转录因子保护技术实现了一种高度特异性和灵敏度的 Pb2+ 全细胞生物传感器

《Biosensors and Bioelectronics》：Transcription Factor Shielding Yields a Highly Specific and Sensitive Whole-Cell Biosensor for Pb2+ Detection

　　

沈亮|张宇博|苏俊涵|陈一文|吕有翔|肖翔|徐安|陈少鹏|鲍凌志

皖南医学院，芜湖 241002，中国

摘要

全细胞生物传感器（WCBs）为检测环境污染物提供了一个经济实用的平台。然而，在复杂样品中的性能往往因特异性受限而受到影响。特别是，铅离子（Pb²⁺）的检测经常受到化学性质相似的金属离子（如汞离子（Hg²⁺）的干扰，导致非特异性信号响应。在这项研究中，基于Klebsiella pneumoniae CG43的质粒pLVPK中的抗铅转录调控因子PbrR构建了野生型Pb²⁺ WCB。通过定向进化提高了WCB的敏感性，并随后实施了转录因子（TF）屏蔽策略以增强特异性。负/正荧光激活细胞分离（FACS）得到了突变体WCB PbrR-3，其检测限（LOD）为0.08 nM，但仍对Hg²⁺保持较高敏感性。为了减少Hg²⁺的干扰，将抗汞TF突变体MerR*引入生物传感器电路，并构建了一个核糖体结合位点（RBS）文库来调节MerR*的表达。筛选出的突变体表明MerR*的翻译起始效率与特异性之间存在潜在的正相关关系。优化的WCB RBSM480实现了0.03 nM的LOD，并提高了5倍的特异性。通过气相色谱-质谱联用技术（ICP-MS）验证了其对混合Pb²⁺/Hg²⁺实际样品的准确检测。这项工作提供了一种高性能的Pb²⁺ WCB，并 establish了一种TF屏蔽策略，作为提高WCB工程特异性的灵活方法。

引言

基于转录因子（TF）的全细胞生物传感器（WCBs）由于其模块化架构（Van Der Meer等人，2010年）、成本效益（Pardee等人，2014年）和实时监测能力（Nguyen等人，2021年），在工业生物技术、环境监测和临床诊断中具有广泛应用潜力。合成生物学技术和设计的最新进展进一步加速了这些WCB的发展，使得能够快速且高度敏感地检测典型环境污染物（Liu等人，2022a；Wang等人，2013年）。然而，同时实现高敏感性和强特异性仍然具有挑战性，尤其是对于具有相似配位化学性质的金属离子，如铅离子（Pb²⁺）和汞离子（Hg²⁺）。

野生型WCBs的有限敏感性和特异性激发了人们对其传感电路中关键遗传成分的优化努力（Chen等人，2025年；Lopreside等人，2019年；Wang等人，2011年）。此外，研究人员还通过定制信号处理和输出模块扩展了生物传感器的功能（Gao等人，2026年；Hicks等人，2020年）。这些改进使得能够在实际样品中检测到污染物（Li等人，2015a；Siegfried等人，2012年）。尽管有这些进展和WCBs公认的优势，但由于特异性不足以及缺乏便携式检测平台，生物传感器的实际应用仍然受到限制。在复杂样品中，不足的特异性往往导致测量结果不准确或不可靠。然而，大多数优化策略主要集中在提高敏感性上，而对特异性优化关注不够。目前关于特异性优化的研究主要集中在扩大WCBs可以检测的分析物范围上，包括那些通常不会引发反应的分析物（Liu等人，2022b；Roy等人，2021年）。相比之下，旨在减少交叉反应的研究相对较少。作为生物传感器识别和结合过程的核心组件，转录因子（TFs）已成为提高WCBs特异性的主要目标。尽管通过定向进化（Cai等人，2022年；Shen等人，2024年）或理性蛋白质设计（Mendoza等人，2020年；Tao等人，2013年）取得了进展，但这些方法主要通过增强对目标分析物的反应来提高相对特异性，并没有有效抑制对干扰物质的反应。重新设计宿主代谢网络或运输途径的替代策略可能在底物运输水平上减少干扰，但这些方法本身较为复杂，不适用于广泛的应用（Hernández-Sancho等人，2024年；Teng等人，2022年）。

鉴于WCB特异性的这些广泛限制，重金属检测提供了一个特别明显的挑战背景。Pb²⁺被认为是一种最严重的重金属污染物，主要是因为其广泛的工业用途和强的生物积累潜力（Rai等人，2019年；Sevak等人，2021年）。尽管通过优化传感电路中的遗传成分已经能够在实际样品中检测到Pb²⁺（Du等人，2019年；Hui等人，2021年），但特异性仍然是WCBs的主要瓶颈。当前的Pb²⁺ WCBs主要是基于抗铅转录调控因子PbrR构建的，该因子属于抗汞转录调控因子（MerR）家族（Chen等人，2007年）。由于MerR家族成员之间的结构高度相似，基于PbrR的Pb²⁺ WCBs通常会对镉离子（Cd²⁺）和Hg²⁺产生交叉反应，从而干扰检测。为了提高Pb²⁺ WCBs的特异性，研究人员采用了两种不同的定向进化策略来修改< />基因（Jia等人，2020年；Shen等人，2025年）。然而，这些努力仅实现了特异性的相对提高，并未能有效减少Pb²⁺ WCBs对干扰离子的反应。

在这项研究中，我们将定向进化与TF屏蔽策略相结合，以提高WCBs的性能。为了克服Pb²⁺ WCB对Hg²⁺的固有交叉反应，我们引入了一种抗汞TF突变体MerR*。通过核糖体结合位点（RBS）调节，获得了优化的WCB RBSM480，其检测限（LOD）较低，且特异性相对于野生型WCB有所提高。优化的WCB在实际样品分析中的测量结果与气相色谱-质谱联用技术（ICP-MS）结果一致，显示出强大的Pb²⁺监测潜力。因此，这项工作为构建高特异性WCB提供了新的设计范式，并可能推动其在不同领域的应用。

章节摘录

细菌菌株、生长条件及试剂

所有克隆程序均使用大肠杆菌 K-12菌株JudeI，并作为荧光生物传感器的骨架。大肠杆菌 BL21(DE3)用于蛋白质表达和纯化实验。细菌生物传感器在37°C、200 rpm条件下，在含有20 μg/mL卡那霉素（Sangon Biotech，上海，中国）的3 mL溶菌肉汤（LB）培养基中过夜培养，培养于无菌10 mL试管中。如先前所述（Shen等人，2025年），然后将1%的接种物转移至

Pb²⁺ WCB的定向进化

PbrR属于MerR转录调控因子家族，是介导细菌对Pb²⁺反应的最著名TF之一（Hui等人，2023年；Naik和Dubey 2013年）。来自Klebsiella pneumoniae CG43的质粒pLVPK的< />-kp基因（GenBank: AAR07820.1）被用于基于非耦合基因电路构建野生型Pb²⁺ WCB。如图S1所示，< />-kp基因的表达由 constitutive promoter J23109驱动

结论

设计了TF屏蔽策略，并将其与TF PbrR-kp的定向进化结合，构建了具有高敏感性和特异性的Pb²⁺ WCB。优化后的RBSM480 WCB的LOD为0.03 nM，比野生型WCB低28倍。通过减少对Hg²⁺的干扰响应，特异性提高了约5倍。优化后的WCB在实际样品中检测到的Pb²⁺浓度与ICP-MS获得的结果一致。此外，我们还进行了

CRediT作者贡献声明

鲍凌志：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取。沈亮：撰写——初稿、验证、方法学、调查、正式分析、数据管理。苏俊涵：调查。张宇博：验证、调查、正式分析、数据管理。陈一文：验证、方法学、调查。肖翔：资源获取、资金获取。吕有翔：调查。陈少鹏：撰写——审阅与编辑、监督、方法学。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了安徽省教育厅重大自然科学科研项目（2025AHGXZK20221）、安徽省教育厅自然科学科研项目（2023AH040241）以及国家自然科学基金（资助编号52470171）的支持。