来自法国大规模德尔菲共识会议的技术建议：迈向欧洲ctDNA分析标准化的第一步

《European Journal of Cancer》：Technical recommendations from a large-scale French Delphi consensus: a step toward European harmonization of ctDNA analysis

　　亚历山大·哈莱（Alexandre Harlé）| 莱亚·佩恩（Léa Payen）| 亚历山德拉·莱斯帕尼奥尔（Alexandra Lespagnol）| 尼古拉·戈阿东（Nicolas Goardon）| 朱丽叶·阿尔布伊松（Juliette Albuisson）| 玛丽-克里斯汀·埃蒂安-格里马尔迪（Marie-Christine Etienne-Grimaldi）| 安妮·普拉迪纳斯（Anne Pradines）| 亚历山大·阿特金森（Alexandre Atkinson）| 西蒙·卡贝洛·阿吉拉尔（Simon Cabello Aguilar）| 阿兰·莫雷尔（Alain Morel）| 埃蒂安·鲁洛（Etienne Rouleau）
法国第戎乔治·弗朗索瓦·勒克莱尔中心（Centre Georges Fran?ois Leclerc）

**摘要**
背景：
通过液体活检检测循环肿瘤DNA（ctDNA）已成为精准肿瘤学的基石，但实验室间的技术差异仍阻碍着结果的可重复性和临床可靠性。

**方法**
为应对这一挑战，法国肿瘤细胞遗传学小组（Groupe Fran?ais de Cytogénétique Oncologique, GFCO）开展了迄今为止规模最大的欧洲德尔菲共识倡议，旨在规范ctDNA分析的技术标准，共有39个高容量分子平台参与（响应率为71%）。

**结果**
通过多次匿名调查和实时投票，我们制定了37项建议（达成率≥80%），涵盖了分析前、分析中和分析后的各个环节。关键共识点包括：强制使用独特的分子标识符（UMIs），优先选择基于连接的整合方法（95–100%）；采用高速第二次离心；设置模拟ctDNA特性的系统阳性对照；保留白细胞样本以评估克隆性造血现象；以及明确报告变异等位基因频率、CHIP风险和阴性结果的局限性。这些建议与最近发布的ESMO（2022年）、ELBS（2025年）、ISLB（2025年）和AMP/CAP指南高度一致，并提供了更具体、更具操作性的规范，特别是针对欧洲外部质量评估方案中反复发现的关键步骤（如UMI的实现、血浆储存、离心参数等）。

**结论**
通过提供一个稳健且可直接实施的框架，该共识为欧洲乃至更广泛地区的ctDNA检测标准化铺平了道路，最终增强了人们对液体活检结果在肿瘤学常规诊断和治疗应用中的信心。

**1. 引言**
通过液体活检分析循环肿瘤DNA（ctDNA）改变了精准肿瘤学，实现了对肿瘤基因组的微创、实时监测，检测可操作的基因改变，并评估治疗反应和耐药性[1][2]。尽管临床应用迅速普及，但实验室间的技术差异仍然存在，影响了检测的敏感性、特异性和可重复性——尤其是在低丰度变异以及存在克隆性造血现象（CHIP）等生物学混杂因素的情况下[3]。
近年来，多个国际组织发布了关于ctDNA检测标准化的指南。欧洲医学肿瘤学会（ESMO）精准医学工作组在2022年提供了关于临床效用和最低技术要求的全面建议[2]；分子病理学协会/美国病理学家学院（AMP/CAP）联合发布了关于无细胞DNA检测验证的指南（2023年）[4]；国际液体活检学会（ISLB）制定了最低技术要求（2025年）[5]；欧洲液体活检学会（ELBS）则提出了以报告为重点的共识（2025年）[6]。尽管这些文件在核心原则（如针对<1%变异等位基因频率的UMI强制使用、双重离心方案、系统性的芯片考虑）上达成一致，但在操作细节（如确切的离心参数、UMI整合方法、血浆储存条件、内部对照特性）上仍存在一定解释空间。实际应用中的调查显示这种差异持续存在，凸显了需要更具体、更易于实施的框架的必要性[7][8]。
为解决这一问题，GFCO开展了迄今为止规模最大的欧洲德尔菲共识倡议，涉及39个专家分子平台（响应率为71%），系统评估了分析前、分析中和分析后的工作流程。所得建议（达成率≥80%）与最新国际指南进行了逐项对比（见表1），总体一致性超过90%，并在关键步骤上提供了更详细、更具操作性的规范，这些步骤在常规实践中经常成为变异性的来源。

**表1. 当前国际指南在操作细节上提供的信息有限，因此需要大规模实施的共识**
| 技术方面 | ESMO 2022 | AMP/CAP 2023 | ISLB 2025 | ELBS 2025 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| 确切离心参数（g力、制动） | 推荐（双重离心） | 未提及 | 推荐 | ≥10,000 g第二次离心 |
| UMI整合方法（连接 vs PCR） | 推荐 | 推荐 | 优先选择连接 | 未提及 |
| 最低第二次离心速度 | 未指定 | ≥10,000 g | 建议 | ≥10,000 g | 未提及 |
| 强制保留白细胞样本（怀疑CHIP时） | 根据需要推荐 | 推荐 | 在报告中提及 | |
| 阳性对照片段大小（140–180 bp） | 理想情况下类似ctDNA | 推荐 | 推荐 | 未提及 |
| 使用UMIs时0.5% LoD的最低原始深度 | 变化范围（20–50 k×） | 未指定 | 建议≥10 k×原始深度 | 未提及 |
| 血浆的反复冻融循环 | 避免 | 避免 | 避免 | 未提及 |

**2. 方法**
2.1. 工作组组成
GFCO召集了一个由八名分子生物学家和两名生物信息学家组成的专门工作组来设计全国性问卷。成员名单详见补充材料1。
2.2. 问卷的制定与分发
本研究采用了德尔菲共识方法[10]，由组织委员会制定了结构化的问卷并分发给符合条件的实验室。受访者对每个条目表示同意或不同意，汇总结果后与小组分享，以支持迭代改进和共识形成。问卷涵盖了循环肿瘤DNA（ctDNA）测序工作流程的所有主要组成部分，包括分析前、分析中和分析后的步骤。目的是收集法国各平台的专家意见，并评估每项建议的共识度，定义为≥80%的同意率。问卷在线分发给了所有进行液体活检分析的法国实验室，其中至少有一名工作人员属于GFCO。在3周的时间内共收到55个实验室的回复（响应率为71%）。完整问卷见补充材料2，受访者名单见补充材料3。
2.3. 共识的形成
对于初步调查中未达到预设共识阈值的条目，进行了结构化的重新表述过程（补充材料4）。修订后的条目在2024年GFCO年会上（2024年12月13-14日，法国巴黎）进行了讨论和实时投票。该环节促进了专家之间的直接交流，并通过实时投票达成共识。每个平台指派了一名代表代表实验室投票，确保每个平台在会议期间只投一次票。投票使用匿名电子投票系统（Slido应用程序）进行。会议结束后，希望参与文档修订的参与者提供了姓名和联系方式（补充材料5）。
本文呈现的结果基于这一综合调查和集体投票过程。最终建议将在未来发布前经过进一步的国家审查和定期更新。达成≥80%一致票数的条目构成了此处报告的建议基础，符合常用的德尔菲方法（中位共识阈值为75%[7]）。未达到80%阈值的条目被认为支持不足，不足以作为国家建议的依据。建议制定过程概述见图1。

**图1. 建议制定的整体工作流程**
该研究采用了基于全国性问卷的德尔菲共识方法，涵盖了循环肿瘤DNA（ctDNA）测序工作流程的多个组成部分，包括分析前、分析中和分析后的阶段。

**3. 结果**
以下建议通过咨询和投票过程获得了≥80%的共识，并按循环肿瘤DNA（ctDNA）检测的不同阶段进行了分类（表2）。

**表2. GFCO 2025年关于肿瘤学中循环肿瘤DNA（ctDNA）检测技术标准化的共识建议**
| 技术方面 | ESMO 2022 | AMP/CAP 2023 | ISLB 2025 | ELBS 2025 |
| --- | --- | --- | --- |
| 分析前阶段 | | | | |
| 1. 对于无法在周末或采集后3-4小时内处理血液样本的实验室，应使用含有稳定剂的试管。 | 97.80% | | | |
| 2. 应尽快处理样本，即使制造商的说明允许更长的时间。 | 97.10% | | | |
| 3. 制造商提供的采集、储存和运输条件应记录在处方表和采集手册中。 | 91.40% | | | |
| 样本制备 | 4. 收到血液样本（至少2 × 10 mL试管）后，应进行两次离心，第二次离心速度高于第一次（例如，10分钟1600 g，随后10分钟14,000 g，第二次离心不低于3000 g）。 | 87.40% | | | |
| 5. 第二次离心后，血浆（至少4 mL）可储存在-80°C，中间储存温度可耐受-20°C长达48小时。 | 85.70% | | | |
| 6. 避免血浆样本的反复冻融循环。 | 97.80% | | | |
| 7. 如果预期进行克隆性造血（CHIP）分析，应保留第一次离心后的全血样本或细胞沉淀物。 | 83.90% | | | |
| DNA提取和质量控制 | 8. 建议使用适合ctDNA分析的试剂盒进行DNA定量。 | 91.20% | | | |
| 9. 建议评估片段大小，以检测样本中可能的基因组DNA污染。 | 88.50% | | | |
| 分析阶段 | | | | |
| 10. 协议应根据样本类型进行调整，例如FFPE与ctDNA。 | 97.10% | | | |
| 11. 无论采用何种技术（Capture或Amplicon），都建议使用独特的分子标识符（UMIs）。 | 100.00% | | | |
| 12. 对于非CE-IVD或IVDR认证的内部或商业试剂盒，必须根据COFRAC SH-GTA04进行方法验证，以确定性能和局限性。 | 97.20% | | | |
| 13. 对于CE-IVD或IVDR认证的试剂盒，只需根据COFRAC SH-GTA04进行方法验证，以确保符合制造商声明的性能。 | 91.90% | | | |
| 14. 试剂盒规模（占用空间）应根据实验室可用的NGS仪器能力确定。 | 80.00% | | | |
| 15. 在可行的情况下，建议自动化工作流程以优化样本可追溯性和减少人为错误。 | 97.10% | | | |
| 16. 使用基于捕获的方法从血浆中提取核酸时，不需要片段化。 | 100.00% | | | |
| 17. 优先选择基于UMI的连接方法而非PCR整合。 | 95.20% | | | |
| 测序 | | | | |
| 18. 应根据方法和预期灵敏度调整测序深度。ctDNA检测的最佳灵敏度为≥0.5%，具体取决于检测条件（诊断或疑似复发）。 | 94.50% | | | |
| 19. 每次运行都应包括系统的内部质量控制（阳性对照）。 | 90.20% | | | |
| 20. 内部质量控制应尽可能复制ctDNA的特性，特别是140–180 bp的片段大小。 | 91.20% | | | |
| 21. 阳性对照应包含多种类型的变异（插入、替换、缺失等），涵盖所用基因面板中的多个位点。 | 94.50% | | | |
| 22. 阳性对照应包含接近检测限的等位基因频率的变异。 | 100.00% | | | |
| 23. 如果阳性对照未涵盖所有变异，允许实验室间交换。 | 93.90% | | | |
| 24. 可以利用多态性变异的生物信息学分析来评估每次运行的潜在污染。 | 91.70% | | | |
| 25. 建议参与外部质量评估（EQA）项目。 | 91.20% | | | |
| 26. 在文库制备过程中必须使用UMIs，以改善生物信息学数据处理。 | 97.00% | | | |
| 27. 鼓励在生物信息学输出中报告去重率或去重前后的覆盖率。 | 96.30% | | | |
| 28. 建立专门的生物信息学工作组（如BioInfoDiag）有助于提供工具指导（UMI去重、变异调用等）。 | 100.00% | | | |
| 29. 建议制定实现所需LoD的最低测序深度。 | 87.90% | | | |
| 生物信息学 | | | | |
| 30. 可以使用合成或基于计算机的FASTQ文件（“合成患者”）来验证流程并进行非回归测试。 | 82.80% | | | |
| 31. 可以使用之前分析的患者样本的FASTQ文件来验证流程并进行非回归测试，同时遵守GDPR规定。 | 97.10% | | | |
| 32. 除非有特殊情况，否则在更新流程时应始终使用相同的FASTQ文件进行非回归测试。 | 96.60% | | | |
| 33. 评估克隆性造血现象可以提高结果可靠性。 | 100.00% | | | |
| 分析后阶段 | | | | |
| 34. 应报告变异等位基因频率（VAF），以供参考。 | 93.90% | | | |
| 35. 如果在具有潜在家族影响的基因中检测到致病性变异，尤其是当VAF超过30%时，报告中应说明根据临床和家族情况可能需要咨询临床遗传学家。 | 93.30% | | | |
| 36. 对于特征明确的基因，建议在报告中提及检测到的变异可能与克隆性造血（CHIP）相关。 | 100.00% | | | |
| 37. 如果未检测到变异，并且检测方法无法评估肿瘤比例，建议在报告结论中说明阴性结果并不排除样本中存在循环肿瘤DNA的可能性。 | 97.20% | | | |

**3.1. 分析前阶段**
3.1.1. 运输
**建议1**
这一建议几乎得到一致通过，强调了在无法立即处理样本时保存样本的关键作用。血浆中ctDNA的稳定性是检测准确性的关键因素[11]。含有核酸稳定剂的试管可以减缓循环无细胞DNA（cfDNA）的降解，即使在采集和分析之间存在延迟，也能确保最佳保存条件[12]。这种方法为实验室的物流限制提供了实际解决方案，同时保持了样本的完整性。

**建议2**
快速处理样本对于保持样本完整性和最大化分析性能至关重要。该建议强调了减少延迟的重要性，无论制造商指示的稳定性时间如何。ESMO指南指出，分析前因素（特别是储存和运输时间）直接影响检测的敏感性和准确性[2]。鼓励加快处理速度不仅限于技术合规性，还体现了对国家实验室实践持续改进的承诺。建议3强调了向临床医生和开处方者提供样本运输最佳实践信息的必要性。这与ESMO指南[2]保持一致，包括在处方表中包含这些细节，有助于提高所有利益相关者的可追溯性和协调性。提供此类信息对于确保结果可靠性、降低假阴性风险以及最小化潜在样本污染或降解至关重要。

3.1.2 样本制备
建议4建议进行两次离心，第二次离心速度比第一次快，这是为了减少细胞碎片、血小板、纤维蛋白和白细胞的污染[11]。这种两步离心法也得到了ESMO和国际液体活检协会（ILBS）的推荐，可以确保分析前的样本质量，从而降低由于残留污染导致的假阳性或技术故障的风险[2]、[5]。

建议5关于将血浆储存在-80°C下的共识，同时允许在-20°C下短期储存最多48小时，这反映了样本保存的关键重要性。ctDNA在温度波动或冷藏不足的情况下特别容易降解[11]。尽管操作要求较高，但这种严格的储存协议对于维持核酸完整性和最大化分析前稳健性至关重要。

建议6几乎一致同意应避免重复的冻融循环。实验证据表明，这种温度波动会不可逆地破坏DNA分子，从而影响ctDNA的质量和检测灵敏度。

建议7保留一部分全血或细胞沉淀物是一种预防策略，用于处理与克隆性造血（CHIP）相关的诊断不确定性问题，据估计70岁以下人群中CHIP的患病率约为5%，并且随着年龄的增长而增加[3]。TP53是一个与治疗相关髓系肿瘤风险增加密切相关的关键位点[3]、[13]。此外，Pascual等人报告称，多达10%的患者可能因CHIP相关变异而被误诊[2]。保存这些样本可以使用先进的方法进行后续确认分析，从而更准确地区分肿瘤来源的突变和CHIP相关的改变。

3.2 DNA提取和质量控制
建议8系统地量化提取的DNA强调了在任何下游分析之前评估核酸质量和数量的必要性。不充分或忽视量化可能导致实验失败或结果不可用，可能在临床背景下引起误解。

建议9评估DNA片段大小对于检测由细胞裂解残留物引起的基因组DNA污染至关重要，因为这可能会影响数据解释。ctDNA由于其凋亡来源，通常显示出150-180个碱基对的特征性片段大小，而其他细胞死亡过程产生的基因组DNA则较长[14]。在非血液生物流体中，ctDNA片段可能更大[15]、[16]、[17]。随着长读长测序技术的发展，识别较长的无细胞DNA片段也可能具有临床意义。Pascual等人还指出，肿瘤变异检测特别容易受到污染DNA的干扰，这可能导致假阴性结果[2]。将这一建议纳入实验室协议是验证分离出的遗传物质完整性和特异性的关键步骤，有助于减少分析偏差，并确保准确反映肿瘤基因组改变，这对于指导肿瘤学治疗决策至关重要。

3.3 NGS的分析阶段
3.3.1 文库制备
建议10根据样本类型（FFPE与ctDNA）调整协议，这反映了人们对不同样本基质生物学和技术差异的认识。ctDNA通常含量较低且高度片段化[14]，因此需要特定的协议优化以最大化回收率和扩增效果。这一建议表明了对样本特性及其对分析结果影响的深入理解。

建议11无论使用何种技术（Capture或Amplicon），一致认为加入独特的分子标识符（UMIs）是必不可少的。UMIs可以提高灵敏度和检测限（LOD），同时减少扩增偏差和测序错误，这对于获得可靠的ctDNA序列数据至关重要。这种方法显著提高了NGS方法的灵敏度和特异性[18]，并将UMIs确立为ctDNA实验室的标准最佳实践。

建议12和13区分非CE-IVD/IVDR面板和CE-IVD/IVDR面板的验证和确认，强调了确保分子检测可重复性、标准化和合规性的严格方法。内部和非CE-IVD/IVDR检测需要全面验证，而CE-IVD/IVDR标记的面板只需进行确认，两者均按照COFRAC SH-GTA04参考指南（法国国家认证机构的技术指南，完全符合ISO 15189和EU IVDR要求）[4]执行。这一框架反映了国际标准，同时提供了适应欧洲监管环境的详细操作检查清单。

建议14面板规模应根据实验室NGS仪器的能力进行定制，这反映了将技术资源与分析目标相匹配的必要性。尽管对此建议的共识略低，但它承认了实验室基础设施的多样性。

建议15鼓励工作流程自动化，以优化样本可追溯性并减少人为错误。这一物流措施对于有效的实验室样本管理至关重要。

建议16在基于捕获的NGS工作流程中，血浆来源的核酸不需要进行片段化处理，这突显了这种方法适用于天然较短的ctDNA片段[14]。

建议17与基于PCR的UMI结合相比，使用UMI连接可以减少PCR和短读长测序的偏差，从而提高数据的准确性和可靠性[5]。

3.3.2 测序
建议18根据技术和临床需求调整测序深度对于实现0.5%的理想灵敏度至关重要，特别是在诊断或疑似复发情况下。目标覆盖度应达到约1,000×独特读数，以达到0.5%的灵敏度。考虑到在最佳条件下UMI去重通常会产生约10%的原始读数，实验室应争取达到约10,000×的去重前覆盖度（图2）[7]。

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图2. 测序深度（覆盖度，DoC）对检测变异概率的影响，取决于变异等位基因频率（VAF）在常规ctDNA分析中的关系。该图说明了根据测序深度的VAF与检测概率之间的理论关系，突出了临床常规中相关的灵敏度阈值。更高的DoC增加了检测低频变异的可能性，这对于ctDNA分析至关重要，因为血浆中肿瘤来源的等位基因通常含量较低。为了在0.5% VAF时实现可靠检测，去重后的覆盖度需要约为1,000×，假设原始读数的去重率为10%。这些检测阈值直接决定了临床ctDNA测试的最低技术要求[7]。

建议19在每次运行中包含阳性对照可以确保系统的质量控制，并减少分析错误。通过复制ctDNA的特性，内部对照增强了真实样本条件的代表性，鉴于ctDNA的脆弱性，这一点尤为重要。

建议20-22、24. 包含多种变异类型和接近检测限（LoD）的变异频率的阳性对照可以真实评估实验室的技术性能。这些措施不仅验证了NGS面板对复发性突变的能力，也验证了对罕见或面板特异性改变的能力。

建议23和25. 参与外部质量评估（EQA）是ISO15189的要求。在没有合适的EQA计划的情况下，实验室可以通过交换样本来实施实验室间对照。EQA方案应与实验室检测的目标变异类型相匹配。

建议26和27. 在库制备过程中加入UMI得到了普遍支持。监控去重率或覆盖度对于适当的分析控制至关重要。

建议28和29. 建立一个专门的生物信息学工作组，包括公共和私人实验室以及像BioInfoDiag这样的学术组织，并提供关于最低覆盖要求的指导，这体现了协调分析工具、策略和方法学阈值的积极态度。

3.3.3 生物信息学
建议30和31. 使用FASTQ文件——无论是合成的（计算机模拟的）还是来自先前分析的实验室数据——进行流程验证和非回归测试，体现了严格的质量控制方法。利用现有的FASTQ文件具有实际优势，使实验室能够在不生成新样本的情况下进行非回归评估。这种策略确保了性能评估的方法学连续性，特别是在引入新流程版本时。

建议32除非在特殊情况下，否则在流程更新期间始终使用同一组FASTQ文件进行非回归测试，可以减少实验变异。这种方法为实验室提供了标准化的参考框架，增强了可重复性和分析稳健性。

建议33评估克隆性造血（CHIP）是提高结果可靠性的关键步骤。参考方法涉及对同一样本中的白细胞提取的DNA进行测序。在存在技术、伦理或财务限制的情况下，基于文献的评估（例如，TP53、DNMT3A、TET2、ASXL1、PPM1D）是一个可行的替代方案。

建议33.4 结果报告
经过验证的ctDNA结果报告建议强调了清晰、具有临床信息性的最佳实践。这些指南有助于一致的报告，并预见了潜在的临床影响，与ESMO[19]和欧洲液体活检协会（ELBS）[6]等国际组织的建议保持一致。

建议34在报告中包含VAF可以为临床医生提供重要的定量信息。循环肿瘤DNA的比例可能因疾病阶段或技术限制而异[8]。标准化的VAF报告有助于纵向监测疾病动态，并可能为治疗决策提供信息。这些建议特别适用于诊断或治疗性液体活检应用，不适用于最小残留疾病评估。

建议35当基因发现提示潜在的遗传性癌症风险时，建议咨询临床遗传学专家，特别是对于BRCA1、BRCA2或TP53等基因。此类咨询有助于区分种系与肿瘤特异性（新生）变异，并指导风险评估、监测和预防策略，既适用于患者也适用于高风险亲属。

建议36强调检测到的变异可能反映了克隆性造血（CHIP）的可能性，这是减少假阳性解释的重要步骤。这种做法提高了报告的临床实用性，并有助于避免不适当的治疗决策。

建议37在没有检测到变异且检测方法无法评估肿瘤比例的情况下，包含一个免责声明，说明阴性结果并不排除循环肿瘤DNA的存在，这是一个谨慎且具有临床责任感的措施[6]、[19]。这种方法降低了假阴性解释的风险，并强调了根据临床情况重复检测的必要性。在这些情况下，了解肿瘤比例对于最佳解释至关重要。

3.4 未达成共识的条款
在ctDNA测试问卷中识别出的未达到预定义共识阈值80%（表3）的条款提出了关于测试工作流程中几个关键步骤的实践、资源和特定条件的重要问题。尽管这些话题仍在讨论中，但它们反映了方法学和组织上的复杂性。对其分析并结合所提出的问题，突出了挑战并指出了改进的潜在途径，但并不构成强制性建议。

表3. 在GFCO 2025 Delphi过程中未达成共识（≥80%同意）的提案。尽管这些提案在许多情况下获得了大量支持，但认为它们不足以被正式纳入国家/欧洲建议。这里列出它们是为了透明度，并突出当前欧洲实践中持续的辩论或异质性领域。
NC = 未达成共识的条款

**分析前阶段**
提案
共识
运输
NC-1. 制造商提供的存储和运输条件应仅出现在运输手册中。
42.90%

NC-2. 如果可能，处方应指示限制在周五收集样本。
33.30%

NC-3. 应向开处方中心提供稳定的循环DNA管（例如，Streck管）。
72.80%

**样本制备和提取**
NC-4. 收到血液样本后，需要进行两次离心：第一次以1600 g离心10分钟，然后对血浆进行第二次离心，速度分别为16,000 g离心10分钟或4,800 g离心20分钟。离心应在室温下进行，尽量减少制动。
68.60%

NC-5. 如果可行，应优先使用磁珠提取循环DNA，以便实现自动化，而不是基于柱子的提取方法。
78.80%

**分析阶段**
提案
共识
NGS – 测序和库制备
NC-7. 在处理来自非血液生物流体的核酸时，基于捕获的协议需要片段化。
66.70%

NC-8. 使用UMIs时，去重/分组前的最小读数（x）应超过10,000×，去重后的最小读数应超过800×，以达到约0.5%的灵敏度。
70.40%

NC-9. 不使用UMIs时，去重前的最小读数（x）应超过10,000×，去重后的最小读数应超过1,000×，以达到约1%的灵敏度。
73.70%

NC-10. 建议在每次测序运行中系统地分析一个内部质量控制（阳性对照）。
62.50%

NC-11. 不建议在每次测序运行中使用阴性对照。
79.20%

**分析后阶段**
提案
共识
结果报告
NC-12. 实验室报告中应报告基因覆盖百分比。
65.70%

NC-13.从定性方法验证过渡到定量验证是必要的，以便在实验室报告中报告等位基因频率（VAF）。56.70%的质量建议NC-14建议参与DNA提取的外部质量评估（EQA）计划。75.00%的主要分歧点包括每次运行或文库池都需要系统内部对照，这通常被认为成本高昂或不必要，因为有其他可用的质量指标。替代方法，如非回归测试或监测多态性，可能可以弥补这些做法的不足。虽然使用UMI或特定技术被认为很有价值，但由于实际可行性或对替代方法充分性的看法不同，有时会引发争议。关于提取DNA的储存条件也存在分歧，包括特定温度或短期保存，这反映了人们对样本稳定性的担忧。分析方法，如常规DNA定量或片段大小评估，也遇到了阻力，要么是因为认为其临床相关性有限，要么是因为组织上的限制。最后，成本考虑、方法标准化以及设备与临床需求的兼容性突显了实验室之间的差异，并强调了需要在保持协调一致的做法的同时，根据当地情况调整建议。

3.5. 分析前阶段
3.5.1. 运输
在运输和收集相关建议（NC-1）上观察到的分歧突显了跨多个地点运营且可访问性不同的实验室所面临的实际和组织限制。例如，只有42.9%的实验室同意存储和运输条件仅应在手册中提供的建议，这表明需要增加这些信息的可见性，使其可以直接供工作人员访问或根据每个实验室的偏好来设置。物流考虑也很重要，特别是在限制周五收集样本方面（NC-2，33.3%），这对于确保样本在降解前得到及时处理至关重要；当地组织在很大程度上决定了可行性。关于NC-3，由于实验室之间资源和工作流程的差异，该建议未能达成共识，反映了运营能力和实际限制的差异。

3.5.2. 样本制备和提取
关于样本制备的建议存在差异，例如离心协议（NC-4）或使用磁珠提取（NC-5），这反映了技术偏好、可用设备和实验室基础设施的差异。虽然自动化可以减少人为错误，但提取方法的选择必须根据每个实验室的资源进行调整。同样，使用阴性提取对照（NC-6）并未被认为具有足够的参考价值，因此未能达成共识建议。

3.6. 分析阶段
3.6.1. NGS：测序和文库制备
关于测序和文库制备的建议反映了实践和技术可行性的差异。例如，NC-7中提到的对于非血液液体中核酸的捕获协议进行片段化的需求，被调查小组认为不太相关。关于UMI的使用，NC-8和NC-9的建议未能达成共识，但可以通过进一步澄清或重新表述来解决。对于是否系统地分析每个文库池的阳性对照（NC-10，62.5%）缺乏共识，这突显了实验室在成本、时间和风险管理之间必须做出的平衡。虽然ISO15189要求制定内部质量控制的政策，但技术实施和频率仍由各个实验室自行决定。同样，每次运行中使用阴性对照（NC-11）也体现了这种灵活性。

3.7. 分析后阶段
3.7.1. 结果报告
在NGS中，覆盖率和深度的概念经常引起混淆。覆盖率指的是已测序的目标序列的百分比，而深度指的是在给定位置读取的DNA分子数量。国际组织如ELBS [20] 建议在方法部分报告面板覆盖率，在结果中报告特定变异位置的深度。即使经过重新表述，NC-12的建议也未能达成共识，表明这个问题应在未来的建议更新中重新考虑。NC-13缺乏共识，突显了实验室在将NGS作为定量方法进行验证时面临的挑战。当前的方法，如SH-GTA-04中描述的那些，并未完全适应NGS工作流程和相关成本，使得在常规实践中进行正式的定量验证变得困难。

3.7.2. 质量建议
尽管COFRAC要求所有实验室测试都参与外部质量评估（EQA）计划以确保可靠性和标准化，但DNA提取被视为分析前步骤而非正式的实验室测试。这可能解释了为什么NC-14的建议未能达成共识。尽管如此，掌握DNA提取过程对于保证下游分析的质量至关重要，即使提取过程本身不在EQA方案中直接评估。

4. 讨论
循环肿瘤DNA（ctDNA）分析由于其微创性质和对患者纵向监测的实用性，已成为分子肿瘤生物学的标准工具。通过GFCO问卷收集的数据突显了法国在实践中的几个挑战和差异。样本稳定性和消耗品的选择仍然是确保分析质量的关键因素。正如建议中指出的，使用EDTA管或含有稳定剂的专用管（例如Streck、Roche）仍然存在争议。国际液体活检协会（ILBS）建议使用蝶形针以减少收集过程中对血细胞的机械压力，从而最小化基因组DNA污染，尽管这一点在最初的GFCO建议[9]中并未讨论。收集后，轻轻翻转血液8-10次对于保持ctDNA的完整性至关重要。对于标准基因检测，通常10毫升血液就足够了，而ctDNA分析可能需要20毫升[20]。尽管目前的建议侧重于ctDNA，但重要的是要强调，在分析cfRNA生物标志物时，高度标准化的分析前程序（样本收集、运输和储存）更为关键[21]。鉴于RNA分子比DNA更不稳定，GFCO框架为将来将多分析物液体活检检测整合到常规肿瘤护理中提供了坚实的基础。

为了防止收集过程中溶血增加，一些护理手册建议在专用管之前使用“净化管”。这一步骤还可以去除收集设备中的残留空气或潜在污染物，特别是在使用翼状针时。关于灵敏度阈值（例如在0.5%等位基因频率（VAF）下检测变异）的差异反映了技术方法的差异。实验室反馈指出，在测序深度低或不使用UMI时，结果的可靠性存在问题。由于财务或组织限制，仪器更新并不总是可行的，因此需要在样本大小和测序深度之间做出实验室特定的折中。

重要的是要认识到，NGS的灵敏度受到输入DNA量的限制。鉴于1 ng的人类基因组DNA大约相当于300个单倍体基因组当量，理论上要达到1,000×的覆盖率以检测0.1% VAF的变异，至少需要3 ng的DNA[22]。这个计算假设扩增均匀、处理过程中没有材料损失，并且基于单个突变分子进行变异验证，这些条件在实验上不太可能实现。因此，在标准实验条件下，当输入DNA低于5 ng时，通常不合理报告低于0.5% VAF的变异。这些建议不适用于微小残留疾病（MRD）监测，在这种情况下，低VAF检测对于早期发现复发和个性化治疗策略至关重要[23]。在这些情况下，高灵敏度的肿瘤信息或不可知方法[24]、[25]是必不可少的，同时还需要定量方法验证而不仅仅是定性评估。

解释挑战还源于克隆造血的不确定性（CHIP），这可能导致假阳性结果。ESMO指南建议将ctDNA发现与白细胞DNA进行比较，以排除造血来源[2]。白细胞DNA分析还可以确认或排除 constitutional 变异，这在家族性癌症易感情况下尤为重要。然而，常规的constitutional 分析成本高昂，需要正式的遗传授权，并引发伦理问题，包括需要明确的患者同意。目前，肿瘤基因分析依赖于医生提供的信息，符合撰写时有效的法国生物伦理法。

肿瘤分数估计越来越被认为是减少基于ctDNA的检测中假阴性率的关键。即使分析灵敏度达到0.5% VAF或更低，非常低的肿瘤来源DNA分数也可能导致ctDNA分子数量不足，低于可靠检测的限值[26]、[27]。当技术上可行时，提供肿瘤分数的估计（例如通过甲基化特征或拷贝数分析）或标记cfDNA产量非常低的样本有助于临床医生更准确地解释阴性结果，并可能指导是否重复检测或补充组织分析。同样，片段大小分析（建议9）具有直接的临床意义。检测异常长的片段（>300 bp）是白细胞裂解导致基因组DNA污染的强烈指标。这种污染会稀释ctDNA，可能导致假阴性和假阳性结果，从而可能导致错误地排除或不当启动靶向治疗[28]。

尽管液体活检在实验室中广泛使用，但其应用仍然限于经过临床验证的指征，如指导治疗、检测激酶抑制剂耐药性或补充不可用的组织。因此，这些建议仅针对经过验证的临床应用，不适用于MRD监测或早期癌症检测。

4.1. 与国际指南的对齐和附加值
GFCO的建议与最新的国际共识文件高度一致，包括ESMO精准医学工作组建议[2]、欧洲液体活检协会（ELBS）报告指南[6]、国际液体活检协会（ISLB）最低技术要求[5]以及AMP/CAP联合指南对于cfDNA检测的验证[4]。表4提供了详细的对比。超过90%的GFCO共识项目与这些国际标准完全一致，特别是在针对<1% VAF的检测中必须使用UMI、双离心协议、长期存储在-80°C、系统内部阳性对照模拟ctDNA特性、参与外部质量评估计划以及明确报告CHIP和germline风险方面。

表4. GFCO 2025共识建议与主要国际指南关于ctDNA检测的详细比较。
技术方面 / 建议
GFCO共识
ESMO 2022
AMP/CAP 2023
ISLB 2025
ELBS 2025
当延迟>3–4小时或周末时使用稳定管
97.8%
推荐（最多7–14天）
强烈推荐（如果超过6小时）
未详细说明
即使制造商允许更长时间，也优先快速处理
97.1%
强调
强调
“尽快”
未涉及
双离心，第二次离心≥3000 g
87.4%
推荐（双离心）
明确推荐
≥10000 g
未详细说明
血浆存储–80°C（中间–20°C ≤48小时）；避免反复冻融
85.7–97.8%
–80°C；推荐避免冻融–80°C
–80°C强制要求
未详细说明
当预期进行CHIP时保留白细胞沉淀/全血等分
83.9%
必要时推荐
推荐
报告中提及
DNA定量+片段大小分析
88.5–91.2%
推荐
推荐
强制进行片段检查
强制使用UMI，无论技术如何
100%
强烈推荐
对于<1% LoDM强制要求
对于<1% VAF强制要求
优先选择UMI连接而不是基于PCR的整合
95.2%
未指定
未指定
连接优先
未涉及
血浆来源DNA不需要片段化
100%
不需要
未要求
明确说明
未涉及
根据ISO 15189/IVDR进行验证/确认
91.9–97.2%
遵循ISO/CAP
详细验证检查表
遵循IVDR + 当地认证
未详细说明
调整测序深度以达到≥0.5%灵敏度（诊断）
94.5%
适应LoD
未指定
≥10000×原始+ ≥1000×独特
未涉及
每次运行都使用阳性对照，模拟ctDNA（140–180 bp，低VAF）
90.2–100%
强制要求，理想情况下类似ctDNA
推荐
强制+实验室间交换
未详细说明
参与测序的EQA计划
91.2%
强制（ISO 15189）
强制
强制+ ctDNA特定
推荐
系统评估CHIP
100%
当怀疑时推荐
系统提及+可能时WBC
强制免责声明
报告VAF以供信息参考
93.9%
报告VAF + CI
强制
强制+注意事项
提及可能的germline/CHIP来源，特别是VAF >30%
93.3–100%
对于风险基因强制要求
详细模板
详细模板
阴性结果不排除ctDNA
97.2%
强制免责声明
强制免责声明
强制免责声明

在存在轻微分歧的情况下，GFCO的建议通常更具规定性和操作导向，反映了高容量欧洲分子肿瘤委员会的实际限制和基础设施。值得注意的例子包括一致偏好使用UMI连接而不是基于PCR的整合（100%共识）、系统推荐第二次高速离心≥3000 g（87.4%）、严格避免即使短期存储也进行反复冻融循环，以及明确要求在预期进行CHIP分析时保留白细胞沉淀或全血等分（83.9%）。这些要素解决了跨国调查和EQA报告中反复强调的实际差距，但在更广泛的国际指南中并不总是强制性的。因此，GFCO共识作为一个具体的实施框架，补充并实现了ESMO、ELBS和ISLB的原则，促进了在欧洲日益增加的监管压力下的临床实践协调。

4.2.对欧洲监管协调的影响
随着《欧洲体外诊断法规》（IVDR）中关于C类和D类检测的条款预计将在2027至2028年全面生效，目前作为实验室自开发检测（LDTs）或根据过渡性规定进行的ctDNA检测将需要正式的符合性评估和更完善的技术文件。GFCO提出的详细操作建议涵盖了分析前稳健性、基于UMI的错误校正、深度要求、内部质量控制以及CHIP管理等方面，直接满足了IVDR附件I和GSPR 9.1-9.4中规定的基本性能和安全要求。通过提供超出当前国际指南水平的明确、基于共识的规范，该框架为实验室和认证机构提供了实用且可直接实施的参考，有助于实现向IVDR合规性技术文件的顺利过渡，并确保在整个欧洲范围内持续获得高质量的ctDNA检测服务。

4.3. 本建议的推广
本建议代表了专家共识（证据等级4-5），但目前尚未包含关于其对检测性能、实验室间重现性或临床结果直接影响的前瞻性数据。不过，GFCO工作组已启动了系统的推广和实施计划。计划于2027年底进行后续全国性审计，以评估采纳率、对最严格条款的遵守情况（例如UMI连接、第二次离心参数、白细胞沉淀物的保存等），以及这些措施对参与平台间检测协调的初步影响。这些步骤旨在缩小共识声明与实际诊断实践中的可测量改进之间的差距。

5. 结论
液体活检和循环DNA分析在法国实验室中的应用持续扩展。新版GFCO建议体现了各方共同努力，旨在标准化ctDNA检测的最佳实践。鉴于该领域发展迅速，持续更新至关重要，以确保指导方针始终与技术进步和临床需求保持一致。

**资金**
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Etienne Rouleau：撰写、审阅与编辑
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