整合的单细胞RNA测序和多数据库分析表明，THBS2会促进糖尿病肾病中高葡萄糖诱导的肾小球系膜细胞氧化应激和纤维化

《Electronic Journal of Biotechnology》：Integrated single-cell RNA sequencing and multi-database analysis reveal THBS2 promotes high glucose-induced mesangial cell oxidative stress and fibrosis in diabetic nephropathy

　　林雷|郭静霞|王欣|刘敏|刘晨曦
中国河北省石家庄市石家庄人民医院内分泌科

**摘要**
背景：单细胞RNA测序（scRNA-seq）为许多疾病的研究提供了前所未有的分辨率，包括糖尿病肾病（DN）。然而，调控DN中肾小球细胞氧化应激和纤维化的有效基因仍有待揭示。本研究利用scRNA-seq和多数据库分析，确定了血栓调节蛋白2（THBS2）是调控DN进展的关键基因。

**结果**
从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库（GSE209781）中，scRNA-seq共鉴定出6种重要的糖尿病肾病（DKD）细胞类型。GO和KEGG分析显示，DKD中肾小球细胞的差异基因具有多功能和多途径调控作用。通过结合scRNA-seq（与肾小球细胞相关的基因）、GEO数据库（GSE1009）和GeneCards数据库（与氧化应激和肾纤维化相关的基因），筛选出4个目标基因（ITGB1、THBS2、TIMP1和COL18A1）。THBS2在高葡萄糖（HG）诱导的肾小球细胞中过表达，其敲低可抑制HG诱导的肾小球细胞氧化应激和纤维化。

**结论**
基于scRNA-seq、多数据库分析和实验验证，本研究表明THBS2可能促进DN中HG诱导的肾小球细胞氧化应激和纤维化。

**1. 引言**
糖尿病肾病（DN）是糖尿病最严重的微血管并发症，占终末期肾病的40% [1] [2]。间歇性蛋白尿是DN早期的唯一临床表现，后期可能出现水肿、高血压和肾功能不全 [3] [4]。肾小球细胞对维持肾脏的肾小球完整性至关重要，其功能障碍可导致DN进展 [5]。尽管已知高葡萄糖诱导的氧化应激和纤维化是DN进展的核心机制 [6]，但介导肾小球细胞病理转化的关键调控因子尚未完全阐明。目前的临床干预措施只能延缓疾病进展而不能阻止其发生 [7]，这突显了寻找新的分子靶点的迫切需求。单细胞RNA测序（scRNA-seq）通过分析单个细胞的基因表达谱，为疾病研究提供了前所未有的分辨率，已成为疾病机制研究和临床转化的革命性工具 [8] [9]。近年来，scRNA-seq技术揭示了DN中肾细胞的异质性 [10] [11]，但关于肾小球细胞特定分子事件的研究仍不足。本研究通过scRNA-seq分析鉴定了糖尿病肾病（DKD）样本中的关键细胞类型和基因。随后以肾小球细胞为研究对象，结合scRNA-seq、GEO数据库和GeneCards数据库的结果，筛选出关键基因血栓调节蛋白2（THBS2）。先前的研究表明THBS2在DN患者肾样本中上调，其表达与肾功能指标呈负相关 [12]。然而，THBS2是否通过调控高葡萄糖（HG）下的肾小球细胞氧化应激和炎症来介导DN进展尚不清楚，这是本研究的关键科学问题。

**2. 材料与方法**
2.1. 单细胞转录组数据准备和质量控制
scRNA-seq数据从Gene Expression Omnibus（GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）数据库（访问号：GSE209781）下载，包含3例DKD患者和3例正常（NM）样本（132013个细胞和27707个基因）。根据以下标准对scRNA-seq数据进行质量控制：基因特征数量、细胞数量计数和线粒体测序百分比；过滤掉基因数量少于200个或被少于3个细胞覆盖的基因；过滤掉表达基因数量少于200个或超过6000个、总UMI数量少于20000个或线粒体基因占比超过20%的细胞。质量控制后得到40438个高质量细胞和26026个基因（图1A）。然后使用R包Seurat中的“NormalizeData”函数对数据进行标准化处理。
2.2. 细胞异质性分析
使用Uniform Manifold Approximation and Projection（UMAP）算法进行聚类分析，以揭示单细胞数据集中的细胞异质性。具体而言，使用Seurat包中的FindNeighbors函数构建细胞间关联网络，随后使用FindClusters函数进行无监督聚类分析。在聚类参数设置中，选择分辨率参数为0.2，并将前15个主成分（PC1-PC15）作为输入维度。RunUMAP函数生成的二维可视化图清晰显示了细胞群体的分布特征，最终成功识别出13个具有独特转录特征的细胞亚群。使用R包“Seurat”中的“FindAllmarker”函数（阈值：logfc.threshold=0.25，min.pct=0.25，only.pos=TRUE）识别每个细胞亚群中特异性高表达的基因。
2.3. 细胞类型鉴定
根据先前描述的方法 [13] [14]，基于标记基因和TOP高表达基因对注释的细胞亚群进行细胞类型鉴定。细胞亚群可分为近端小管（PCT）、亨勒环（LOH）细胞、免疫细胞（IMC）、内皮细胞（ENDO）、肾小球细胞（MES）和集合管主细胞（CD-PC）。使用UMAP对鉴定后的细胞类型进行可视化，并在图中显示每个细胞亚群中用于鉴定的标记基因的表达情况。
2.4. 筛选差异细胞类型和基因
使用Wilcoxon秩和检验比较DKD组和NM组之间细胞类型的比例差异，p < 0.05的细胞被视为差异细胞。使用FindMarkers函数计算DKD样本和NM样本之间的差异表达基因（min.pct=0.1，logfc.threshold=0.25，test.use=“wilcox”）。使用火山图和热图显示MES中的差异表达基因，并根据p值在图中标注上调和下调的前10个基因。
2.5. GO和KEGG分析
将MES的差异基因导入Sangerbox进行GO/KEGG富集分析。富集方法为Benjamini-Hochberg，筛选条件为FDR < 0.1和p值 < 0.05 [15] [16]。根据p值顺序显示生物过程（BP）/细胞组分（CC）/分子功能（MF）的前10个结果，KEGG显示前20个结果。
2.6. 目标基因筛选
使用Genecards数据库筛选与氧化应激和肾纤维化相关的基因。选择与氧化应激相关的基因（Protein Coding，相关分数 > 1.514761508（中位数）；选择与肾纤维化相关的基因（Protein Coding，相关分数 > 2.777264595（中位数））。分析GEO数据库（访问号：GSE1009，包含3个正常样本和3个DN样本），筛选条件为p < 0.01和FC > 1.2。MES中的差异表达基因（1338个基因）与GSE1009（776个基因）、氧化应激相关基因（6470个基因）和肾纤维化相关基因（3947个基因）进行混合，共24个交集基因导入Cytoscape进行PPI可视化（字体大小和颜色根据度值排列）。使用cytohubba插件中的MCC算法选择前10个基因，使用MCODE插件进一步筛选出4个基因。通过Venn图分析的交集基因为ITGB1、THBS2、TIMP1和COL18A1。
2.7. 细胞培养、处理和转染
将人肾小球细胞（CP-H067，Procell，武汉）在特定培养基（CM-H067，Procell）中于37°C和5% CO2条件下培养。细胞用高葡萄糖（HG，30 mM D-葡萄糖，Sigma-Aldrich，美国圣路易斯）处理24小时以诱导DN细胞模型，以正常葡萄糖（NG，5.5 mM D-葡萄糖）或等渗甘露醇（MNT，25 mM甘露醇+5 mM葡萄糖）作为对照。使用Lipofectamine 3000（Invitrogen，美国卡尔斯巴德）转染针对THBS2的shRNA（shTHBS2：5’-CCGGCCCTCCTAAGACAAGGAACATCTCGAGATGTTCCTTGTCTTAGGAGGGTTTTTG-3’）及其阴性对照（shNC：5’-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTAACTCGAGTTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG-3’），随后用HG处理24小时。
2.8. qRT-PCR
使用TRIzol试剂（Invitrogen）从肾小球细胞中提取总RNA，并使用cDNA Synthesis Kit（Beyotime，上海）合成cDNA。然后使用SYBR Premix Ex TaqTM Kit（TaKaRa，大连）和以下特异性引物进行qRT-PCR：TIMP1，F 5’-CTTCTGCAATTCCGACCTCGT-3’，R 5’-ACGCTGGTATAAGGTGGTCTG-3’；COL18A1，F 5’-CAGTGGACACACTTAGCCCTC-3’，R 5’-GCGGCATTCTCTGGAACTCC-3’；ITGB1，F 5’-CCTACTTCTGCACGATGTG-3’，R 5’-CCTTTGCTACGGTTGGTTACATT-3’；THBS2，F 5’-ATCACACGCATCCGTCTCTG-3’，R 5’-AAACAGCCATTTGGGCATGG-3’；β-actin，F 5’-TCACAATGTGGCCGAGGAC-3’，R 5’-TGGGGTGGCTTTTAGGATGG-3’。通过2-ΔΔCt方法测定TIMP1/COL18A1/ITGB1/THBS2 mRNA的表达量。
2.9. Western blot（WB）
使用RIPA缓冲液分离总蛋白，通过SDS-PAGE凝胶分离后转移至PVDF膜上。膜经封闭处理后，分别与抗-THBS2（1:1000，ab89805，Abcam，美国马萨诸塞州剑桥）、抗-COL-IV（1:1000，30850-1-AP，Proteintech，武汉）或抗-β-actin（1:50000，66009-1-Ig，Proteintech）孵育。孵育后使用ECL试剂（Beyotime）检测蛋白条带。
2.10. CCK8测定
将肾小球细胞重新接种到96孔板中，并用CCK8试剂孵育。在每个时间点（0、24、48和72小时）使用微孔读数仪测量OD值以评估细胞活力。
2.11. 氧化应激检测
根据制造商说明，使用SOD Assay Kit（S0101S，Beyotime）、MDA Assay Kit（S0131S，Beyotime）和ROS Assay Kit（S0033S，Beyotime）测定肾小球细胞中的SOD活性、MDA水平和ROS水平。SOD和MDA水平在微孔读数仪下测量。ROS水平通过流式细胞术测量DCFH-DA荧光来分析。
2.12. 统计分析
所有实验重复三次，每个独立实验设置三次以获得平均值。数据使用GraphPad Prism 8.0软件进行分析，并以平均值±标准差表示。组间差异使用Student’s t检验或单因素方差分析（ANOVA）进行比较，随后进行Tukey事后检验。p < 0.05视为显著。

**3. 结果**
3.1. 通过scRNA-seq筛选差异细胞和标记基因
首先，使用基因特征数量、细胞数量计数和线粒体测序百分比从GEO数据库（GSE209781）的scRNA-seq中筛选出高质量细胞和基因，得到40438个细胞和26026个基因（图1A）。UMAP算法的聚类分析识别出13个具有独特转录特征的细胞亚群（图1B）。然后根据标记基因和先前研究中的TOP高表达基因对细胞亚群进行注释。结果表明，这些细胞亚群可分为6种类型：PCT、LOH、IMC、ENDO、MES和CD-PC（图1C）。3个DKD样本和3个NM样本中每种细胞类型的数量分别显示在图1D中，每种细胞类型在样本中的数量和比例显示在图1E中。此外，图1F显示了6种细胞类型中标记基因的表达情况。进一步分析显示，DKD组和正常组中MES细胞的数量（68、274、51 vs 26、640、627）和比例（2.52%、3.59%、1.21% vs 0.42%、6.77%、18.54%）无显著差异（图S1）。

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**图1. scRNA-seq筛选出差异细胞和标记基因。**
(A) 根据基因特征数量、细胞数量计数和线粒体测序百分比筛选高质量细胞和基因。
(B) 使用UMAP算法进行聚类分析，识别出13个细胞亚群。
(C) 根据标记基因和TOP高表达基因对细胞亚群进行注释。
(D) 3个DKD样本和3个NM样本中每种细胞类型的数量。
(E) 3个DKD样本和3个正常样本中每种细胞类型的数量和比例。
(F) 6种细胞类型中标记基因的表达情况。

**3.2. 通过GO/KEGG筛选和分析差异基因**
根据糖尿病的病理特征，选择肾小球细胞进行分析。火山图和热图显示了肾小球细胞中的差异表达基因，根据p值显示上调和下调的前10个基因（图2A-B）。GO和KEGG分析用于研究差异基因的功能。GO分析显示主要生物过程为mRNA分解过程和RNA分解过程；主要细胞组分为细胞外器官和含蛋白复合物；主要分子功能为结构分子活性和RNA结合（图3A）。KEGG通路分析表明，差异基因参与了多个重要信号通路，包括核糖体、帕金森病、氧化磷酸化和产热（图3B）。

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**图2. 筛选DN的差异基因。**
差异表达基因（上调或下调的前10个）以火山图（A）和热图（B）显示。

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**图3.**GO和KEGG分析。通过GO分析（A）和KEGG分析（B）研究了肾小球细胞中差异基因的功能。3.3. 使用DNGeneCards获取关键靶标，以筛选与氧化应激（6470个基因）和肾纤维化（3947个基因）相关的基因，然后将上述基因与肾小球细胞差异基因（1338个基因）和GEO数据库差异基因（778个基因）进行混合。共获得了24个交集基因（图4A）。随后，将这24个交集基因导入Cytoscape软件中进行蛋白质相互作用（PPI）可视化（图4B）。根据MCC（模块间相关性系数）排名，前10个基因是THBS2、TIMP1、TJP1、UMOD、COL18A1、F2R、HSP90AA1、ITGB1、KNG1和MYH9。根据MCODE评分，共筛选出4个枢纽基因，包括THBS2、TIMP1、COL18A1和ITGB1（图4C）。MCC和MCODE筛选出的基因交集显示在图4D中。为了进一步确定关键靶标，我们的研究在HG（高糖）诱导的肾小球细胞模型中对4个候选基因进行了初步的qRT-PCR验证。结果显示，这4个基因在HG条件下均显著上调，其中THBS2上调最为明显（图S2）。鉴于关于THBS2的报道较少且其在DN（糖尿病肾病）中的机制研究潜力未知，选择THBS2进行后续的深入功能和机制研究。下载：下载高分辨率图像（507KB）下载：下载全尺寸图像图4. 筛选出了DN的关键靶标。（A）使用Venn图从氧化应激相关基因（6470个）、肾纤维化相关基因（3947个）、肾小球细胞差异基因（1338个）和GEO数据库差异基因（778个）中筛选出24个交集基因。（B）使用Cytoscape软件可视化了24个交集基因的PPI网络。（C）根据MCC筛选出前10个基因，根据MCODE评分筛选出前4个基因。（D）使用Venn图获得了MCC和MCODE共同筛选出的关键靶标。3.4. THBS2敲低减少了HG诱导的肾小球细胞中的氧化应激和纤维化为了确认THBS2在DN中的作用，进行了功能实验。GSE1009数据库显示，3名DN患者的肾小球中THBS2表达上调（图5A）。在细胞实验中设置了NG组、MNT组和HG组。CCK8检测显示，HG组的细胞活力显著高于NG组和MNT组，而NG组和MNT组之间没有显著差异（图S3）。因此，在后续实验中不再设置甘露醇对照组。通过qRT-PCR确认，THBS2在HG诱导的肾小球细胞中过表达（图5B）。随后构建了shTHBS2，WB结果证实shTHBS2转染能够显著降低肾小球细胞中的THBS2蛋白表达（图S4A-B）。然后，将shTHBS2转染到肾小球细胞中并诱导HG。检测THBS2蛋白水平证实shTHBS2能有效抑制HG诱导的肾小球细胞中的THBS2表达（图5C-D）。HG处理降低了肾小球细胞中的SOD活性并促进了MDA水平，而THBS2敲低逆转了这些效应（图5E）。此外，THBS2沉默显著降低了肾小球细胞中的COL-IV和α-SMA蛋白水平（图5F-G）。另外，HG条件下ROS水平显著升高，而THBS2敲低可以逆转这一现象（图5H）。上述数据表明THBS2可能参与了HG诱导的肾小球细胞氧化应激和纤维化，从而促进DN进展。下载：下载高分辨率图像（670KB）下载：下载全尺寸图像图5. shTHBS2对HG诱导的肾小球细胞中氧化应激和纤维化的影响。（A）GSE1009数据库分析了3名DN患者和3名正常对照者的肾小球中THBS2的表达。（B）通过qRT-PCR检测用NG或HG处理的肾小球细胞中的THBS2 mRNA表达（n=3）。（C-H）肾小球细胞分为4组，包括NG组、HG组、HG+shNC组和HG+shTHBS2组（n=3）。（C-D）使用WB检测每组中的THBS2蛋白表达。（E）使用相应试剂盒检测每组中的SOD活性和MDA水平。（F-G）使用WB检测每组中的COL-IV和α-SMA蛋白水平。（H）使用DCFH-DA探针通过流式细胞术检测每组中的ROS水平。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。4. 讨论DN的进展是复杂的，涉及多种细胞和分子机制，其中肾小球细胞在DN的发生和发展中起着核心作用[17]。肾小球细胞是肾小球的特化间质细胞，在HG条件下可能释放炎症因子、产生ROS，导致DNA损伤和细胞凋亡，从而促进DN进展[18]、[19]。因此，阐明影响肾小球细胞的关键基因可以提供对DN发病机制的见解。在本研究中，scRNA-seq结合多数据库分析确定了THBS2是肾小球细胞中的一个重要基因，它促进了HG诱导的肾小球细胞氧化应激和纤维化，加速了DN进展，这是一个新的发现。scRNA-seq技术彻底改变了疾病相关细胞和基因的预测，能够解析细胞异质性，准确识别疾病相关细胞亚群，并通过比较疾病细胞和正常细胞的转录组来靶向关键基因和通路[20]、[21]。因此，scRNA-seq是通过分析细胞和分子水平的疾病特征，进行机制研究、早期诊断和精准治疗的不可替代工具[22]、[23]、[24]、[25]。在本研究中，使用scRNA-seq分析了DKD（糖尿病肾病）和NM（肾硬化）样本中的关键细胞和基因，识别出6种重要细胞类型（PCT、LOH、IMC、ENDO、MES和CD-PC）。结合先前的报道，注释了每种细胞类型中标记基因的表达。鉴于肾小球细胞在DN进展中的重要作用，本研究分析了肾小球细胞中的差异基因。进一步分析显示，mRNA分解过程和RNA分解过程是肾小球细胞差异基因中主要的生物学过程；细胞外器官和含蛋白复合物是主要的细胞成分；结构分子活性和RNA结合是主要的分子功能。此外，本研究还表明核糖体、帕金森病、氧化磷酸化和热生成是参与肾小球细胞差异基因的重要信号通路。上述结果表明，肾小球细胞中的差异基因可能通过多种通路在DN中发挥重要作用。THBS2是一种具有弹性蛋白结构域的细胞外基质糖蛋白，在调节许多生物过程中起着关键作用[2]、[27]、[28]。分析显示，THBS2基因可增加2型糖尿病患者的DN易感性[29]。重要的是，THBS2被认为是在纤维化中表达改变的潜在重要基因[30]。已有研究表明，THBS2沉默可以抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞样细胞的炎症、氧化应激和纤维化[31]。在DN相关研究中，Li等人[12]确认了DN样本中THBS2表达升高，并报告THBS2可能是DN的潜在诊断标志物。此外，THBS2可以促进DN进展，抑制HG诱导的肾小管细胞增殖并促进细胞凋亡[32]。上述数据证实了THBS2在DN过程中的重要作用。通过结合scRNA-seq、GEO数据库和Genecards数据库，确定THBS2是调节DN过程的重要基因。功能丧失研究表明，THBS2在HG诱导的肾小球细胞中确实表达增加，其下调抑制了HG诱导的肾小球细胞氧化应激和纤维化。这些结果支持THBS2促进HG诱导的肾小球细胞损伤，加速DN进展的假设。尽管Li等人[12]在多组学水平上建立了THBS2与DN之间的关联，但他们的分析基于全局组织，无法解析细胞类型特异性机制。通过使用scRNA-seq，本研究首次系统地揭示了THBS2在单细胞水平上驱动肾小球细胞氧化应激和纤维化的直接作用，并进行了相应的体外功能验证。这为THBS2的细胞类型特异性功能提供了新的实验证据，也为针对肾小球细胞的靶向干预策略的发展提供了更精细的依据。当然，也存在局限性。我们的工作确认了THBS2的功能表型，并通过GO/KEGG分析确定了“氧化磷酸化”和“核糖体”通路，但THBS2的上游调控和下游通路（如氧化磷酸化）的细节尚未解决。作为下一步，将对THBS2敲低后的肾小球细胞进行RNA-seq分析，系统地筛选THBS2敲低后调控的下游靶基因和信号通路。此外，还计划进行Co-IP和通路拯救实验以验证关键相互作用和功能通路。结合现有的研究基础，TGF-β/Smad、PI3K/AKT等通路可能参与THBS2的调控，其对ROS生成的影响以及与COL-IV和α-SMA的直接/间接关联也需要进一步验证。在纤维化表型方面，本研究仅检测了COL-IV和α-SMA，这是不充分的。本研究计划在后续细胞实验中使用免疫荧光技术更全面地表征HG诱导的肾小球细胞纤维化。此外，同时检测和观察了COL-IV、α-SMA和纤维连接蛋白（FN）等关键纤维化成分的表达和细胞内定位变化，以便更直观和多维度地验证THBS2在纤维化中的作用。此外，由于我们的分析重点在于识别静态的HG相关差异靶标，因此采用了差异基因分析策略。然而，这未能揭示疾病进展过程中THBS2变化的动态模式。未来，进行伪时间或轨迹分析以推断DN进展过程中的动态遗传变化可能会为我们提供进一步的分析视角。验证THBS2在人体组织中的定位将非常重要。然而，由于获取配对的高质量人类DN肾组织切片的实际困难，本研究未进行临床样本验证。未来，本研究计划补充THBS2在临床组织中的qRT-PCR/WB/免疫组化（IHC）验证，以提供最直接的临床病理学证据。此外，本研究旨在筛选和验证与DN相关的关键基因，因此未涉及THBS2抑制剂的筛选。在明确THBS2的致病作用后，我们的计划是进行靶向研究：使用PharmMapper等数据库预测潜在的小分子化合物，并通过细胞和动物模型验证它们的功能和有效性，以促进其临床转化。本研究的目的是评估系统性地敲低THBS2表达是否可以改善STZ诱导的糖尿病小鼠模型中的糖尿病肾病病理（例如，尿蛋白、肾小球硬化、胶原沉积等）。这种体内验证是未来机制和转化研究的重点。总之，本研究通过整合scRNA-seq和多数据库分析，确定了THBS2作为DN肾小球细胞中氧化应激和纤维化的新型介质。这些数据表明，靶向THBS2可能为缓解DN进展提供一种有前景的治疗策略。资金支持本研究未获得公共、商业或非营利部门的任何特定资助。数据可用性声明当前研究中使用和分析的数据集可应要求向相应作者索取。未引用的参考文献[26]。CRedI作者贡献声明Lin Lei：撰写——原始草稿、验证、资源、项目管理、正式分析、概念化。Jingxia Guo：项目管理、方法学、正式分析。Xin Wang：监督、资源、方法学、调查。Min Liu：验证、监督、软件、正式分析、数据管理。Chenxi Liu：软件、资源、项目管理、正式分析。