基于CRISPR/Cas12a的三模式适配体传感器，用于超灵敏和多重检测微囊藻毒素-LR

《Biosensors and Bioelectronics》：CRISPR/Cas12a-powered tri-mode aptasensor for ultrasensitive and multiplexed detection of microcystin-LR

　　

张曦|张子伟|陈可可|张杰|吴峥|唐波|程永强

山东大学（青岛）环境科学与工程学院生态环境法医学研究所，中国山东省青岛市即墨区滨海路72号，266237

摘要

为了满足灵活的多场景分析需求并提高目标污染物的检测精度，迫切需要利用CRISPR/Cas12a驱动的多模式传感平台。本文开发了一种新型的CRISPR/Cas12a驱动的三模式适配体传感器，用于环境水中微囊藻毒素-LR（MC-LR）的超灵敏和多重检测。首先，通过基于适配体的竞争性置换反应实现了对目标物质的特异性识别及激活剂的释放。随后，在MC-LR存在下激活了Cas12a的切割活性，并使用荧光淬灭的单链DNA（FAM-ssDNA-BHQ1）和双功能探针（MBs-ssDNA-AuNPs-4MBA）作为信号报告分子进行三信号读取。在荧光模式下，采用了超灵敏数字液滴荧光系统。释放的激活剂DNA和Cas12a/crRNA复合物被共同封装到单分散纳米液滴中，这不仅加速了反应过程，还增强了局部荧光信号。该方法能够在35分钟内快速检测到MC-LR，检测限低至1.0 aM。对于SERS和比色模式，设计了一种新型双功能报告分子，通过磁分离实现拉曼和比色读数，将动态检测范围扩展到了1.0×10^-13 M至1.0×10^-6 M。所提出的三模式适配体传感器通过单一工作流程同时实现了MC-LR的痕量预警和高浓度检测，在实际样品中表现出良好的分析性能，回收率介于81.26%至113.21%之间（n = 3）。因此，这种CRISPR/Cas12a驱动的策略为不同水环境中的MC-LR监测提供了一种多功能工具。

引言

水生生态系统中富营养化的日益严重导致藻类大量繁殖（Lapointe等人，2024；Wejnerowski等人，2024）。在蓝细菌毒素中，微囊藻毒素（MCs）是最常见且分布最广的一类（Ma等人，2021；Teng等人，2024），通过皮肤接触和气溶胶吸入等多种途径对人类健康构成重大风险（Dos Santos等人，2019）。微囊藻毒素-LR（MC-LR）是最具毒性的成分（Li等人，2024；Suo等人，2021），研究表明在长期低剂量暴露下可诱导DNA氧化损伤并干扰关键癌基因和肿瘤抑制基因的表达，例如Ras激活和p53抑制（Wang等人，2025）。鉴于这些健康影响，国际癌症研究机构（IARC）（Chen等人，2018）将MC-LR归类为2B类潜在人类致癌物。相应地，世界卫生组织（WHO）建议饮用水中MC-LR的最大残留限为1 μg/L。鉴于其潜在的生物累积性，对环境水中MC-LR的早期预警和监测对于保护公众健康至关重要。

已经开发了多种MC-LR检测方法。每种方法虽然适用于特定的场景，但都有其独特的优势和固有的局限性。高效液相色谱（HPLC）（Xie等人，2007）和液相色谱-质谱（LC-MS）（Abdallah等人，2024；Yu等人，2023）等技术广泛用于准确的早期预警监测，但需要昂贵的仪器和高运营成本。此外，电化学、拉曼和比色方法也被用于大规模筛查（Abnous等人，2019；Wang等人，2024；Zeng等人，2025；Zhang等人，2024），但这些方法主要用于精确的实验室检测和确认分析（Pang等人，2020）。然而，大多数现有方法仅限于单模式检测。因此，需要一种适用于多种应用场景的多功能方法。

近年来，由于CRISPR/Cas12a的切割活性（Lei等人，2024；Shi等人，2021；Swarts等人，2019），它受到了广泛关注。这一特性使其从单纯的“基因剪刀”转变为强大的信号放大器，推动了基于CRISPR的诊断技术的快速发展。这一进步为超灵敏、快速和低成本的检测开辟了新途径。然而，要实现早期预警应用所需的高灵敏度仍是一个挑战。例如，尽管Kang等人（Kang等人，2022）将Cas12a与荧光探针结合提高了MC-LR检测的灵敏度和特异性，但其早期预警能力仍有改进空间。目前的高灵敏度策略通常依赖于将Cas12a与核酸扩增技术（如LAMP（Lee等人，2023；Pataer等人，2024）、RCA（Shen等人，2024；Wang等人，2023）或RAA（Li等人，2021；Xing等人，2023）结合使用，但这些方法受到缓冲液不兼容性和操作复杂性等问题的限制。为了解决这些限制，我们引入了一种新策略，将CRISPR/Cas12a与我们的团队之前开发的数字液滴荧光（dd荧光）检测方法相结合（Zhang等人，2023）。该方法将反应液分割成数万个微液滴，从而增强局部报告分子浓度，通过泊松分布实现绝对定量。

尽管数字液滴荧光技术的灵敏度显著提高，但其固有的狭窄检测范围限制了其实际应用（Liu等人，2025；Wei等人，2022）。为了解决这一挑战，我们将数字液滴荧光检测与互补的检测模式结合，以实现宽动态范围。最近，报道了几种多模式传感平台。例如，Cao等人（Cao等人，2023）开发了一种结合光电化学（PEC）、电致变色（EC）和光谱（ST）传感的三模式传感器，用于壬基酚的检测，线性范围为1-5000 μg/L。Wen等人（Wen等人，2023）描述了一种结合光致发光（PL）和共振光散射（RLS）的双模式平台，用于miRNA-141的检测，检测范围为10 fM至10 nM。Shao等人（Shao等人，2025）将荧光、比色和拉曼散射集成到一个生物传感器中，用于氧四环素（OTC）的检测，检测范围跨越五个数量级（0.1-10000 nM）。这些研究表明，多模式传感策略有效扩展了各种目标的检测范围。

在这项工作中，我们提出了一种基于CRISPR/Cas12a切割活性的三模式适配体传感器，结合了数字液滴荧光、比色和表面增强拉曼散射（SERS）。生物素化的适配体和激活剂链预先杂交成双链DNA（dsDNA），并固定在链霉亲和素修饰的磁珠（MBs-SA）上。在MC-LR存在下，适配体优先结合毒素，释放激活剂DNA到上清液中并激活Cas12a。激活的Cas12a切割报告分子1（FAM-ssDNA-BHQ1），后者被分割成单分散液滴进行数字荧光读数。同时，通过用MBs-ssDNA-AuNPs-4MBA（报告分子2）替换报告分子1，可以在宏观系统中进行比色和SERS检测。所提出的方法表现出高灵敏度和宽检测范围。

章节片段

材料和仪器

实验材料和仪器详见支持信息（文本S1）。

MBs-dsDNA的制备

MBs-dsDNA的制备详见支持信息（文本S2）。

MBs-ssDNA-AuNPs-4MBA的合成与表征

MBs-ssDNA-AuNPs-4MBA的合成与表征详见支持信息（文本S3）。

激活剂DNA的释放

将20 μL MBs-dsDNA与80 μL水样在38 °C下孵育2小时。磁分离后，收集含有释放的激活剂DNA的上清液进行后续检测。激活剂DNA包含

CRISPR/Cas12a驱动的三模式检测原理

CRISPR/Cas12a驱动的MC-LR三模式检测原理如图1所示。分析过程包括两个阶段：第一阶段是目标识别和激活剂DNA的释放，由基于适配体的竞争性置换反应介导；第二阶段是由CRISPR/Cas12a切割驱动的三模式信号读取。

为了特异性识别MC-LR，我们首先使用MC-LR特异性的生物素化适配体和激活剂DNA形成双链DNA（dsDNA）

结论

本研究提出了一种基于CRISPR/Cas12a的三模式应用传感器，可在多种场景中实现MC-LR的灵活检测。数字液滴荧光模式将反应限制在纳米液滴中，实现了1.0 aM的痕量预警检测限。通过结合基于新型双功能探针的SERS和比色模式，传感器将动态范围扩展到了七个数量级，使得单一工作流程能够同时处理痕量和高浓度检测

CRediT作者贡献声明

程永强：撰写 – 审稿与编辑，监督，研究，概念化

未引用参考文献

Koonin和Makarova，2019；Lee和Oh，2023；Swarts和Jinek，2019；Xie和Park，2007。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

感谢山东省重点研发计划（2024CXGC010916，2025CXGC010613）、青岛市自然科学基金（25-1-1-174-zyyd-jch）、山东大学和崂山实验室；自然资源部的渤海生态预警、保护和修复重点实验室计划（编号2023102）、中国自然科学基金（编号21207080）的财政支持。