《Current Opinion in Chemical Biology》：Always on the move: Mapping spatiotemporal interactome with proximity labeling in mammalian cells
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区室化是协调真核细胞中复杂生化过程的核心。调控细胞器功能和蛋白质组复杂性的蛋白质在细胞内和细胞间动态运输，以维持细胞稳态和通讯。邻近标记（Proximity labeling, PL）酶（如TurboID和APEX2）与质谱（Mass spectrometry
区室化是协调真核细胞中复杂生化过程的核心。调控细胞器功能和蛋白质组复杂性的蛋白质在细胞内和细胞间动态运输，以维持细胞稳态和通讯。邻近标记（Proximity labeling, PL）酶（如TurboID和APEX2）与质谱（Mass spectrometry, MS）联用，已成为捕获亚细胞蛋白质组快照的强大工具。然而，由于蛋白质运输是一个动态过程，这对当前技术提出了挑战，因为其时间分辨率有限。在这篇综述中，研究人员重点介绍了基于PL方法学的最新进展，包括正交PL酶（TransitID和OrthoID）以及与PL结合的蛋白质同步策略（POTATOMap）。这些新方法共同使得研究细胞器之间动态的细胞内蛋白质运输以及细胞间通讯成为可能。
引言
区室化是真核细胞的一个决定性特征，通过将胞内空间分隔成膜结合和无膜细胞器来实现。这种空间组织使得许多至关重要的生化过程能够在时空调控下在细胞器内部和之间进行。细胞器功能的核心在于构成这些区室的独特蛋白质组。蛋白质在细胞内和细胞间的高度活跃运输，形成了一个高度连接的细胞内网络，其中细胞器通过交流和交换信号来协调细胞功能。然而，以足够的空间和时间分辨率捕获动态的互作组仍然是细胞生物学中的一个主要挑战。
邻近标记酶结合质谱已成为以高空间精度绘制蛋白质互作组的有力工具。TurboID和APEX2等混杂酶，能够在特定亚细胞区室中标记目标蛋白附近的蛋白质。虽然这些PL方法成功地拓宽了我们对细胞器蛋白质组和先前难以捕获的瞬时相互作用的理解，但它们在解析动态事件方面的能力有限，因为它们通常只涉及每个生物样本中互作组的快照，无法轻易区分在不同区室之间动态穿梭的蛋白质。
利用TransitID和OrthoID绘制动态蛋白质组
蛋白质运输是一个高度动态的过程，其中不同的目标蛋白（POI）从不同的来源被运输到特定的目的地。现有的方法，如亚细胞分级分离、免疫亲和纯化或PL与质谱联用，已成功用于研究不同的细胞器蛋白质组。然而，这些方法难以提供在多个细胞器间瞬时穿梭的POI的时间信息。为了精确定位动态运输蛋白的时间分辨互作组，Qin等人于2023年提出了名为“通过顺序掺入标签进行识别的运输分析”的方法，即TransitID。该系统利用正交PL酶TurboID和APEX2的复用能力，在同一细胞内或跨细胞使用脉冲追踪原理产生串联反应。
由于APEX2相较于TurboID具有更广泛的底物灵活性，作者开发并测试了不同的炔基酚（AP）底物作为生物素酚（BP）的替代品用于APEX2，并得出结论，AP底物由于比BP具有更好的膜渗透性，因此显示出更高的标记效率。此外，AP能够通过点击化学使用和偶联叠氮荧光素，用于随后的可视化和抗荧光素分离。这种创新方法为研究蛋白质动力学开辟了新途径，因为它能够在不同时间段进行脉冲追踪。由TurboID在源位置催化的第一次标记之后，可以根据研究问题和蛋白质互作组的半衰期进行不同时间的追踪期。由APEX2在目的地催化的第二次标记，有助于识别从源互作组出发、因生物素和点击到烯烃手柄上的荧光素双重标记而转运到目的地的蛋白质。
由于其脉冲追踪能力，TransitID成为研究细胞器间复杂细胞内信号传导以及细胞间通讯的理想方法，具有高时空分辨率。TransitID已被用于研究不同细胞背景下的蛋白质运输，包括核编码的线粒体蛋白质的本地翻译和易位、亚砷酸盐胁迫下的核质蛋白质穿梭、应激颗粒形成和解聚的动态过程，以及探究肿瘤细胞胞质中的蛋白质如何穿梭到巨噬细胞的细胞内信号传导。
2024年，Lee等人提出了另一种名为OrthoID的方法。与TransitID类似，OrthoID使用正交PL酶TurboID和APEX2标记在不同的细胞器上。作者探索了APEX2介导的邻近标记在一种不同的酚类共轭底物金刚烷（Ad）上的使用。Ad标记的蛋白质可以通过其合成宿主分子葫芦[7]脲（CB[7]）进行可视化和分离。除了标记底物的不同，OrthoID在样品处理程序上也有所不同。Lee等人采用了SPOT-ID方案，其中只有标记的肽段（由APEX2标记酪氨酸的Ad和由TurboID标记赖氨酸的Bt）被富集。分析蛋白质的哪个氨基酸序列被标记和富集，使作者能够了解互作组中POI的拓扑结构。
OrthoID已被用于研究狭窄的膜接触位点处的细胞内通讯。膜接触位点是细胞器之间的直接接触，通常在10-30纳米范围内，这落在TurboID和APEX2的标记半径内，可能在标记的MCS蛋白质组中引入假阳性和交叉污染。借助其复用能力和改进的SPOT-ID方案，Lee等人以比用于研究MCS的单一或分裂PL酶方法更高的拓扑精度绘制了内质网和线粒体之间的互作组。
TransitID和OrthoID之间的相似性表明，也许这两种技术可以根据感兴趣的研究问题互换使用。OrthoID方案在理解所绘制互作组内的动态定位和结构变化方面表现出色，而TransitID的脉冲追踪选项则为发生在较长时间尺度上的细胞过程提供了更好的时间分辨率。
使用POTATOMap绘制生物合成跨膜蛋白互作组
跨膜和管腔/细胞外蛋白质，占蛋白质组的四分之一以上，通常从生物合成/分泌途径分选到不同的区室。该途径包括内质网、高尔基体和许多不同的分选囊泡，形成了一个协调细胞内信号传导和细胞间通讯的复杂且高度动态的囊泡运输系统。生物合成/分泌途径或内体-溶酶体系统的扰动通常与病理状况相关，促使人们对这些动态过程的组成和分子机制进行深入研究。值得注意的是，亚细胞分级分离和体外重构实验为生物合成/分泌蛋白质组的组成提供了关键见解，而显微镜研究则展示了这些过程的动态行为。然而，研究一个活跃产生并沿此途径运输的POI的互作组仍然是一个挑战，原因主要有两个：第一，当POI被主动运输时，它可以同时存在于多个细胞器；第二，这些蛋白质的新合成池通常难以从内质网起源处检测到。
为了系统地研究新合成的跨膜蛋白运输互作组，Li等人引入了名为“蛋白质起源、运输及靶向细胞器图谱”的方法，即POTATOMap。虽然TransitID和OrthoID专注于标记在两个细胞器之间动态转运的蛋白质，但POTATOMap通过绘制一个POI在穿越生物合成途径到达其目的地过程中的动态变化互作组，解决了一个互补的挑战。为此，POTATOMap实施了“选择性挂钩滞留”系统，以同步新合成的跨膜蛋白的生物合成池。该系统需要表达一个内质网滞留钩，通常是与内质网滞留序列融合的链霉亲和素，以及一个带有链霉亲和素结合肽和APEX2的POI的表达，具体取决于蛋白质拓扑结构。在没有生物素的情况下，SBP以高亲和力与链霉亲和素结合，从而将POI滞留在内质网。添加生物素后，这些POI可以同步地从内质网释放，向高尔基体移动，并在反式高尔基体网络处进入运输囊泡前往目的地。与质谱联用，POTATOMap可以在蛋白质穿越不同区室的特定时间点捕获POI邻近互作组的快照。
Li等人应用POTATOMap研究了新合成的溶酶体膜蛋白如何从内质网运输到溶酶体。稳态下的溶酶体蛋白在内体-溶酶体系统中最为丰富。POTATOMap可以同步释放一批新合成的LAMP1从内质网释放，并追踪其互作组随时间的变化，因为该蛋白质在生物合成途径中进展并进入内体-溶酶体系统。基于他们的POTATOMap数据，作者研究了生物合成LAMP1囊泡区室的性质、其运输机制以及溶酶体功能之外的潜在作用，例如促进RNA颗粒运输。
POTATOMap还可用于系统地研究任何细胞类型中，从内质网起源到目的地的一般生物合成跨膜蛋白互作组。例如，POTATOMap能够比较轴突和树突蛋白质的互作组，以阐明这些新合成的极化蛋白质在神经元中健康和病理条件下的运输路径差异。它也可以用来研究MHC-II在运输、输出和再循环过程中的互作组。也有可能修改和调整POTATOMap来研究生物合成蛋白池之外的生物学问题。例如，通过创建一个“侧向敲除”系统，将POI滞留到任何特定的细胞器，并追踪其在释放前、释放期间和释放后（蛋白质易位回其目的地时）的互作组。
随着PL技术的发展，POTATOMap可以采用不同的PL方法学。例如，POTATOMap可以使用蓝光调控的LOV结构域封装的TurboID代替APEX2，因为该酶在没有光的情况下不会主动生物素化附近的蛋白质，即使添加了生物素来释放内质网中的POI。此外，POTATOMap也可以采用TransitID和OrthoID的原理，使用正交PL酶来解决更复杂的运输问题。例如，用RUSH和LOV-Turbo标记一个生物合成的突触囊泡蛋白，并用APEX2标记稳态下的突触胞吐融合机制，可能使研究人员能够了解新合成的突触囊泡蛋白在其生命周期中（从合成、运输到胞吐和再循环）的互作组。类似的设置可用于研究细胞外囊泡在生物发生、分泌和被其他细胞摄取过程中的互作组。
局限性
尽管这些技术进步为研究动态蛋白质运输互作组开启了新的可能性，但仍存在一些需要注意的局限性。TurboID本质上需要比APEX更长的生物素标记时间，这限制了时间分辨率。对生物素的依赖可能存在问题，因为某些培养基配方或活体动物组织通常含有高浓度的生物素，会产生背景标记，从而掩盖所分析的POI互作组。TurboID对ATP的依赖也限制了其在ATP供应有限的细胞外或代谢不活跃环境中的使用。另一方面，APEX2需要外源添加H2O2来激活过氧化物酶，这会引起毒性，限制了其在动物系统中的应用。
除了使用这些PL酶的缺点外，TransitID、OrthoID和POTATOMap也存在技术上的局限性。例如，TransitID和OrthoID的灵敏度受限于两种酶在不同区室中的标记效率，这决定了它们精确定位在不同位置间穿梭的蛋白质多样性以及构象变化的能力。用PL酶标签外源表达POI需要仔细表征以避免假象，而内源的双重PL标记POI可能具有挑战性，如果丰度不够则灵敏度较低。就POTATOMap而言，由于需要外源表达POI和挂钩，它仅限于体外应用。必须控制POI的外源表达以避免错误定位。虽然用POTATOMap对内源POI进行标记似乎是更好的选择，但它可能会造成敲除效应，特别是对于生物合成蛋白，因为POI被滞留在内质网中。由于POTATOMap使用生物素释放POI，为了达到最佳滞留效果，培养基必须不含生物素。
结论与未来展望
邻近标记酶与质谱联用，使得能够以高空间精度对广泛生物过程中的蛋白质互作组进行定量和定性分析。TransitID、OrthoID和POTATOMap的引入，代表了超越单一细胞器蛋白质组绘图、转向跨越空间和时间的生物过程动态视图的新一波方法学。通过利用正交标记化学、蛋白质同步和改进的肽段富集策略，这些方法为绘制动态蛋白质相互作用、生物合成蛋白质运输以及细胞器间和细胞间通讯等悬而未决的问题提供了新的视角和互补的解决方案。
随着技术的快速涌现和进步，下一代PL酶、标记化学以及潜在的基于合成光催化剂的PL方法将进一步扩展这些动态互作组绘图技术的能力。例如，Sroka等人开发了原位APEX激活工作流程，使用D-氨基酸氧化酶局部产生H2O2来激活APEX2，从而在体外和体内的紧凑环境（如纤毛）中实现了更好的标记精度和更少的背景生物素化。对光调控PL酶和绕过HO2需求的氧依赖性酶的持续创新，将极大地提高这些工具在更具挑战性系统中的生物相容性。例如，最近开发的基于酪氨酸酶的TyroID和基于漆酶的LaccID，可以潜在地绕过APEX2的使用，这两种酶都利用氧气而不是H2O2。尽管这些都是对过氧化物酶PL酶的极好补充和替代，但这些方法在解决某些研究问题时可能会面临限制。例如，LaccID仅在细胞表面有活性，因此TransitID、OrthoID和POTATOMap的替代版本可能仅限于质膜上发生的细胞间过程。总而言之，这些技术在未来将解锁的进步和新研究令人期待。随着PL方法学的不断发展，它们为以动态视角重新审视长期存在的问题提供了令人兴奋的机会，其空间和时间分辨率也在不断精进。
