的潜在目标。例如，在促肾上腺皮质激素（ACTH）过量分泌和库欣综合征（CS，其特征是长期暴露于不适当高水平的皮质醇）的情况下，抑制皮质醇水平有助于缓解肥胖、高血压、糖尿病和骨质疏松等相关症状[18, 19]。这种酶还有助于在醛固酮过量产生和皮质醇缺乏的情况下恢复激素平衡，如先天性肾上腺增生[20]。此外，它还可能影响肿瘤微环境和免疫反应[21]。然而，尿液中的皮质醇水平不足以特异性指示疾病，而血液中的皮质醇水平会随着昼夜周期波动，因此不适合作为CYP11B1活性的指标。相反，血清ACTH水平的抑制表明由于皮质醇过度分泌（ACTH独立的体细胞基因突变）而存在活跃的负反馈，而ACTH水平的升高则表明负反馈机制不起作用（ACTH依赖的），导致皮质醇过度分泌[22]。此外，尽管大多数ACTH独立的轻度自主皮质醇分泌（MACS，其特征是肾上腺产生过量皮质醇，但没有任何或仅有轻微的身体症状）病例被认为是由影响皮质醇合成途径的体细胞突变引起的，但也有报道指出在没有体细胞突变的情况下发生的MACS，这是由于CYP11B1过度表达、在皮质醇生成腺瘤（CPA）中活性增加（在这种情况下，身体产生和分泌过量的皮质醇，而不受垂体激素的调节），或其他类固醇合酶的异常定位/表达[23,24,25,26]。相反，醛固酮合酶（CYP11B2，EC 1.14.15.5）的表达通常降低[27,28,29]，表明皮质醇的产生占主导地位。此外，地塞米松抑制试验（DST）后皮质醇水平抑制不足提示存在自主皮质醇分泌（ACS）。此外，原发性醛固酮增多症（PA，其特征是尽管肾素水平低（肾素调节血压）但仍持续分泌过量醛固酮）患者的皮质醇水平在正常范围内或略高。然而，一些患者同时伴有ACS[30]。这种情况，即PA与CS（尤其是MACS）共存，被称为康恩综合征[31]，在这种情况下皮质醇水平可能正常或略高[32]。此外，DST后也有报告表明存在ACS的发现，包括血ACTH水平降低和血皮质醇水平升高。如前所述，MACS的诊断涉及多项检测，包括体细胞突变检测、血液和尿液中的皮质醇水平测量、成像和内分泌学检测[33]。治疗决策基于检测结果。因此，MACS的发病机制复杂，在临床环境中评估酶活性时需要考虑分子和功能数据。
先前的研究已经证实，CYP11B1在非功能性肾上腺腺瘤（NFA，即肾上腺皮质中发展出良性腺瘤，但不产生与CS或PA相关的过量激素的情况）[34]、醛固酮生成腺瘤（APA，其特征是独立于肾素-血管紧张素系统地过量产生醛固酮）和CPA中表达[34]。CYP11B1主要定位于NFA的束状带中，并且已知由于腺瘤生长或激素分泌的慢性不稳定，它可以转化为CPA或APA[35]。这些变化可能会改变CYP11B1的表达和定位模式。然而，这些腺瘤之间CYP11B1定位的差异及其对病理的影响尚未完全阐明。
在这项研究中，我们开发了一种结合酶组化和MSI的方法，用于可视化CPA、APA和NFA中相对CYP11B1活性的定位。为了可视化相对CYP11B1活性，建立了几项前提条件。通过确定这些前提条件，我们澄清了优化CYP11B1酶反应和解释相对CYP11B1活性结果的局限性，从而确保了该方法的有效性。首先，假设组织切片上的底物量超过酶量。在这种情况下，酶反应的速度不依赖于底物的浓度，可以解释为依赖于定位的酶活性。此外，同时测量底物和产物可以避免酶饱和。其次，假设皮质醇-d5仅通过CYP11B1活性产生。然而，由于组织中存在其他类固醇代谢酶和途径，因此并非所有皮质醇-d5都来自CYP11B1反应。为了最小化这种可能性，进行了底物选择和反应时间优化。第三个假设是，每次测量位置处的提取和电离效率的变异性（对于MALDI-MSI来说具有挑战性）可以通过标准化来校正。然而，由于通过这种校正获得的峰值不能解释样品内化合物特异性电离效率或抑制效应的差异，其应用仅限于相对空间比较。第四，假设从酶促反应开始到测量期间皮质醇-d5将保持定位。通过减少酶促反应和样品准备所需的时间，本研究尽量减少了扩散的影响。这种方法基于某些假设；因此，使用该方法获得的CYP11B1活性分布应被视为相对测量。此外，在统一条件下进行的比较分析表明，这是一种有效的评估组织内酶活性相对分布的方法。
MSI中的“相对CYP11B1活性”是通过产物量与底物量的比率来计算的。首先，确认了CYP11B1介导的底物转化。然后优化了底物、辅因子和孵育时间参数。最后，使用MSI可视化了人类CPA切片中相对CYP11B1的定位。同样的程序也应用于具有和不具有体细胞突变的人类NFA、APA和CPA切片。结果使用IHC进行了评估。此外，我们比较了使用MSI在人类NFA、APA和CPA组织中获得的相对CYP11B1活性。我们确认观察到的趋势与先前报告的皮质醇浓度曲线一致。

**实验**
**化学品和试剂**
冷冻的人类肾上腺块由九州大学提供（批准号：21025-03）。11-去氧皮质醇-2,2,4,6,6-d5（11DOC-d5）、11-去氧皮质醇（11DOC）、皮质醇、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2′-磷酸盐还原四钠盐水合物（NADPH）、Girard T试剂（GirT）、2,5-二氢苯甲酸（DHB）、α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA，98%）、PathoMount和抗-CYP11B1抗体（克隆80-7）从Merk（德国达姆施塔特）购买。十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙腈、乙酸、甲醇、三氟乙酸（TFA）、Mayer的血红宁溶液、乙醇、二甲苯和1%伊红Y溶液从FUJIFILM Wako Pure Chemical（日本大阪）购买。高pH抗体–抗原激活溶液（50×）从Agilent（美国加利福尼亚）购买。兔抗鼠IgG抗体（H?+?L）生物素标记和Universal Elite ABC标准试剂盒从Vector Laboratories（美国加利福尼亚）购买。超纯水使用超纯水纯化系统（GenPure UV-TOC xCAD Plus，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州）获得。所有组织样本在取出后立即被冷冻并储存在深度冷冻柜中。NFA是一种肾上腺肿瘤，不会分泌过多的激素。PA和MACS组织使用xGen Predesigned Gene Capture Pools（Integrated DNA Technologies，美国爱荷华州）进行了靶向DNA测序。获得的数据使用Genomon2流程（东京大学医学科学研究所人类基因组中心，日本东京）进行分析，以识别突变。ACS是一种肾上腺产生过多皮质醇的情况，这种产生是独立于大脑信号的，即皮质醇的产生不依赖于ACTH。ACS是CS的主要原因。MACS是ACS的一个子集。尽管它不表现出如CS这样的明显症状，但其特点是无法通过1毫克DST来抑制皮质醇的产生。与NFA相比，MACS还与代谢综合征（例如，血脂异常）和神经精神障碍（例如，抑郁和焦虑）的风险增加有关。即使症状轻微，它也带来健康风险，这使得它在临床上具有重要意义，并推动了诊断方法的建立。

所有组织样本在取出后立即被冷冻并储存在深度冷冻柜中。NFA是一种肾上腺肿瘤，不会分泌过多的激素。PA和MACS组织使用xGen Predesigned Gene Capture Pools（Integrated DNA Technologies，美国爱荷华州）进行了靶向DNA测序。获得的数据使用Genomon2流程（东京大学医学科学研究所人类基因组中心，日本东京）进行分析，以识别突变。ACS是一种肾上腺产生过多皮质醇的情况，这种产生是独立于大脑信号的，即皮质醇的产生不依赖于ACTH。ACS是CS的主要原因。MACS是ACS的一个子集。尽管它不表现出如CS这样的明显症状，但其特点是无法通过1毫克DST来抑制皮质醇的产生。与NFA相比，MACS还与代谢综合征（例如，血脂异常）和神经精神障碍（例如，抑郁和焦虑）的风险增加有关。即使症状轻微，它也带来健康风险，这使得它在临床上具有重要意义，并推动了诊断方法的建立。

未染色的、经福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的MACS样本使用17α-羟化酶（CYP17A1，EC 1.14.14.37）（IHC）切片作为指导进行切割，并分离出核酸。DNA分离、靶向捕获测序和体细胞突变检测使用之前报道的方法[36]进行。从定制的诱饵库中选择了包括MACS相关基因在内的总共36个基因。

为了将每个组织块固定在冷冻切片机（CM 1950，Leica Microsystems，德国Nussloch）的支架上，使用了一种最佳的切割温度化合物。所有组织切片在-20°C下使用冷冻切片机切割成8 μm的厚度。切片被解冻后固定在氧化铟锡涂层的玻璃载玻片（SI0100N，Matsunami Glass，日本大阪）上，用于MALDI-MSI，并在含有硅胶的50毫升锥形管中脱水。载玻片在-80°C下保存在管中，直到进行分析。

CYP11B1的底物溶液通过混合0.05–1 mM的11DOC-d5和0.05–10 mM的NADPH与超纯水或0.05 M的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）来制备。使用喷枪（GSI Creos，日本东京）将CYP11B1底物溶液（每片20 μL）均匀地涂在切片上。经过3分钟的底物处理后，组织在37°C下孵育0–60分钟。这里，0分钟的孵育定义为在37°C下不进行孵育。对照实验中的孵育是在铺有ProWipe并浸透了2毫升超纯水的培养皿中进行的。

为了确认观察到的产物是由内源性酶活性产生的，组织切片经过了酶失活处理。具体来说，切片在100°C下孵育30分钟以变性酶，阻止它们转化底物。

衍生化对于使用MALDI-MSI检测11DOC-d5和皮质醇-d5是必要的[37]。将10毫克的GirT溶解在1毫升乙酸：超纯水（2:8，v/v）溶液中并通过涡旋混合，然后在超声浴中处理10分钟以确保完全溶解。离心后得到的上清液被用作衍生化试剂。由于GirT试剂存在于pH约为2.0的酸性环境中，因此认为一旦试剂施加到组织切片上，目标酶的活性几乎被停止。GirT试剂使用喷枪和0.2毫米的喷嘴手动施加。手动喷雾的房间温度保持在大约25°C，湿度在35%–60%之间。喷嘴距离组织表面5厘米，喷雾5秒，然后干燥20秒。这个过程重复十次，每次每个切片施加约50 μL的GirT试剂，喷雾速率约为60 μL/分钟。喷雾后，衍生化反应在室温（大约25°C）下进行60分钟，以完成组织上的反应。

在衍生化反应完成后，立即将MALDI基质施加到组织上。在这个实验中，使用CHCA作为MALDI基质，并使用喷枪和0.2毫米的喷嘴进行喷雾。使用丙酮腈：超纯水（1:1，v/v）配制10毫克/毫升的CHCA溶液，并加入TFA以达到0.1%的最终浓度。CHCA溶液使用涡旋混合器混合，然后超声处理10分钟。得到的上清液使用喷枪喷洒在单个人类肾上腺切片上。手动喷雾的房间温度保持在大约25°C，湿度在35%–60%之间。喷嘴距离组织表面5厘米。第一轮喷雾5秒，然后干燥120秒。第二轮喷雾5秒，然后干燥40秒。从第三轮开始，喷雾5秒，然后干燥20秒。这个循环（喷雾5秒，然后干燥20秒）重复进行，直到每个切片喷洒了150 μL的CHCA基质，喷雾速率约为60 μL/分钟。基质施加后，样品在室温（大约25°C）下静置5分钟，然后进行测量。为了防止在基质喷雾过程中受到污染，使用不同的喷枪喷洒底物溶液、衍生化试剂和基质溶液。通过控制工作环境并使用光学显微镜检查载玻片表面的晶体状态来评估手动喷雾过程的均匀性。通过计算从同一载玻片上制备的标准溶液和组织切片获得的总离子电流（TIC）的变异系数（CV）来评估重复性。CV值在20%或以下被认为是可接受的。

所有MALDI-MSI实验[38]都是使用配备Nd:YAG激光（λ=355 nm；激光直径=25 μm）的MALDI离子阱飞行时间质谱仪（iMScope? TRIO；岛津，日本京都）进行的。数据以60-μm间隔收集。组织表面每个像素被照射80次，重复率为1 kHz。所有数据都是使用外部校准方法在正离子检测模式下获得的。激光功率和碰撞能量（在iMScope? TRIO中定义的无量纲）分别调整为50.0和75.0，微通道板探测器的电压设置为2.1 kV。样品分析后，基于从m/z 0.02 Da的目标离子的m/z范围内提取的峰值强度，使用IMAGEREVEAL? MS版本1.30.1.12682 SP1（岛津，京都，日本）重建离子图像。MS/MS产物离子峰在m/z 406.27和422.27分别用于生成11DOC-d5和皮质醇-d5的离子图像。为了确认GirT-cortisol-d5的结构，在组织中检测到的m/z 406.27的产物离子上进行了MS3测量（没有进行质量成像）。碰撞能量调整为65.0。其他测量参数与MS/MS测量相同。在MS3光谱中检测到m/z 404.26的目标峰。

为了确定皮质醇-d5与11DOC-d5的电离效率比，将皮质醇、11DOC和11DOC-d5标准品溶解在甲醇：超纯水（1:1，v/v）中，最终浓度为100 μM。每种标准品的0.3 μL溶液点印在人类肾上腺切片上。在分析衍生物后施加基质。从GirT-cortisol（m/z 417.24）、GirT-11DOC（m/z 401.24）和GirT-11DOC-d5（m/z 406.27）的质谱中获得平均总峰值强度（图S3）。使用以下三步方法估算皮质醇-d5与11DOC-d5的电离效率比：（1）计算皮质醇与11DOC的电离效率比为11DOC的平均强度除以皮质醇的强度；（2）计算11DOC-d5与11DOC的电离效率比为11DOC的平均强度除以11DOC-d5的强度；（3）通过将步骤（2）中获得的值除以步骤（1）中获得的值来计算皮质醇-d5与11DOC-d5的电离效率比。

获得的原始数据使用IMDX Converter软件转换为IMDX格式。转换后的IMDX文件使用IMAGEREVEAL? MS处理，以从由TIC图像的交集定义的感兴趣区域（ROI）中提取质谱。随后，对所有ROI应用TIC标准化，以校正技术偏差并获得不受TIC变化影响的质量谱。原始MS图像被标准化，相对CYP11B1活性使用以下公式计算：$$Relative\;CYP11B1\;activity\;(\%)\:=\:100\:\times\:\lbrack(\varepsilon\:\times\:I_{cortisol-d5})/(I_{11DOC-d5}\:+\:\varepsilon\:\times\:I_{cortisol-d5})\rbrack$$ （1）其中ε是皮质醇-d5与11DOC-d5的电离效率比。使用GraphPad Prism（GraphPad Software，美国波士顿，MA）进行单因素ANOVA，以分析三组（NFA、APA和CPA）之间的底物转化效率或相对CYP11B1活性。此外，还对两组（有和没有体细胞突变的组）进行了t检验。误差条代表标准偏差，用于比较数据变异性。样本之间的差异在5%的显著性水平下被认为是显著的。

用于MSI分析的相同切片在分析后用H&E染色。组织首先用Mayer的苏木精溶液染色1分钟，用自来水轻轻冲洗1分钟，然后用新自来水冲洗1分钟。然后将它们浸入1%的伊红Y溶液中2秒，再用上述方法冲洗。切片通过在100%乙醇中浸泡三次，每次1分钟，然后在100%ξylene中渗透两次进行脱水。渗透后，将切片固定在抗脱落涂层玻璃载玻片（Matsunami Glass Industry）上，组织切片朝上，用PathoMount密封，并覆盖盖玻片（Matsunami Glass Industry）。样品过夜干燥，然后使用全能显微镜（BZ-X710；Keyence，日本大阪）获取它们的图像。

在冷冻组织切片用水冲洗后，它们在室温下用5%的福尔马林固定20分钟。固定后，切片在95°C下用高pH抗原回收溶液洗涤10分钟进行抗原回收。然后切片在室温下用0.3%的过氧化氢洗涤10分钟以失活内源性酶。用Tris缓冲盐水（TBS）冲洗两次后，加入一级抗体CYP11B1（鼠单克隆；稀释=1:300），并在室温下孵育60分钟。反应后，切片用TBS冲洗两次。然后加入二级抗体，抗大鼠IgG抗体（H+L）生物素化（兔多克隆），并在室温下孵育30分钟。切片再用TBS冲洗两次。加入VECTASTAIN Elite ABC试剂（辣根过氧化物酶；HRP）作为标记酶，并在室温下孵育30分钟。反应后，切片再用TBS冲洗两次，然后加入3,3′-二氨基苯二甲肼（DAB）底物溶液以显色。显色后，切片再用TBS冲洗两次，然后用苏木精进行核染色。脱水和封片的过程与H&E染色类似，然后在显微镜下观察切片。

首先，我们确认了CYP11B1在人类肾上腺皮质腺瘤切片中将底物转化为产物的能力。通过喷枪施加11DOC-d5和NADPH底物溶液后，切片在37°C下孵育10分钟。随后，使用喷枪施加CHCA作为基质，并检测到底物（11DOC-d5）和产物（皮质醇-d5）。图1a显示了人类肾上腺皮质腺瘤切片中GirT-DOC5和皮质醇-d5的产物离子谱。为了进一步表征GirT-cortisol-d5的碎片模式，我们进行了三级质谱（MS3）分析（图S1）。谱图显示了GirT-11DOC-d5和皮质醇-d5的碎片离子在MS/MS中的m/z 406.27和422.27，这些离子来自GirT的非试剂侧。为了确认这种转化是由于人类肾上腺皮质腺瘤中的CYP11B1活性引起的，我们在100°C下加热失活30分钟后重复了相同的实验。在未失活的样本中检测到了皮质醇-d5，而在失活的样本中则没有检测到（图1b）。这一结果验证了CYP11B1在人类肾上腺皮质腺瘤样本中将11DOC-d5转化为皮质醇-d5的过程。为了确认NADPH作为CYP11B1酶促反应中辅因子的关键作用，我们使用含有和不含有NADPH的底物溶液进行了实验。只有在含有NADPH的情况下，在人类肾上腺样本中检测到了皮质醇-d5（图1c）。此外，我们评估了两种基质（CHCA和DHB），以确定哪种基质最适合用于皮质醇的检测。CHCA中的皮质醇-d5平均强度显著高于DHB（图S2）。因此，我们选择了CHCA作为后续实验的基质。另外，当使用与预处理时相同量的11-DOC来计算峰强度的变异系数（CV）时，所有值都落在通常认为的10%范围内。这表明由于样品处理、基质沉积和衍生化效率的影响很小，意味着预处理过程对酶转化率和活性值的影响有限。然而，尽管采取了这些控制措施，MSI图像中的组织边界有时仍然不清晰，与H&E染色的对应关系也不完全。一个可能的原因是MSI分析和H&E染色之间的分辨率差异，另一个原因是这两种方法捕获的信息类型不同。MSI测量的是几十微米尺度上的分子分布，而H&E染色能够观察到细胞和组织水平上的精细形态结构。因此，如果不同的组织成分（例如，光染色细胞和密集细胞）共存在于一个MSI像素内，组织边界可能会显得不明显。此外，在图像分析过程中，归一化过程可能会平均掉靠近组织边界的信号，从而降低对比度，导致边界显得不清晰。除了这些数据处理方面的限制外，还可能涉及到基质供应、染色过程中的扩散以及组织变形等因素。未来的研究可以通过优化组织切片处理、基质递送方法和MSI测量条件来提高空间一致性。

图1：通过CYP11B1在人类肾上腺皮质腺瘤样本中转化底物的确认。a. GirT-11DOC-d5和GirT-cortisol-d5的化学结构及其对应的质量谱，它们分别是由GirT与11DOC-d5和皮质醇-d5反应生成的。前体离子峰和产物离子峰分别位于m/z 465.34和m/z 406.27，对于GirT-11DOC-d5；以及m/z 481.34和m/z 422.27，对于GirT-cortisol-d5。NADPH作为电子供体，使得底物能够发生羟基化。b. 肾上腺皮质腺瘤样本被喷洒11DOC-d5并在37°C下孵育10分钟。H&E图像（左）和皮质醇-d5的分布（MS/MS产物离子峰在m/z 422.27；右）在未失活和失活的样本中。颜色刻度条显示了强度（a.u.）的范围，为0–1.9×10^5。刻度条长度为1500 μm。c. H&E图像（左）和皮质醇-d5的分布（MS/MS产物离子峰在m/z 422.27；右）在含有（+）和不含（?）NADPH的人类肾上腺皮质腺瘤样本中。颜色刻度条显示了强度（a.u.）的范围，为0–5.4×10^5。刻度条长度为1500 μm。虚线表示组织的轮廓。

为了优化MALDI-MSI中的CYP11B1酶反应，我们调整了底物和NADPH的浓度以及孵育时间，以可视化相对的CYP11B1活性。图2展示了使用以下公式计算的转化率：$$转化率\;(\%)=\:100\:\times\:\lbrack I_{皮质醇-d5}/(I_{11DOC-d5}\:+\:I_{皮质醇-d5})\rbrack$$（2）

图2：在不同条件下的底物转化率比较（NADPH 10 mM），包括：a) 不同底物浓度；b) NADPH浓度固定为0.1 mM，底物浓度不变；c) 不同孵育时间。所有实验均重复三次进行。

CYP11B1酶的活性在pH值6.5–7.0和反应温度30–37°C时最佳[39]。因此，在本研究中，底物溶剂的pH值设定为7.0，并在37°C下进行酶促反应。此外，使用0.05 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）作为底物溶剂以维持pH值。然而，与使用超纯水相比，转化率没有显著差异（图S3）。鉴于pH值对酶促反应有显著影响，选择了pH值约为7.0的磷酸盐缓冲液来维持CYP11B1酶的活性并保持铁离子的氧化状态，因为铁离子是辅因子。当辅酶（NADPH）浓度固定在10 mM时，无论底物浓度是0.05、0.1、0.5还是1 mM，转化率都没有显著差异（图2a）。在底物浓度为0.05 mM或更高时，认为酶具有足够的底物供应。此外，当底物浓度保持在0.1 mM时，NADPH浓度为5和10 mM时的转化率显著高于0.05和0.5 mM（图2b）。这些结果表明，在有足够的辅酶存在时，酶活性达到峰值。然而，过量的辅酶可能会降低酶活性，导致酶失活、特异性丧失和不希望的副反应。结果表明，至少需要5 mM的NADPH才能为0.1 mM的底物浓度提供适当的辅因子浓度。此外，还研究了添加底物后的孵育时间对转化率的影响。图2c展示了0–60分钟孵育时间内的转化率。将产物强度与反应时间作图显示出在反应的前10分钟内高度线性（R2 > 0.99）（图S4）。在此范围内，产物形成率保持恒定，表明初始反应条件得到满足。此外，在线性范围内，10分钟时的底物消耗量不到供给底物量的10%。基于这些发现，确定10分钟的孵育时间是酶反应的最佳时间，因为底物浓度的降低和酶的不稳定性不会影响反应速率。此时，检测到的皮质醇-d5强度被认为是反映了在线性反应条件下CYP11B1酶的相对活性分布。所有基于皮质醇-d5信号强度的后续CYP11B1活性评估都是在这些优化后的实验条件下进行的。

为了可视化组织中的酶活性，我们在优化条件下评估了外源性底物（11DOC-d5）及其代谢物（皮质醇-d5），并使用考虑了组织特异性基质效应和电离效率的计算方法来可视化相对CYP11B1活性。使用MALDI-MSI对MACS人肾上腺腺瘤样本中的相对CYP11B1活性进行了成像（图3a）。通过MS/MS从GirT-11DOC-d5（m/z 465.35）和GirT-cortisol-d5（m/z 481.34）的前体离子获得了m/z 406.27和m/z 422.27的产物离子谱。图3b显示了未经处理的MACS人肾上腺腺瘤样本中GirT-11DOC-d5和GirT-cortisol-d5的离子图像，包括归一化处理。归一化对于正确解释MALDI-MSI成像数据非常重要[40]。MALDI-MSI获得的谱强度受到样品的分子离子强度、电离效率和基质类型等因素的影响。归一化对于消除这些偏差和提高数据可靠性是必要的。常用的归一化方法包括TIC归一化、峰值面积归一化和最大强度归一化。在这项研究中，使用了E1进行归一化，以考虑11DOC-d5和皮质醇-d5的基质效应，具体方法如下：$$相对CYP11B1活性\;(\%)=\:100\:\times\:\lbrack(\varepsilon\:\times\:I_{皮质醇-d5})/(I_{11DOC-d5}\:+\:\varepsilon\:\times\:I_{皮质醇-d5})\rbrack$$（3）

为了可视化11DOC-d5和皮质醇-d5并评估相对CYP11B1活性，我们图化了11DOC-d5和皮质醇-d5。a. 在酶促反应后，GirT-11DOC-d5和GirT-cortisol-d5的MS/MS质谱，产物离子峰分别位于m/z 406.27和m/z 422.27。颜色刻度条显示了强度（a.u.）的范围，为0–1.4×10^5。b. 未经处理或归一化的MACS人肾上腺样本中11DOC-d5和皮质醇-d5的离子图像（像素间距为80 μm）。颜色刻度条显示了强度（a.u.）的范围，为0–5.5×10^5。c. 归一化后的相对CYP11B1酶活性和H&E图像。颜色刻度条显示了相对CYP11B1活性范围，为0%–70%。刻度条长度为1500 μm。虚线表示组织的轮廓。其中ε是11DOC-d5与皮质醇-d5的电离效率比，反映了11DOC-d5和皮质醇-d5的电离效率可能存在差异。为了校正峰强度的差异，将皮质醇-d5的峰强度除以11DOC-d5和皮质醇-d5的峰强度之和。

为了估计11DOC-d5到皮质醇-d5的转化效率比（因为转化率低于100%，即转化不完全），我们采用了三步法。我们准备了人类肾上腺样本，并分析了组织中11DOC、11DOC-d5和皮质醇的等量。这些化合物在每个样本点的总离子峰强度显示在图S4中。鉴于皮质醇-d5与11DOC的平均离子强度比为0.93，我们引入了一个校正系数ε来校正电离效率，具体方法如下：$$相对CYP11B1活性\;(\%)=\:100\:\times\:\lbrack(0.93\:\times\:I_{皮质醇-d5})/(I_{11DOC-d5}\:+\:0.93\:\times\:I_{皮质醇-d5})$$（4）

图3c显示了使用上述公式处理原始数据后得到的11DOC-d5和皮质醇-d5的相对CYP11B1活性分布（图3b）。H&E图像（图3c的左侧）显示了组织中相对CYP11B1活性的不均匀分布。

接下来，我们测量了具有不同特征的肾上腺腺瘤中CYP11B1的相对活性，并通过将其结果与先前报道的临床发现进行比较，评估了所提出方法的有用性和有效性。图4a展示了人NFA、APA和CPA中相对CYP11B1活性的MSI和IHC结果。IHC分析显示CYP11B1在NFA中局部化，但在APA和CPA中广泛分布。然而，在肾上腺皮质腺瘤中，CYP11B1的表达模式发生了变化，导致其分布不均匀。此外，通过IHC观察到的酶分布与MSI测量的酶活性之间的比较表明，CYP11B1的分布与其酶活性不符。这些结果表明，必须同时评估酶的分布和活性才能全面理解生物体内的生化反应。

图4：人肾上腺皮质腺瘤中相对CYP11B1活性的可视化。11DOC-d5底物被喷洒到人肾上腺皮质腺瘤样本上并在37°C下孵育10分钟。a. H&E图像、NFA、APA和CPA样本的相对CYP11B1活性图以及IHC图像。白色箭头表示清晰细胞的典型图像，黑色箭头表示致密细胞的典型图像。颜色刻度条显示了相对CYP11B1活性范围，为0%–45%。刻度条长度为1500 μm。b. NFA、APA和CPA样本中相对CYP11B1活性的比较。对于每个肾上腺腺瘤（NFA、APA或CPA）患者，分析了三个相邻的样本，并将相对CYP11B1活性表示为平均值±标准差。虚线表示组织的轮廓。

尽管IHC检测到的强度与CYP11B1的量相关，但其表达与其活性并不相关。已经提出了几种机制来解释CYP11B1蛋白的定位与其酶活性之间的差异。可能是CYP11B1没有经历对其线粒体功能表达至关重要的前序蛋白切割，或者它通过磷酸化等翻译后修饰而失活。同时，即使在蛋白质表达水平低于IHC检测限的情况下，仍然保持高酶活性。因此，不能仅基于IHC结果来评估CYP11B1的功能活性。为了更准确地评估活性，在每个肾上腺皮质腺瘤的三个样本中测量了CYP11B1的相对平均活性。NFA和APA之间的相对CYP11B1活性没有显著差异；然而，NFA中的活性趋于更高。同时，CPA中的相对CYP11B1活性显著高于NFA和APA（图4b）。这些结果表明，CPA（肾上腺皮质增生）既诱导了ACS（动脉粥样硬化），又增加了CYP11B1的活性。此外，通过MSI（微阵列扫描）测量的相对CYP11B1活性在PA（肾上腺皮质增生）组织中 tends to be lower than在NFA（正常肾上腺组织）中。这表明PA的病理特征主要是正常的皮质醇水平和升高的醛固酮水平 [27]。为了验证观察到的CYP11B1活性分布与其相对强度与组织形态异质性之间的对应关系，我们为IHC（免疫组化）中的CYP11B1表达分布和MSI中的CYP11B1活性分布设置了ROI（感兴趣区域）。然后比较了CYP11B1的相对活性值。在NFA中，CYP11B1的表达分布和活性分布都局限于特定区域。此外，在MSI中，设定为酶活性分布区域的ROI内的CYP11B1相活性值高于设定为CYP11B1表达区域的ROI内的活性值。这些结果表明，CYP11B1酶活性可能仅在NFA的某些区域表达和发挥功能。NFA的结构与正常肾上腺皮质相似。有报道称，与功能性腺瘤相比，CYP11B1的表达和活性没有显著增加，保持在较低水平 [4]。因此，认为其活性保持在不会导致过度产生皮质醇的水平是可接受的。人们认为，NFA中观察到的“CYP11B1活性局部增加”的空间特征与CPA中观察到的“CYP11B1活性广泛增强”的特征不同。使用H&E（苏木精-伊红）染色进行的形态学评估显示，APA主要由富含脂质的苍白细胞组成，而CPA主要由富含线粒体等细胞器的致密细胞组成。同时，NFA显示出这两种细胞类型的混合模式。检查细胞形态与酶活性之间的关系后发现，CYP11B1活性在致密细胞区域显著升高，超过了表达水平。相比之下，苍白细胞区域的活性通常较低。形态学和功能也不一致，表现为从苍白细胞到致密细胞的形态变化、线粒体的定位以及存在不会升高血液皮质醇水平的低活性区域。尽管如此，这些细胞成分在每个腺瘤内的含量和分布模式与肿瘤的整体CYP11B1活性高度相关。这强烈表明，CYP11B1活性的异质性分布直接反映了腺瘤内的形态异质性。基于上述临床数据和CYP11B1相对活性的结果，验证了这种MSI分析的有效性。这些生物学和临床解释强烈支持所提出方法的可靠性。此外，使用MSI可视化CYP11B1活性分布有望有助于阐明肾上腺腺瘤的形态学特征与其产生皮质醇能力之间的关联。这应该有助于更深入地理解单个腺瘤内的功能异质性。

接下来，为了研究具有和不具有皮质醇合成途径体细胞突变的腺瘤之间CYP11B1表达水平和活性的差异，我们比较了具有和不具有皮质醇合成途径体细胞突变的CPA中的相对CYP11B1活性。图5a展示了来自两组的人体CPA的H&E图像、基于MSI的相对CYP11B1活性图以及IHC图像。无论是否存在体细胞突变，都在局部区域观察到了高酶活性。如前一节所讨论的，CYP11B1的表达分布与其酶活性并不对应（图4a）。从每个人体肾上腺的三个切片计算出的平均相对CYP11B1活性值在突变阳性组和突变阴性组之间没有显著差异（图5b）。此外，H&E染色显示，在突变阴性组织中主要是致密细胞，而在突变阳性组织中主要是透明细胞。对于以透明细胞为主的腺瘤，CTNNB1突变往往导致CYP11B1蛋白表达模式的异质性，并且基于形态学评估预测的活性与实际酶活性之间往往存在显著差异。在这项研究中，尽管以透明细胞为主，这些细胞倾向于表现出较低的CYP11B1活性，但相对CYP11B1活性仍然很高。这被认为是由于与CTNNB1突变相关的Wnt信号通路持续激活导致的CYP11B1转录促进。这表明CTNNB1突变具有特异性影响类固醇激素合成途径和脂质代谢系统的调节机制。

图5：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像：使用具有皮质醇合成途径体细胞突变的人体肾上腺皮质腺瘤的成像。a. 具有和不具有体细胞突变的CPA切片的H&E图像、相对CYP11B1活性图以及IHC图像。白色箭头表示典型的透明细胞图像，黑色箭头表示典型的致密细胞图像。颜色刻度条显示了0%–60%的相对CYP11B1活性范围。刻度条：1500 μm。b. 比较具有和不具有体细胞突变的CPA切片中的相对CYP11B1活性。在一个具有体细胞突变的患者和一个人没有突变的患者中，分别在三个相邻切片中测量了CYP11B1的相对活性。结果以平均值±标准差表示。虚线表示组织的轮廓。

这些结果表明，无论是否存在体细胞突变，多种信号通路都可能参与CYP11B1的激活。实际上，多种通路都参与了CYP11B1的激活 [41]。本研究中获得的相对CYP11B1活性与先前的结果一致，这表明这种分析方法是有效的。然而，获取临床样本和相关数据的限制阻碍了使用这些样本进行充分的比较验证。此外，可重复性实验的数量有限，与其他酶活性测量方法的比较也受到限制，这些都是确保该方法性能所必需的。未来，必须通过提高可重复性评估和进行与标准酶活性测量方法的系统比较验证来明确这种分析方法的精度、灵敏度和应用范围。

参与类固醇激素生物合成和代谢的酶系统非常复杂，包括各种羟化酶、脱氢酶和结合酶，如CYP11B1酶。本研究首次揭示了肾上腺皮质腺瘤中相对CYP11B1活性的组织分布，为了解其活性的生理调节提供了重要见解。该方法基于将标记的底物递送到组织切片，并使用MSI来空间可视化通过酶反应生成的代谢物。只要酶反应产物可以通过质谱法检测到，这种方法就可以应用于其他细胞色素P450酶以及参与类固醇生物合成的酶。实际上，我们确认了该方法适用于5α-还原酶（EC 1.3.1.30，将睾酮转化为二氢睾酮）和芳香化酶（将睾酮转化为雌二醇）。然而，底物特异性、产物离子化效率和组织内的代谢复杂性等因素可能会影响其应用范围和灵敏度，因此不能排除这些因素的影响。尽管如此，由于该方法能够对组织内的特定酶活性进行空间评估，预计它将在未来研究中比较多种类固醇合成酶的局部活性方面发挥作用。此外，它有望成为阐明类固醇激素生物合成代谢异常和紊乱的根本原因的强大工具。更深入的见解可能有助于未来治疗策略的发展。虽然本研究的结果具有临床意义，但该方法目前主要用于研究目的。在将其应用于常规临床实践之前，需要进一步标准化该方法并使用外部队列进行验证。