全面的化学蛋白质组学研究揭示了选择性HMG-CoA合成酶1抑制剂，这些抑制剂可用于靶向癌症中的甲羟戊酸代谢途径

《Journal of the American Chemical Society》：Comprehensive Chemoproteomics Unveils Selective HMG-CoA Synthase 1 Inhibitors for Targeting Mevalonate Metabolism in Cancer

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全面的目标验证仍然是化学探针开发中的一个重要瓶颈，特别是对于共价抑制剂而言，因为脱靶反应可能导致毒性。我们利用HMG-CoA合成酶1（HMGCS1）——一种在甲羟戊酸途径中未被充分研究的调控酶——展示了如何通过整合正交的化学蛋白质组学方法来提供关于共价抑制剂靶内和靶外特性的无偏、全面的见解。我们的研究特别指出了传统富集蛋白质组学在区分高结合亲和力化合物和低结合亲和力化合物方面的局限性，并提出了一种通过补充性清除蛋白质组学方法来解决这一问题，该方法分析去富集后的组分，从而提供整个蛋白质组中的目标结合比率。这一框架促进了CNP7的开发，CNP7是一种能够以显著选择性共价修饰HMGCS1催化半胱氨酸的氰吡咯烷类化合物。2.29 ?的冷冻电镜结构揭示了CNP7如何与HMGCS1的疏水口袋中的催化半胱氨酸结合。CNP7处理后4小时内HMG-CoA水平下降，并诱导全局蛋白质去前缀化。值得注意的是，CNP7表现出与他汀类药物不同的细胞系特异性抗癌活性模式，这表明可能存在针对特定途径节点的脆弱性。总的来说，我们的研究提供了调节HMGCS1活性的有价值的化学工具，并为化学生物学和药物开发中的共价抑制剂提供了严格的表征框架。

**引言**
化学探针对于推进我们对生物途径的理解以及识别潜在的治疗靶点至关重要。然而，全面的目标验证仍然是一个重大挑战，尤其是对于共价探针，因为脱靶反应可能导致意外的毒性并使生物结果的解释变得复杂。已经开发了几种化学蛋白质组学技术，如基于共价标记的亲和富集蛋白质组学、热蛋白质组学分析、半胱氨酸组学分析等，用于在探针开发的各个阶段绘制小分子靶点图谱，每种技术都有其优势和局限性。例如，基于亲和力的方法可以通过富集来识别低丰度靶点，但这些方法通常无法提供靶点结合率或展示小分子如何影响整个蛋白质组。半胱氨酸组学分析是一种有价值的工具，可用于识别以细胞依赖性方式靶向特定半胱氨酸的亲电配体，但由于其仅覆盖有限的半胱氨酸含肽，因此限制了其在验证脱靶反应中的应用。热蛋白质组学分析依赖于配体结合时蛋白质稳定性的变化，这种方法不需要将配体共价连接到靶点上。尽管如此，这种方法的假阳性和假阴性率的具体程度仍不清楚。总体而言，需要更全面的比较不同化学蛋白质组学方法，以评估它们识别小分子靶点的有效性，这将有助于在药物开发的每个阶段选择最佳方法。在这项研究中，我们系统地比较了多种蛋白质组学方法，以开发一种针对HMG-CoA合成酶1（HMGCS1）的首创共价抑制剂，HMGCS1是甲羟戊酸途径中的关键酶，以评估每种方法在靶点鉴定方面的表现。我们的发现表明，将清除蛋白质组学与基于亲和力的方法相结合，并重新利用半胱氨酸组学分析来监测半胱氨酸的翻译后修饰，可以克服传统化学蛋白质组学方法的局限性，从而为靶向甲羟戊酸途径的小分子探针提供无偏的功能读数。

**甲羟戊酸途径（MVP）**
甲羟戊酸途径中的酶将乙酰辅酶A转化为异戊烯基焦磷酸，这是胆固醇从头合成以及参与蛋白质翻译后修饰的关键异戊二烯类化合物的重要前体。确保在特定时间产生足够的甲羟戊酸对细胞功能的多个方面至关重要，因为甲羟戊酸和甾醇产物的过量产生会引发诸如心血管疾病和癌症等人类疾病。因此，在过去的几十年中，该途径中的几种酶已成为癌症的治疗靶点。尽管现有的非共价抑制剂显示出潜力，但由于其体内效力较低，尚未取得显著的临床抗癌效果。因此，开发通过不同药理机制作用的小分子或靶向特定癌症类型中的限速酶可能会通过干扰甲羟戊酸代谢带来更有效的抗癌治疗。

HMGCS1是甲羟戊酸途径中的第一个酶，是一个很大程度上被忽视的药理学靶点。HMGCS1具有独特的特征，使其与其他MVP酶区分开来。HMGCS1的一个关键特征是其活性位点上的催化半胱氨酸，可以利用这一特征开发共价抑制剂和化学探针，这些抑制剂可能比非共价抑制剂具有更高的效力和一致性。此外，我们的实验室表明，HMGCS1通过将雷帕霉素复合体1（mTORC1）活性的机械靶点与甲羟戊酸途径联系起来，在细胞生长中起到关键的控制作用。这些独特的生化特性表明，用小分子靶向HMGCS1值得进一步研究，特别是在mTORC1过度活跃的癌细胞中发挥其抗增殖作用。目前，可用于调节HMGCS1活性的化学工具很少。Hymeglusin是一种天然产物抑制剂，但其血清稳定性较差，导致效力显著降低，限制了其在细胞和体内研究中的应用。另一种来自植物的天然产物Ligustilide在肝脏中经过环氧化后也被报道能靶向HMGCS1，但其高度不稳定性以及越来越多的文献将其与多种细胞过程联系起来，表明其反应性并非特异性针对HMGCS1。迄今为止，使用各种亲电小分子进行的半胱氨酸组学研究未能识别出与HMGCS1催化半胱氨酸反应的小分子或片段。因此，需要新的化学方法来开发HMGCS1抑制剂并研究这一重要的代谢酶。

在这里，我们介绍了CNP7，这是一种首创的HMGCS1抑制剂，它通过其氰吡咯烷亲电基团与HMGCS1的催化半胱氨酸结合。我们使用双重活性分析方法将CNP7开发为一种强效且选择性的HMGCS1抑制剂候选物，并进行了广泛的化学蛋白质组学分析，包括亲和蛋白质组学、热蛋白质组学分析和半胱氨酸组学分析，以评估CNP7在细胞中的反应性。通过2.29 ?分辨率的冷冻电镜结构进一步表征了CNP7与HMGCS1的结合方式。用CNP7处理的细胞显示出HMG-CoA水平降低和未前缀化蛋白质水平升高，而添加HMG-CoA的下游代谢物香叶基香叶醇可以恢复这种效应。总体而言，这项研究提供了一种选择性的化学工具，用于调节HMGCS1活性，并提供了使用无偏化学蛋白质组学评估共价探针及其下游效应的见解。

**结果与讨论**
CNP7是一种强效的首创HMGCS1抑制剂
目前，市场上还没有具有有效选择性和持久效力的HMGCS1抑制剂。因此，我们着手开发HMGCS1的小分子抑制剂。由于HMGCS1的活性位点含有催化半胱氨酸，我们首先查阅了公开可用的半胱氨酸组学数据集，这些数据集报告了各种小分子库与反应性半胱氨酸的结合情况。然而，这些分析并未检测到HMGCS1的Cys129（C129）区域，因为包含C129的胰蛋白酶肽长度为46个氨基酸（图S1A）。相反，针对去泛素化酶设计的氰吡咯烷类探针的亲和化学蛋白质组学数据分析将HMGCS1识别为脱靶 hit。受到这些来自独立学术实验室的无偏且一致结果的启发，我们测试了Gersch实验室报道的最简单氰吡咯烷类探针GK16S对HMGCS1的标记。我们使用Hymeglusin-Fluorescein（HG-FL）进行了基于活性的HMGCS1探针分析，该探针特异性与HMGCS1的C129结合并形成共价键（图S1B）。结果表明，HMGCS1 ～ HG-FL加合物在凝胶中显示出荧光信号，从而允许我们在体外和细胞中测量小分子处理后的HMGCS1催化半胱氨酸水平。将重组HMGCS1与GK16S孵育1小时后，HG-FL对催化半胱氨酸的标记减少，表明HMGCS1的催化半胱氨酸被GK16S占据，尽管效率较低（图S1C）。基于细胞的分析证实，GK16S与野生型HMGCS1共价结合，但不与HEK293T细胞中表达的C129A突变体HMGCS1结合，证实了其对Cys129的特异性反应。

接下来，我们开发了氰吡咯烷类衍生物以提高标记HMGCS1的效率。HMGCS1具有一个疏水结合口袋，可以容纳两种不同的底物：乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A（图S1E）。这一观察表明，在GK16S的4-戊炔-1-胺上添加一个大的疏水基团可能会增强整体结合能力。因此，我们合成了具有不同疏水性的CNP分子，并使用HG-FL基于活性的探针在体外比较了它们的结合效率（图1A–C）。在苯基位置引入甲基（CNP3和CNP4）几乎消除了结合效率，而在苯基位置引入甲基并采用S构型则保持了HMGCS1的标记效率。用萘基取代CNP1中的苯基（CNP5和CNP6）并未增强标记效果，而用联苯基取代苯基（CNP7和CNP8）显著提高了催化半胱氨酸的结合效率。CNP7在这种体外分析中显示出最高的标记效率，这与通过将HEK293T细胞与CNP化合物孵育后进行裂解和HG-FL处理的细胞内标记效率相符（图1D,E）。HG-FL分析的结果表明，在4小时的时间范围内，0.5 μM浓度的CNP7可占据HEK293T细胞中超过70%的催化半胱氨酸残基（图1F）。

**结论**
CNP7是一种强效的首创HMGCS1抑制剂
目前，市场上还没有具有有效选择性和持久效力的HMGCS1抑制剂。因此，我们着手开发HMGCS1的小分子抑制剂。由于HMGCS1的活性位点含有催化半胱氨酸，我们首先查阅了公开可用的半胱氨酸组学数据集，这些数据集报告了反应性半胱氨酸与各种小分子库的结合情况。然而，这些分析并未检测到HMGCS1的Cys129区域，因为包含C129的胰蛋白酶肽长度为46个氨基酸（图S1A）。相反，针对去泛素化酶设计的氰吡咯烷类探针的亲和化学蛋白质组学数据分析将HMGCS1识别为脱靶 hit。受到这些来自独立学术实验室的无偏且一致结果的启发，我们测试了Gersch实验室报道的最简单氰吡咯烷类探针GK16S对HMGCS1的标记。我们使用Hymeglusin-Fluorescein（HG-FL）进行了基于活性的HMGCS1探针分析，该探针特异性与HMGCS1的C129结合并形成共价键（图S1B）。结果表明，HMGCS1 ～ HG-FL加合物在凝胶中显示出荧光信号，从而允许我们在体外和细胞中测量小分子处理后的HMGCS1催化半胱氨酸水平。将重组HMGCS1与GK16S孵育1小时后，HG-FL对催化半胱氨酸的标记减少，表明HMGCS1的催化半胱氨酸被GK16S占据，尽管效率较低（图S1C）。基于细胞的分析证实，GK16S与野生型HMGCS1共价结合，但不与HEK293T细胞中表达的C129A突变体HMGCS1结合，证实了其对Cys129的特异性反应。

我们进一步开发了氰吡咯烷类衍生物以提高标记HMGCS1的效率。HMGCS1具有一个疏水结合口袋，可以容纳两种不同的底物：乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A（图S1E）。这一观察表明，在GK16S的4-戊炔-1-胺上添加一个大的疏水基团可能会增强整体结合能力。因此，我们合成了具有不同疏水性的CNP分子，并使用HG-FL基于活性的探针在体外比较了它们的结合效率（图1A–C）。在苯基位置引入甲基（CNP3和CNP4）提高了催化半胱氨酸的标记效率，而在苯基位置引入甲基并采用S构型几乎消除了结合，而采用R构型则保持了HMGCS1的标记效率。用萘基取代CNP1中的苯基（CNP5和CNP6）并未增强标记效果，而用联苯基取代苯基（CNP7和CNP8）显著提高了催化半胱氨酸的结合效率。CNP7在这种体外分析中显示出最高的标记效率，这与通过将HEK293T细胞与CNP化合物孵育后进行裂解和HG-FL处理所评估的细胞内标记效率相符（图1D,E）。HG-FL分析的结果表明，在4小时的时间范围内，0.5 μM浓度的CNP7可占据HEK293T细胞中超过70%的催化半胱氨酸残基（图1F）。

**先前研究**
我们之前报告称，Hymeglusin的血清稳定性较差，限制了其在组织培养或动物研究中的使用。我们直接比较了Hymeglusin和CNP7的血清稳定性，方法是在将它们添加到HEK293T细胞之前，先在含有或不含胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中预孵育它们。随后的活性分析显示，即使在含有血清的培养基中预孵育16小时后，CNP7仍能强烈地与HMGCS1反应，而Hymeglusin完全失去了对HMGCS1的反应性（图1G）。一致地，CNP7对HMGCS1的标记在多种细胞系中孵育24小时后仍然存在（图1H,I）。

**双重活性分析评估CNP衍生物的效力和选择性**
每种合成的CNP分子都含有一个炔基，这为基于点击化学的蛋白质组学分析提供了功能基础。用CNP7处理细胞后，我们将细胞裂解物分为两部分：一部分用HG-FL处理以评估细胞内HMGCS1的占据情况；另一部分与偶联有四甲基罗丹明（TMR）或荧光素（FL）的叠氮化物探针进行点击化学反应，以评估选择性（图2A）。CNP7在60分钟内占据了HMGCS1的催化半胱氨酸位点，并观察到三种不同分子量的TMR信号同时增加（图2B）。在57 kDa附近观察到的主要TMR信号与抗HMGCS1抗体反应的条带一致（图2C）。为了提高CNP7的选择性，我们进一步对靠近氰吡咯烷基头部的区域进行了衍生化处理（图2D）。后续分析显示，CNP9或CNP11并未降低其效力，而CNP9的非对映异构体（CNP10）或在吡咯烷环上添加大取代基（CNP12和CNP13）显著减少了HMGCS1的标记（图2E）。双重活性分析显示，CNP11处理进一步增加了25 kDa附近的条带强度，而CNP9则降低了这一强度（图2F）。然而，CNP9在HMGCS1上的结合能力略低于CNP7（图2G,H）。

图2. 基于双重活性的CNP衍生物分析，以评估其在细胞中的反应性和选择性。(A) 正交凝胶内荧光分析的工作流程。用溶剂（DMSO）或CNP分子处理的细胞被裂解并分成两部分；一部分与HG-FL孵育以评估HMGCS1的标记效力，另一部分则进行铜催化的[3 + 2]环加成反应（点击化学）与四甲基罗丹明（TMR）或荧光素（FL）-叠氮化物反应，以测试其对蛋白质组的反应性。(B) 用CNP7（0.5 μM）处理293T细胞在指定时间点的正交凝胶内荧光测定。箭头：潜在的CNP7结合剂。(C) 用CNP7（0.5 μM）处理293T细胞1小时后，进行点击反应与TMR-叠氮化物反应，随后进行凝胶内荧光测定和用HMGCS1抗体的免疫印迹。Revert：总蛋白染色。(D) CNP7衍生物的化学结构。(E) 用指定化合物（0.5 μM）处理293T细胞的基于HG-FL的凝胶内荧光测定。(F) 用指定化合物（0.5 μM）处理293T细胞4小时后，进行点击化学与FL-叠氮化物反应，然后进行免疫印迹。(G) 用指定浓度的CNP7或CNP9处理293T细胞的基于HG-FL的活性分析。(H) 来自G组生物重复实验的相对荧光强度的量化（平均值±标准差）。

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互补亲和质谱学揭示了CNP7和CNP9对HMGCS1的卓越选择性

为了识别CNP7和CNP9的共价相互作用物，我们首先通过点击化学将它们与生物素结合，然后通过链霉亲和素富集和串联质谱标签（TMT）进行定量（图S2A）。质谱分析量化了835种蛋白质的相对富集情况（图S2B和表S1）。CNP7和CNP9分别富集了12种和10种蛋白质，其中HMGCS1在两种情况下都显示出最强的富集。其他富集的蛋白质包括醛脱氢酶的一个亚家族成员和Cathepsin Z（一种半胱氨酸蛋白酶）。一些蛋白质，包括醛脱氢酶、DESI1、NIT1和PARK7，之前通过基于点击化学的亲和纯化质谱法被鉴定为含有氰吡咯烷基分子的相互作用物。然而，这种传统的亲和纯化质谱数据缺乏关于每种蛋白质被CNP探针整体结合百分比的信息，并且富集结果可能受到HEK293T细胞中蛋白质丰度的影响。此外，我们观察到某些CNP-蛋白质加合物的凝胶内荧光信号强度会根据点击反应条件的不同而变化，包括还原剂的选择和连接到叠氮化物的染料（图S2C,D）。即使细胞用DMSO处理，我们也检测到ISOC1在链霉亲和素珠洗脱液中的富集（图S2E,F），这解释了图S2B中ISOC1向左移动的现象。这表明点击试剂存在先前被忽视的背景效应，此外还有早期报告指出，在添加炔烃探针时点击化学会形成硫代三唑蛋白结合物。总体而言，我们的发现表明，在化学蛋白质组学中使用点击化学可能会导致多个阶段的假象，这与氰吡咯烷基探针的反应性无关。

为了克服这些限制，我们合成了生物素功能化的CNP7和CNP9探针，并进行了绕过点击反应的竞争性AP-MS分析（图3A和表S2及S3）。HEK293T细胞先用DMSO、CNP7或CNP9预处理，然后裂解并与相应的CNP-生物素探针孵育。在482种被量化的蛋白质中，DMSO预处理细胞中有6种蛋白质显著富集，而CNP7或CNP9预处理细胞中有5种蛋白质显著富集（图3B）。同样，HMGCS1在这两种情况下都被检测为强富集的蛋白质之一。值得注意的是，一些早期通过直接AP-MS发现的蛋白质，如醛脱氢酶9家族成员A1（ALDH9A1）和去SUMO化异肽酶（DESI1），在这种竞争性AP-MS分析中变化不大，表明这些蛋白质中只有少量与CNP探针相互作用。接下来，我们通过免疫印迹验证了竞争性AP-MS分析中鉴定出的所有蛋白质（图3C,D）。重要的是，将输入、洗脱和流过部分并排比较提供了额外的信息。首先，在DMSO预处理的细胞中，大部分HMGCS1被CNP-生物素捕获，而在CNP预处理的细胞中几乎没有观察到富集。ISOC1表现出与HMGCS1相似的模式，但在洗脱液中的富集程度较低，这证实了我们对这两种蛋白质的竞争性AP-MS结果。其次，BTD、ALDH1A2、ALDH1B1和ERP44在洗脱液中的富集程度出乎意料地低，无论是否经过CNP预处理，这表明它们是低占据率的结合剂，只有少量的细胞池与CNP7/9-生物素探针结合。由于竞争性AP-MS分析仅比较洗脱液中的富集蛋白质，并使用基于TMT的质谱法，因此得到的比率可能会被人为夸大。

基于这一意外发现，我们认为比较竞争性亲和纯化步骤的输入和流过部分（我们称之为竞争性清除质谱分析）可以帮助消除AP-MS数据中的低占据率结果，并提供额外的互补见解（图3E和表S4及S5）。实际上，CNP7-生物素清除质谱数据显示HMGCS1显著减少（图3F，左侧）。CNP9-生物素也显著减少了HMGCS1的量，其次是ISOC1和BTD（图3F，右侧）。这些蛋白质组学发现与免疫印迹结果一致，而在直接和竞争性AP-MS中鉴定出的其他蛋白质没有显著减少。总体而言，清除质谱分析表明CNP7和CNP9都强烈靶向HMGCS1，而在相同条件下其他蛋白质如BTD和ISOC1的标记程度较低。

CNP7和CNP9的热蛋白质组学分析证实了它们对HMGCS1的选择性

基于亲和力的富集方法对于检测强小的分子相互作用物（如通过共价相互作用介导的相互作用物）是有效的，但它们可能会忽略弱或非共价相互作用物。为了全面评估CNP7和CNP9的相互作用物，我们使用了蛋白质组积分溶解度改变（PISA）分析，该方法可以检测小分子处理在广泛温度范围内引起的热稳定性变化（图4A,B和表S6及S7）。来自HEK293T和HCT116裂解物的可溶性部分，无论是否用CNP（10 μM）处理，都经过热梯度处理，然后合并样品并使用基于TMT的质谱法进行分析（图4B）。由于PISA比较的是曲线下的面积，因此与使用单一温度相比，它提高了识别相互作用物的能力。质谱分析量化了HEK293T细胞中的5218种可溶性蛋白质和HCT116细胞中的6533种可溶性蛋白质（图4C–D和S3A–C）。在这些蛋白质中，HMGCS1在用CNP7和CNP9处理的两种细胞系中都保持稳定。此外，磷酸二酯酶6D（PDE6D）在CNP7和CNP9处理下也保持稳定，尽管在我们之前的基于亲和力的蛋白质组学分析中未被鉴定为相互作用物。对HEK293T细胞的可溶性部分进行热梯度处理后的免疫印迹显示，HMGCS1和PDE6D在5 μM时显著稳定，其中HMGCS1的稳定效果尤为明显（图4E）。将CNP7的浓度降低到0.5 μM后，HMGCS1仍然保持稳定，但对PDE6D的稳定效果较差（图4F）。由于PDE6D具有一个疏水口袋，可以结合烯丙基探针，因此CNP7和CNP9可能在高浓度下通过非共价相互作用与PDE6D的疏水口袋结合。总之，无偏的PISA分析表明CNP7和CNP9主要且强烈地结合HMGCS1。它们也可能与非共价方式与其他细胞蛋白质如PDE6D和RIOK2相互作用。然而，需要直接的结合实验来确认这些相互作用。

基于这一意外发现，我们认为比较竞争性亲和纯化步骤的输入和流过部分（我们称之为竞争性清除质谱分析）可以帮助消除AP-MS数据中的低占据率结果，并提供额外的互补见解（图3E和表S4及S5）。实际上，CNP7-生物素清除质谱数据显示HMGCS1显著减少（图3F，左侧）。CNP9-生物素也显著减少了HMGCS1的量，其次是ISOC1和BTD（图3F，右侧）。这些蛋白质组学发现与免疫印迹结果一致，而在直接和竞争性AP-MS中鉴定出的其他蛋白质没有显著减少。综上所述，清除质谱分析表明CNP7和CNP9都强烈靶向HMGCS1，而在相同条件下其他蛋白质如BTD和ISOC1的标记程度较低。

CNP7和CNP9的热蛋白质组学分析证实了它们对HMGCS1的选择性

基于亲和力的富集方法对于检测强小的分子相互作用物（如通过共价相互作用介导的相互作用物）是有效的，但它们可能会忽略弱或非共价相互作用物。为了全面评估CNP7和CNP9的相互作用物，我们使用了蛋白质组积分溶解度改变（PISA）分析，该方法可以检测小分子处理在广泛温度范围内引起的热稳定性变化（图4A,B和表S6及S7）。来自HEK293T和HCT116裂解物的可溶性部分，无论是否用CNP（10 μM）处理，都经过热梯度处理，然后合并样品并使用基于TMT的质谱法进行分析（图4B）。由于PISA比较的是曲线下的面积，因此与使用单一温度相比，它提高了识别相互作用物的能力。质谱分析量化了HEK293T细胞中的5218种可溶性蛋白质和HCT116细胞中的6533种可溶性蛋白质（图4C–D和S3A–C）。在这些蛋白质中，HMGCS1在用CNP7和CNP9处理的两种细胞系中都保持稳定。此外，磷酸二酯酶6D（PDE6D）在CNP7和CNP9处理下也保持稳定，尽管在我们之前的基于亲和力的蛋白质组学分析中未被鉴定为相互作用物。对HEK293T细胞的可溶性部分进行热梯度处理后的免疫印迹显示，HMGCS1和PDE6D在5 μM时显著稳定，其中HMGCS1的稳定效果尤为明显（图4E）。将CNP7的浓度降低到0.5 μM后，HMGCS1仍然保持稳定，但对PDE6D的稳定效果较差（图4F）。由于PDE6D具有一个疏水口袋，可以结合预烯基化或法尼基化的蛋白质，因此CNP7和CNP9可能在高浓度下通过非共价相互作用与PDE6D的疏水口袋结合。总之，无偏的PISA分析表明CNP7和CNP9主要且强烈地结合HMGCS1。它们也可能与非共价方式与其他细胞蛋白质如PDE6D和RIOK2相互作用。然而，需要直接的结合实验来确认这些相互作用。

图4. 使用CNP7的蛋白质组积分溶解度改变（PISA）分析。(A) PISA分析的示意图。(B) HEK293T或HCT116细胞裂解物未经处理或用CNP7（10 μM）或CNP9（10 μM）处理15分钟后，应用热梯度。然后合并样品，离心，消化，并用TMTpro标记进行质谱分析。(C, D) 图C显示了从HEK293T细胞分析的–log10(p值)与log2转换后的CNP7/DMSO（左）或CNP9/DMSO（右）处理细胞的火山图。双侧Welch’s t检验（调整为1% FDR进行多次比较，S0 = 1）。(C, D) 如图A所述处理的293T细胞用指定的抗体进行检测。Rep：重复实验。(E) 竞争性清除质谱的工作流程。(F) –log10(p值)与log2转换后的CNP7/DMSO（左）或CNP9/DMSO（右）比率的火山图。每种蛋白质的流过（FT）的TMT信号被标准化为输入信号。n = 3或4个生物重复实验。p值通过双侧Welch’s t检验计算（调整为1% FDR进行多次比较，S0 = 1）。

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基于这一发现，我们认为比较竞争性亲和纯化步骤的输入和流过部分（我们称之为竞争性清除质谱分析）可以帮助消除AP-MS数据中的低占据率结果，并提供额外的互补见解（图3E和表S4及S5）。实际上，CNP7-生物素清除质谱数据显示HMGCS1显著减少（图3F，左侧）。CNP9-生物素也显著减少了HMGCS1的量，其次是ISOC1和BTD（图3F，右侧）。这些蛋白质组学发现与免疫印迹结果一致，而在直接和竞争性AP-MS中鉴定出的其他蛋白质没有显著减少。总之，清除质谱分析表明CNP7和CNP9都强烈靶向HMGCS1，而在相同条件下其他蛋白质如BTD和ISOC1的标记程度较低。

CNP7和CNP9对HMGCS1的选择性得到了热蛋白质组学分析的确认

基于亲和力的富集方法对于检测强小的分子相互作用物（如通过共价相互作用介导的相互作用物）是有效的，但它们可能会忽略弱或非共价相互作用物。为了彻底评估CNP7和CNP9的相互作用物，我们使用了蛋白质组积分溶解度改变（PISA）分析，该方法可以检测小分子处理在广泛温度范围内引起的热稳定性变化（图4A,B和表S6及S7）。来自HEK293T和HCT116裂解物的可溶性部分，无论是否用CNP（10 μM）处理，都经过热梯度处理，然后合并样品并使用基于TMT的质谱法进行分析（图4B）。由于PISA比较的是曲线下的面积，因此与使用单一温度相比，它提高了识别相互作用物的能力。质谱分析量化了HEK293T细胞中的5218种可溶性蛋白质和HCT116细胞中的6533种可溶性蛋白质（图4C–D和S3A–C）。在这些蛋白质中，HMGCS1在用CNP7和CNP9处理的两种细胞系中都保持稳定。此外，磷酸二酯酶6D（PDE6D）在CNP7和CNP9处理下也保持稳定，尽管在我们之前的基于亲和力的蛋白质组学分析中未被鉴定为相互作用物。对HEK293T细胞的可溶性部分进行热梯度处理后的免疫印迹显示，HMGCS1和PDE6D在5 μM时显著稳定，其中HMGCS1的稳定效果尤为明显（图4E）。将CNP7的浓度降低到0.5 μM后，HMGCS1仍然保持稳定，但对PDE6D的稳定效果较差（图4F）。由于PDE6D具有一个疏水口袋，可以结合预烯基化或法尼基化的蛋白质，因此CNP7和CNP9可能在高浓度下通过非共价相互作用与PDE6D的疏水口袋结合。总之，无偏的PISA分析表明CNP7和CNP9主要且强烈地结合HMGCS1。它们也可能与非共价方式与其他细胞蛋白质如PDE6D和RIOK2相互作用。然而，需要直接的结合实验来确认这些相互作用。

图4. 使用CNP7的蛋白质组积分溶解度改变（PISA）分析。(A) PISA分析的示意图。(B) HEK293T或HCT116细胞裂解物未经处理或用CNP7（10 μM）或CNP9（10 μM）处理15分钟后，应用热梯度。然后合并样品，离心，消化，并用TMTpro标记进行质谱分析。(C, D) 图C显示了从HEK293T细胞分析的–log10转换后的p值与log2转换后的CNP7/DMSO比率，图D显示了HCT116细胞的比率。n = 6个生物重复实验用于DMSO处理条件，5个用于CNP7处理条件。p值通过双侧Welch’s t检验计算（调整为1% FDR进行多次比较，S0 = 0.285）。(E, F) 通过免疫印迹验证用CNP7处理HEK293T裂解物后的HMGCS1和PDE6D的热稳定性变化。总蛋白通过revert染色评估，表明由于应用热梯度导致可溶性蛋白质组的丢失。

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我们试图表征CNP7如何结合HMGCS1，以更好地理解其特异性。重组人HMGCS1蛋白与CNP7孵育形成HMGCS1 ～ CNP7加合物，通过HG-FL测定达到90%的标记率，然后进行冷冻电镜（cryo-EM）网格制备。单粒子冷冻电子显微镜（cryo-EM）分析以2.29 ?的分辨率揭示了复合结构（图5、S4和表S8）。两个HMGCS1单体形成了具有C2对称性的同二聚体复合体，如先前报道的那样，CNP7出现在HMGCS1的疏水口袋中靠近Cys129的位置（图5A,B）。CNP7的氰胺基团与催化性的Cys129发生了反应，这与我们的生化测定结果一致（图5C）。Cys129的骨架酰胺和Ser377的羟基靠近，可能形成氢键，形成一个“氧阴离子孔”样的口袋，用于在C129与CNP7的氰基之间反应期间和之后稳定中间体。催化三联体的一部分His264、95Glu-129Cys-264His与CNP7的羰基氧形成强氢键。通过丙炔酰胺、Lys273和Tyr267在催化口袋入口处的氢键进一步有助于稳定CNP7在HMGCS1口袋中的位置（图5D）。这可能解释了含有联苯基的CNP类似物（如CNP7和8）比含有苯基或萘基的类似物具有更好的结合性能。此外，还观察到了CNP7与相邻疏水侧链之间的扩展疏水相互作用（图5E,F）。总结来说，HMGCS1 ～ CNP7加合物的冷冻电镜结构证实了催化半胱氨酸与CNP7形成了共价键，并且HMGCS1和CNP7结合口袋中的亲水性和疏水性相互作用可能有助于在C129反应期间和之后稳定CNP7。图5显示了HMGCS1 ～ CNP7共价加合物的结构：(A) HMGCS1同二聚体（灰色和绿色）与CNP7（粉色）复合物的结构；(B) 表面模型显示CNP7适配到HMGCS1活性位点的腔中；形成异硫脲键的CNP7部分以白色显示；(C) CNP7反应性头部的特写视图，突出显示了被异硫脲氮结合的氧阴离子孔（Cys129和Ser377）；还观察到一个强氢键，其距离为2.4 ?；(D) CNP7的丙炔胺侧面的特写视图，靠近HMGCS1结合口袋的入口，突出显示了丙炔胺与Lys273和Tyr267之间的氢键；(E) CNP7的双苯基基团附近的疏水残基I222、Y225、Y267和L270的特写视图；(F) HMGCS1 ～ CNP7结构中配体结合口袋的2D描绘，突出显示了HMGCS1与CNP7之间的疏水性相互作用。

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CNP7降低细胞内HMG-CoA水平和全局蛋白质预聚化

在确认了CNP7和CNP9的特异性后，我们进行了一系列系统分析以评估HMGCS1抑制在细胞中的药理效应。首先，我们使用一种能够识别被3-羟基-3-甲基戊二酰（HMG）基团修饰的蛋白质的抗体，研究了CNP分子对细胞内HMG-CoA水平的影响，HMG-CoA是HMGCS1的直接产物。先前的研究报告称，用他汀类药物抑制HMGCR会增加细胞内HMG-CoA的水平，这会导致HMG基团与脂肪酸合成酶（FASN）上的亲核侧链通过非酶促反应形成共价键（图6A，顶部）。值得注意的是，HMGylated FASN的水平与细胞内HMG-CoA的水平呈正相关。实际上，在HCT116细胞中添加辛伐他汀后出现了HMGylated蛋白质条带（图6B，前两道泳道）。添加CNP7后，HMGylation显著减少，在48小时内需要5 μM的CNP7才能完全抑制HMGylation（图6B）。这种对CNP7需求的增加归因于由于甲羟戊酸途径抑制而引起的HMGCS1的显著上调，这是一种负反馈机制。同样，在同一细胞提取物上进行的HG-FL标记实验表明，5 μM的CNP7显著结合了HMGCS1的催化半胱氨酸，但仍检测到少量具有催化活性的HMGCS1。

图6显示CNP7处理降低了HMG-CoA水平并减少了全局蛋白质预聚化。(A) 示意图展示了甲羟戊酸途径的流动情况。可以通过免疫印迹法评估下游代谢物的水平变化，例如HMGylated FASN（用于HMG-CoA水平）或蛋白质预聚化状态（用于FPP和GGPP的产生）。(B) 按指示处理的HCT116细胞裂解物与HG-FL探针孵育1小时后，进行凝胶内荧光分析。然后将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，并用相应的抗体进行检测，包括抗HMG抗体以检测HMGylated FASN。HG：Hymeglusin。(C) 作为检测细胞内蛋白质预聚化状态的方法的半胱氨酸组学分析工作流程。(D) – log10转换后的p值与log2转换后的CNP7/DMSO处理细胞衍生的生物素化肽比率之间的火山图。p值通过双侧Welch’s t检验计算（调整至1% FDR进行多重比较，S0 = 1）。统计上显著的条目用红色圈出（15种蛋白质）。其中，含有CAAX基序（香叶基香叶基化位点）的肽用橙色标记，而法尼基化位点用绿色标记。共量化了23085个含半胱氨酸的肽。n = 4个生物学重复实验。(E) 来自同一蛋白质的胰蛋白酶肽的相对TMT信号强度表明，含有CAAX基序的半胱氨酸位点在CNP7处理的细胞中显著富集，而其他位点没有差异。

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接下来，我们研究了HMGCS1抑制如何影响蛋白质预聚化，这是HMG-CoA代谢物的主要去向（图6A，底部）。由于蛋白质的法尼基化和香叶基香叶基化主要针对半胱氨酸侧链，我们推测半胱氨酸组学分析可以检测CNP7引起的全球蛋白质组预聚化状态的变化（图6C）。HEK293T细胞用DMSO或0.5 μM CNP7处理4小时后，进行细胞裂解和生物素-碘代乙酰胺处理。富集后，我们使用基于TMT的蛋白质组学方法量化了23,085个含半胱氨酸的肽，八个样本中都没有缺失值（图6D和表S9）。如前所述，包含HMGCS1 C129的胰蛋白酶肽长度为46个氨基酸，在我们的数据集中未被识别。NIT1 C165是唯一一个在CNP7处理后显著减少的位点，减少了约50%。相反，许多蛋白质的肽显著增加，主要是已知会经历香叶基香叶基化（橙色标记）或法尼基化（绿色标记）的小GTP酶。在香叶基香叶基化底物中，有五种蛋白质的肽被量化超过两个，但只有那些C末端肽含有CAAX基序（标准的香叶基香叶基化位点）的肽在CNP7处理后显示出显著的生物素-碘代乙酰胺标记增加（图6E）。这些数据表明，4小时的CNP7处理导致蛋白质的非预聚化形式积累，而不是它们的整体蛋白质水平增加。总之，半胱氨酸组学分析独特地检测到了CNP7的下游效应：HMGCS1抑制导致的预聚化丧失。这些数据加强了我们的发现，即CNP7可以强烈抑制HMGCS1，从而抑制蛋白质预聚化。

CNP7通过干扰香叶基香叶基焦磷酸代谢来抑制细胞增殖

CNP7是否具有抗增殖作用？在CNP7浓度为5 μM且处理时间为48小时后，HEK293T细胞开始出现细胞死亡，但Hymeglusin对细胞活力没有这种效应（图7A）。菌落形成实验也显示，在CNP7存在下，HCT116菌落的数量和大小显著减少，而Hymeglusin则没有这种效应（图S5A）。向培养基中补充香叶基香叶醇（GGOH），它在细胞内转化为香叶基香叶基焦磷酸（GGPP），完全挽救了由CNP7引起的细胞死亡（图7B）。总体而言，CNP7抑制HMGCS1，从而阻断HMG-CoA和异戊二烯类的合成。这导致HEK293T和HCT116细胞随时间死亡，主要是由于缺乏细胞内的香叶基香叶基焦磷酸，而不是由于固醇耗尽（40?42）。

图7显示了CNP7或辛伐他汀处理后的全局蛋白质组变化。(A) 经过48小时用不同浓度Hymeglusin（HG）、CNP7和辛伐他汀（Statin）处理的293T细胞的细胞活力测定。(B) 通过补充香叶基香叶醇（GGOH）挽救了CNP7导致的293T细胞活力降低。(C) 对用CNP7（5 μM）、辛伐他汀（10 μM）和/或GGOH（10 μM）处理24小时的HCT116细胞进行TMTpro基础的全局蛋白质组分析的工作流程。(D) – log10转换后的p值与log2转换后的CNP7/未处理细胞比率之间的火山图。n = 3个生物学重复实验。双侧Welch’s t检验（调整至1% FDR进行多重比较，S0 = 0.585）。(E) 线性回归图显示了CNP7（x轴）和辛伐他汀（y轴）引起的蛋白质组变化之间的关系。(F) 统计上显著上调的蛋白质的基因本体分析。(G) 甲羟戊酸/固醇途径中蛋白质的倍数变化以热图形式呈现。(H, I) 分别显示了CNP7处理后增加并通过GGOH补充逆转的蛋白质，以及CNP7处理后减少并通过GGOH补充逆转的蛋白质。

为了更好地理解CNP7对全局蛋白质组的影响，我们分析了HCT116细胞在CNP7处理24小时或CNP7和GGOH联合处理后的蛋白质组反应（图7C）。这种方法将区分由香叶基香叶基途径缺陷引起的蛋白质组变化与其他变化。还比较了用辛伐他汀、辛伐他汀与GGOH共同处理的细胞以及仅用GGOH处理的细胞作为对照。随后的多重蛋白质组学分析量化了9277个蛋白质，其中167个蛋白质显著上调，108个蛋白质下调（图7D和表S10）。重要的是，用CNP7和辛伐他汀处理的细胞表现出高度相关的蛋白质组变化，r值为0.8633（图7E）。一致地，显著上调的基因本体分析显示了与固醇相关途径术语的富集，进一步支持了其功能特异性（图7F）。在CNP7或辛伐他汀处理后，甲羟戊酸途径中的几种酶通过反馈效应上调，这些变化通过GGOH共同处理得到了逆转（图7G）。由于GGOH补充逆转了CNP7引起的细胞死亡，我们筛选了已知的香叶基香叶基化靶点，包括Rho、Rab、Rac和Rap蛋白，并检查了它们的蛋白质组水平变化（图S5B）。在量化的86个蛋白质中，RhoA、B和C蛋白在CNP7处理后特别强烈上调，这种上调通过GGOH共同处理得到了逆转（图7H）。相反，一些Rab蛋白在CNP7处理后下调，只有其中一小部分通过GGOH处理得到了逆转（图7I）。其他香叶基香叶基化靶点的丰度没有变化。因此，这些特定的Rho和Rab蛋白的表达水平在CNP7处理后显著改变，并通过GGOH处理得到恢复，可能在CNP7介导的细胞死亡中起作用。总的来说，对CNP7处理后全局蛋白质组的变化的分析支持了其主要通过HMGCS1抑制影响甲羟戊酸途径的作用，并提出了细胞死亡的可能原因。我们注意到，这些细胞实验使用了5 μM的CNP7，这个浓度高于用于选择性分析的0.5 μM。尽管CNP7和辛伐他汀引起的蛋白质组变化之间的强相关性以及GGOH补充的完全挽救支持了靶向活性是细胞死亡的主要驱动因素，但我们不能完全排除在这种较高浓度下非靶向作用的影响。

CNP7对不同细胞系的敏感性

越来越多的研究表明，细胞对辛伐他汀的敏感性因细胞类型而异，其背后的机制复杂，需要进一步的分子研究（8,43）。我们评估了CNP7在18种癌细胞系中的抗增殖作用，并将其与辛伐他汀和Hymeglusin进行了比较，以了解HMGCS1和HMGCR（甲羟戊酸途径中的两个初始酶）抑制后的细胞反应（图8A和S6）。曲线下面积（AUC）的测量表明，Hymeglusin没有不良效应，证实了我们在之前的报告中提到的其在含血清培养基中的低效力（24）。一些对CNP7耐药的细胞系也对辛伐他汀具有抗性，表明对CNP7的耐药性是对甲羟戊酸途径抑制的广泛特征。有趣的是，一些细胞系，如RPE1和MFE296，对CNP7敏感但对辛伐他汀的敏感性较低（图8B）。MM1.S和SNU449细胞系在CNP7或辛伐他汀处理后显示出相似的敏感性曲线，在较低剂量下达到饱和。总体而言，我们的数据揭示了CNP7与辛伐他汀之间的明确模式，以及仅对CNP7敏感的独特反应。未来涉及在CNP7敏感细胞系中遗传耗尽HMGCS1的研究将有助于区分靶向效应和任何潜在的非靶向效应。

图8显示了CNP7抑制的细胞系特异性反应。(A) 用Hymeglusin（HG）、CNP7或辛伐他汀处理72小时后18种癌细胞系活力的曲线下面积（AUC）的热图表示。对CNP7和辛伐他汀都耐药的细胞系用红色突出显示，而对CNP7敏感但对辛伐他汀耐药的细胞系用蓝色突出显示。显示了n = 3个生物学重复实验的平均值。(B) 图A中的三种耐药细胞系（HCT116、HT29和HepG2）和三种敏感细胞系（RPE1、MFE296和MOLM13）的折线图。平均值 ± 标准差（s.d.）代表三次生物学重复实验的结果。(C) 在用1 μM CNP7处理24小时后，评估了三种耐药细胞系（HCT116、HT29和HepG2）和三种敏感细胞系（RPE1、MFE296和MOLM13）的HMGCS1表达情况。高分辨率图像下载 MS PowerPoint幻灯片

为了深入了解CNP7敏感性和耐药性的原因，我们使用免疫印迹法测量了CNP7敏感或耐药细胞系中的HMGCS1水平（图8C）。总体而言，本研究中比较的耐药细胞系表现出较高的稳态HMGCS1水平，并且在CNP7处理后这种水平进一步升高，作为反馈反应。敏感细胞系的基线表达较低，而在CNP7处理后的表达增加不那么明显。我们的综合数据表明，CNP7处理前后HMGCS1的整体表达水平与其敏感性之间存在相关性。然而，需要测试更多的细胞系来加强这一相关性。

结论

在这项研究中，我们采用了全面的蛋白质组学分析来指导选择性HMGCS1抑制剂CNP7的目标识别及其作用机制。结合这些信息可以多角度地了解不同化学蛋白质组学方法在评估共价探针时的优缺点。首先，我们的清除-质谱（scavenging-MS）方法补充了比较型AP-MS技术，后者提供了更广泛的蛋白质组反应性覆盖范围，并有助于排除AP-MS检测到的低亲和力结合。使用CNP探针的PISA数据强调了评估反应性小分子的非共价相互作用物的重要性，因为这些小分子也可能通过非共价相互作用与其他蛋白质结合，而这在开发共价抑制剂时常常被忽视。需要进一步验证，以确定与潜在脱靶蛋白的结合是否会引起功能性反应，因为一些脱靶蛋白可能只是作为沉默性结合物存在。研究探针长期处理后整个蛋白质组的变化可能有助于进行这种评估。最后，使用生物素碘乙酰胺进行的天然半胱氨酸组（cysteome）分析独特地检测到了CNP7的次要效应，即由于HMGCS1抑制导致蛋白质翻译后修饰的丧失。值得注意的是，我们的半胱氨酸组分析并未量化亲和富集蛋白质组学方法所识别的CNP7相互作用物。考虑到理论上存在204,707个含半胱氨酸的胰蛋白酶肽和超过45,000个可配位的半胱氨酸，目前基于碘乙酰胺的半胱氨酸组分析方法在脱靶评估方面的覆盖范围可能有限。(2,44) 总体而言，我们的系统方法成功开发出了第一类HMGCS1抑制剂，这些抑制剂能够与其疏水口袋结合并通过氰胺基团与催化半胱氨酸发生反应。

氰胺类化合物最初在21世纪初被发现可以靶向半胱氨酸蛋白酶，如组织蛋白酶和二肽基肽酶IV。(45?47) 在过去的几年里，多个实验室基于Mission Therapeutics最初的研究结果，专注于开发针对特定去泛素化酶（DUBs）的氰吡咯烷类抑制剂。(29?31,33,48?50) MTX652是一种氰吡咯烷衍生物，能够强烈抑制USP30，目前正在二期临床试验中评估其治疗急性肾损伤的效果，这突显了基于氰吡咯烷的小分子的潜在治疗价值。我们发现，在先前的研究中，HMGCS1常常作为氰吡咯烷探针的脱靶结合物出现。这一发现促使我们开发基于氰吡咯烷的选择性HMGCS1抑制剂，并通过多层次的方法（包括全面的化学蛋白质组学、化学和细胞生物学方法）对其靶标和非靶标效应进行了彻底验证。使用CNP7，我们发现靶向HMGCS1是 statins 的一个有前景的替代方案，并且在特定细胞系中表现出明显的脆弱性。因此，HMGCS1抑制剂不仅为机制研究提供了药物工具，还通过干扰甲羟戊酸途径展示了作为抗癌治疗的潜力。我们的研究结果强调，针对同一代谢途径中的不同蛋白质会导致不同的细胞反应，从而影响治疗结果，这突显了开发针对该途径中个别代谢酶的小分子工具的必要性。这一观察结果可能与Raf、Ras和MEK的小分子抑制剂类似，每种抑制剂都会产生不同的细胞效应。

尽管我们的数据表明CNP7和CNP9对HMGCS1具有高度选择性，但仍存在一些局限性。首先，我们发现CNP7也会标记其他目标，尽管程度较低。值得注意的是，在竞争性质谱和清除质谱方法中，多种醛脱氢酶家族成员的表达有所增加。提高CNP7的选择性和效力可以进一步减少脱靶效应。我们认为，我们获得的CNP7与HMGCS1结合的2.29 ?冷冻电镜（cryo-EM）结构可以为优化这一过程提供有用的信息。其次，CNP7的细胞系特异性敏感性（与statins不同）很有趣，可能涉及多种因素，包括在这些实验中使用的高浓度下的潜在脱靶效应。这需要在我们研究的19种细胞系之外进行更多的后续研究，并进行机制研究。第三，氰吡咯烷与半胱氨酸残基形成的异硫脲加合物在非变性条件下部分可逆。我们在体外观察到游离催化半胱氨酸的缓慢恢复（图S7A–C），而HMGCS1 ～ CNP7加合物的可逆性可能在基于亲和力的蛋白质组学样品制备过程中引入假象（图S7D,E）。这种可逆性对持续目标结合的影响程度需要进一步研究。尽管存在这些局限性，CNP7仍将是研究HMGCS1独特药理作用的宝贵工具，为将其作为单药或与statins联合使用开辟了许多可能性。