利用乳酸乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）的菌体包封技术，从甘油高效且经济地生产鲁特林（reuterin）

《Bioresource Technology Reports》：Curd encapsulation of Limosilactobacillus reuteri for efficient and cost-effective production of reuterin from glycerol

　　

Xizhi Hong|Belay Tilahun Tadesse|Shuangqing Zhao|Christian Solem

丹麦技术大学国家食品研究所，DK-2800，Kgs. Lyngby，丹麦

摘要

Limosilactobacillus reuteri DSM 17938是一种经过充分研究的益生菌，在食品中的应用具有可靠的安全记录，包括在婴儿配方奶粉中的使用。L. reuteri具有将甘油转化为3-羟基丙醛（3-HPA）的能力，而3-HPA的化学衍生物（即reuterin）可以用作清洁标签的生物防腐剂。L. reuteri细胞悬浮在缓冲的甘油溶液中能够产生reuterin，然而，自发形成的丙烯醛以及氧气对甘油脱水酶的失活会干扰其持续生产。在本研究中，我们发现低温（15°C）有助于保持L. reuteri的活力及其产生reuterin的能力。较高温度会导致活力下降和reuterin浓度降低。后一种效应可以通过间歇性培养细胞在营养液中部分补偿，从而实现细胞的重复使用。最重要的是，我们发现将L. reuteri封装在牛奶凝胶（凝乳酶凝固产物）中具有保护作用，仅需使用七分之一的细胞量即可生产reuterin，这应显著降低reuterin的生产成本并促进其作为食品防腐剂的使用。总体而言，我们展示了一种简单、可扩展且可持续的食品级甘油转化为reuterin的工艺。

引言

3-羟基丙醛（3-HPA）是由某些细菌通过微生物转化甘油产生的，其中包括几种乳酸菌（Nakanishi等人，2002年）。其中一种研究较为深入的产菌是Limosilactobacillus reuteri，这是一种异型发酵乳酸菌，可能与Lactobacillus菌株208-A相同（Slininger等人，1983年；Smiley和Sobolov，1962年；Sobolov和Smiley，1960年）。据报道，丙烯醛是所谓的reuterin体系中最有效的抗菌成分，该体系还包括reuterin及其衍生物（Schaefer等人，2010年）。早期关于reuterin体系的研究表明，其抗菌作用不仅限于细菌，还扩展到酵母和丝状真菌，这表明其在食品生物防腐方面具有巨大潜力（Talarico和Dobrogosz，1989年）。由于丙烯醛具有强亲电性，它会迅速与细胞内的巯基化合物（如谷胱甘肽和巯基依赖性酶）反应，从而破坏细胞代谢（Engels等人，2016年）。

作为异型发酵乳酸菌，L. reuteri通过产生reuterin获益，因为这种化合物可以进一步还原为1,3-丙二醇（1,3-PDO），使L. reuteri能够重新氧化多余的NADH并产生乙酸，从而将ATP产量翻倍（Condon，1987年）。为了达到同样的目的，其他异型发酵乳酸菌利用外部电子受体，如富马酸和苹果酸（Stolz等人，1995年）。L. reuteri依赖于一种依赖钴胺素的甘油脱水酶（GDH），该酶由pdu操纵子编码。通过将reuterin及其衍生物物理隔离在代谢体（一种多面体蛋白质微区室）内，该微区室也由pdu操纵子编码（图1），L. reuteri减少了细胞质中这些有毒中间体的暴露，并将其引导至下游的氧化还原反应中，从而维持辅因子的平衡和reuterin的持续生产（Sriramulu等人，2008年）。甘油脱水酶对氧气极为敏感，因此必须确保厌氧条件以实现reuterin的有效生产。研究表明，甘油脱水酶在没有底物的情况下不稳定，底物的稳定效果各不相同；甘油对其稳定作用最小，1,2-乙二醇次之，1,2-丙二醇效果最好。在没有底物的情况下，腺苷钴胺素（AdoCbl）会与氧气反应，生成羟基钴胺素，这是一种不可逆的钴胺素依赖性酶抑制剂（Poznanskaya等人，1977年；Slininger等人，1983年）。（见表1。）

来自乳制品模型系统和实际奶酪的证据表明，将产生reuterin的L. reuteri包裹在凝乳中在技术上是可行且有效的。在添加了30–50 mM甘油的UHT牛奶基奶酪模型中，L. reuteri在生产和成熟过程中存活下来，并在凝乳中产生了高达5.5 mM的reuterin，这种浓度可以抑制或杀死多种食源性病原体（Langa等人，2013年）。工业规模的奶酪试验也证实了添加了30 mM甘油的牛奶制成的奶酪中L. reuteri产生的reuterin浓度，这些奶酪的挥发性特征与对照组相当。

L. reuteri的静止细胞也可以产生reuterin。在传统的两阶段工艺中，细胞在富营养培养基中培养，收获后清洗，然后作为非生长催化剂使用。这种方法的一个挑战是reuterin及其衍生物对细胞代谢的毒性作用以及氧气对甘油脱水酶的失活。

本研究的总体目标是实现reuterin的更持续生产。我们测试了不同的温度，以确定有利于reuterin持续生产的温度。我们还探讨了通过间歇性培养细胞在营养液中重新激活细胞的可能性。最后，我们研究了将L. reuteri封装在凝乳中是否有助于细胞的重复使用和reuterin的反复生产，并发现这对整个细胞催化剂具有显著的稳定作用，可以抵抗reuterin的毒性影响。

章节片段

试剂和生长培养基

酵母提取物、MRS肉汤和酪蛋白胨从Oxoid（英国巴斯林斯托克）购买。MRS通过将52 g/L的MRS粉末溶解在纯水中制备。除非另有说明，所有其他化学品均从Sigma-Aldrich（德国达姆施塔特）购买，包括氯化钠（NaCl）、氯化钙（CaCl₂）、氯化镁（MgCl₂）、甘油、d-葡萄糖、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）、磷酸二钾（K₂HPO₄）和维生素C（VC）。POM缓冲液的pH值（包含100 mM K

温度对活力和reuterin浓度的影响

自1942年以来，人们就知道reuterin会转化为有毒的丙烯醛，这一反应在低pH值和高温条件下会加剧（Pressman和Lucas，1942年）。因此，我们研究了温度对从甘油产生reuterin的细胞活力和reuterin浓度的影响。

培养温度显著影响细胞活力，15–20°C似乎在生产力与活力之间提供了合理的平衡。

结论

总之，我们发现通过降低温度可以优化reuterin的生产，这有助于保持细胞的活力和催化活性。凝乳封装的效果令人惊讶，它不仅允许简单重复使用细胞，还减少了高细胞密度的需求。为了更广泛地使用reuterin作为食品防腐剂，其生产过程必须简单且成本低廉，我们的研究表明这是可行的。凭借其广泛的抗菌作用

CRediT作者贡献声明

Xizhi Hong：撰写——初稿、可视化、验证、方法学、数据分析。Belay Tilahun Tadesse：可视化。Shuangqing Zhao：撰写——审阅与编辑、监督。Christian Solem：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、项目管理、方法学、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了Milk Levy基金会（项目“BeSafe”）（无具体资助编号）和Gr?nt Udviklings og Demonstration- sprogram (GUDP)（项目编号：34009-23-2129）的支持。此外，本研究还得到了丹麦技术大学（DTU）的资助。