利用定量DIC显微镜技术理解支撑脂质膜重塑为管状网络的机制

《Langmuir》：Understanding the Mechanisms of Supported Lipid Membranes Reshaping into Tubular Networks Using Quantitative DIC Microscopy

　　高质量图像下载 MS PowerPoint 幻灯片

生物膜以多种结构模式存在，从脂质双层到管状纤维和网络，这些结构有助于细胞间的粘附和通信。为了理解这些系统中脂质-脂质相互作用背后的生物物理过程，合成膜模型至关重要。在这里，我们展示了在玻璃基板上由受控脂质组成的支撑脂质膜形成管状网络的过程。我们使用定量差分干涉对比（qDIC）技术测量了管子的半径，并提出了一种生物物理机制来解释这些结构的形成，该机制受表面张力和与相连支撑膜的脂质交换的调控。研究了两种脂质类型：1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷胆碱（DOPC）和1,2-十五烷酰-sn-甘油-3-磷胆碱（DC15PC），它们在室温下分别呈现液态无序相和固态有序相。我们研究了管子形成与温度的关系，发现当 DC15PC 从液态转变为固态时，双层结构会回缩并折叠成管状，这可以通过脂质转移到支撑的单层膜上来解释。这一新的模型系统揭示了控制脂质膜重塑为管状结构的脂质-脂质相互作用的生物物理学原理，这对于理解生物膜纤维非常重要。

引言

在探索细胞膜的生物物理性质的过程中，合成膜模型系统的开发具有显著的影响。这些模型系统（1）能够模拟具有定义好组成的脂质双层膜，从而单独研究膜的内在行为，为了解细胞活动提供了关键见解，包括膜融合、（2）膜波动、（3）膜蛋白的行为，以及（4）脂质分离成相分离的筏域。（5）最常用的两种膜模型系统是合成单层囊泡（1）和支撑脂质双层（SLB），（1）它们分别作为特定类型细胞结构的类似物。小型单层囊泡（SUV）的直径为数十到数百纳米，在结构上类似于生物囊泡，而较大的巨型单层囊泡（GUV）以及平面 SLB 可以再现细胞质膜的微弱曲率。此外，朗缪尔单层膜（6）和大型单层囊泡（LUV）（2）可用于研究这些平面或轻微弯曲几何形状下的膜生物物理学。然而，自然界中存在的一种膜排列形式——脂质双层管——至今仍然难以研究。

管状膜连接细胞，促进细胞间的运输和通信，例如神经元的轴突和树突。（7）管状膜也作为参与粘附和细胞运动的突出纤维存在，（8）以及作为纤毛来推动液体、推动细胞和形成感觉受体。（9）在细胞内部，管状结构存在于高尔基体（10）和内质网（ER）等细胞器中。（11）它们是动态网络的一部分，其中包括扁平的囊泡（称为囊泡体），其中管状结构会随时间重新排列，而其他部分则是静态的，有多个管状结构相互交叉的节点。（12）这些细胞器中的新管状结构通常是由膜与细胞骨架之间的机械相互作用形成的，（10）同样，在模型膜系统中，管状结构往往也是对外部扰动的响应而形成的。这种扰动可能是物理性的，如拉伸（13）或压缩（14）膜，或者是化学性的，如膜上的渗透梯度（15）或从一个叶片中耗尽脂质（16）。

已报道的脂质双层管模型系统是从 GUV 开始的。例如，可以通过生物素-亲和素结合将 GUV 外膜的一部分粘附到固体基底上，然后拉离 GUV，（13）留下 GUV 与基底之间的管状连接。也可以使用微操作器控制的碳纤维将 GUV 分割成两个通过管子连接的 GUV。（17,18）虽然这些方式形成的管状膜长度可控，但它们的独立性质限制了可应用的表征技术范围。例如，通常用于研究脂质双层的表面敏感方法（如原子力显微镜（AFM）很难应用于无支撑的结构。因此，支撑的管状膜提供了一个有前景的替代方案。

之前已经通过在钝化玻璃表面上从干脂质薄膜中进行流驱动挤出制备了数十微米长的直支撑膜管，并用于研究膜裂变。（19）在我们之前的工作中，（20）我们展示了在玻璃基底上旋涂干脂质薄膜后进行轻微湿润可以自发生成管状网络。我们认为管状结构的形成是由于旋涂过程创建的双层结构的表面粘附性和复杂拓扑结构以及随后的水合作用。这些网络保持表面附着，并且在几分钟到几小时的时间内稳定，非常适合使用多种实验方法研究管状双层结构。我们还证明了 qDIC 是一种非侵入性的光学显微镜技术，能够以亚纳米级的精度定量成像纳米级结构，如脂质双层厚度和单个纳米颗粒的大小。（20,21）

基于这些早期研究，我们在这里研究了使用受控脂质类型（即分别在室温下呈现液态无序相 Ld 和固态有序相 So 的 DOPC 和 DC15PC）形成的支撑管状网络。我们应用 qDIC 对数百个管子的半径进行了量化，以确保统计显著性。除了尺寸外，qDIC 还对双折射敏感，提供了关于光学分辨率以下的管状结构三维空间排列的信息，并揭示了各种几何形状。我们提出了一种生物物理机制来解释这些结构的形成，该机制受表面张力和与相连支撑脂质双层的脂质交换的调控。

材料与方法

未经荧光标记的脂质，即 DOPC 和 DC15PC，从 Avanti Polar Lipids（Alabaster, 美国）获得，可以是粉末形式或预先溶解在氯仿中，使用时无需进一步纯化。对于荧光标记，使用 ATTO-TEC（Siegen, 德国）提供的 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷乙醇胺（DOPE）标记有 ATTO488。氯仿、乙腈和 2-丙醇从 Sigma-Aldrich（St Louis, 美国）获得，纯度达到 HPLC 级或更高。

**旋涂**

SLB 是在玻璃盖玻片上使用 Mennicke 和 Salditt 开发的旋涂程序制备的，（22）并在我们之前的工作中进行了描述。（20）24 × 24 mm2 的 #1.5 盖玻片（Menzel-Gl?ser, 德国）首先用浸有丙酮的洁净室纸擦拭，然后为了去除任何残留的有机物质并使玻璃表面亲水，在 3:1 (v/v) 的硫酸和 30% 过氧化氢（Piranha 溶液）中在 95 °C 下蚀刻 1 小时。最后将盖玻片用蒸馏水冲洗，在氮气流下干燥，并在 4 °C 下储存，使用前不超过 2 周。

旋涂前，将脂质溶液加入到盖玻片的中心，使其充分润湿玻璃表面。选择溶剂类型是为了通过旋涂促进双层结构的形成。（23）对于在室温下形成均匀 Ld 相双层的脂质，使用 95:5 (v/v) 的氯仿和乙腈混合物；而对于在室温下形成 So 相的脂质混合物，则使用 2-丙醇。溶液体积的选择是为了完全润湿表面，取决于溶剂和玻璃基底的亲水性，通常氯仿/乙腈混合物约为 300 μL，2-丙醇约为 150 μL。

旋涂是在空气中进行，使用 Laurell WS-650-23 旋涂仪，转速为 3000 rpm，加速和减速步骤各为 6 秒，从而在盖玻片上留下干脂质膜。使用的脂质浓度在 0.8 至 1.2 mg/mL 之间，调整后水化后的膜主要为单层，但仍有一些间隙和双层区域。除非另有说明，否则脂质中掺入了 0.1 mol% 的 ATTO488-DOPE 用于荧光成像。这些参数的详细开发过程在参考文献（23）中有所介绍。

旋涂后，脂质涂层的盖玻片 undergoes 一个预补水步骤，在 100% 氮气环境中于 37 °C 下 incubated 1 小时。预补水是为了促进表面形成脂质双层，避免直接接触大量液体水或流动，从而防止脂质被冲入液体体积中。接下来，脂质涂层的盖玻片在 100% 氮气环境中冷却至室温约 1 分钟。最后，将脂质涂层的面轻轻放置在装有室温磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液的载玻片上，形成一个高度为 120 μm 的液体腔室，其中脂质完成重新组织。

**成像**

样品的成像方法如前所述。（20）简要来说，使用了一台改装过的 Nikon Ti–U 倒置显微镜，配有一个 0.75 NA 的 20× 物镜（Nikon CFI Plan Apo Lambda MRD00205）和一个 1.5× 的管状透镜，相机放大倍数为 30×。图像由 Hamamatsu Orca 285 CCD 相机捕获（传感器尺寸 1344 × 1024，像素尺寸 6.45 μm，满井容量 18 ke，读取噪声 7 电子，零增益下每个计数为 4.6 电子，12 位数字化），样品上的相应像素尺寸为 216 nm。显微镜舞台被封闭在一个密封的培养箱内，该培养箱连接到一个 Life Imaging Systems Cube2 加热单元，可以控制样品的温度；除非另有说明，否则测量在室温下进行。

对于荧光测量，使用了一台金属卤化物高压灯（Prior Lumen 200），配备了一个 epifluorescence 照明器（Nikon Ti-FL）、滤镜转塔（Nikon Ti-FLC）和滤镜立方体（Semrock GFP-A-BASIC，激发波长 35 nm，中心波长 469 nm，发射波长 39 nm，中心波长 525 nm）。曝光时间为 1 或 2 秒。对于差分干涉对比（DIC），使用了一台 100 W 的卤素灯（Nikon Ti-DH D-LH/LC）和绿色干涉滤镜（Nikon GIF），提供以 550 nm 为中心的照明波长和半高宽（FWHM）为 53 nm。此外，还使用了一个 Schott BG40 滤镜来去除 GIF 未充分阻挡的 650 nm 以上的波长。照明光随后通过一个 de-Sénarmont 补偿器（一个可旋转的线性偏振器和四分之一波片，Nikon T-P2 DIC Polarizer HT MEN51941）传输到样品上，并通过一个 0.72 NA 的聚光器（Nikon CLWD MEL56100）聚焦。我们使用了 Nikon N2 棱镜，其剪切分离为 s = 238 ± 10 nm（物镜使用 MBH76220 滑块，聚光器使用 MEH52400 模块）。

**定量差分干涉对比（qDIC）**

定量差分干涉对比（qDIC）允许从标准 DIC 图像对生成定量相位图，具体细节在我们的先前工作中有所介绍。（20,21,24）简要来说，首先在相反的 de-Sénarmont 偏振角（I+ 为 + θ，I– 为 – θ）下拍摄一对 DIC 图像，然后使用这些图像生成对比图像 ??c=??+??????++???Ic=I+?I?I++I?（1），从中可以通过 ??c=sin(2??)sin(??)cos(2??)cos(??)?1 计算样品的相位差 δ，然后使用 （21）将其重新排列为解析表达式以确定 δ。然后通过对 δ(r) 沿剪切方向进行积分，并使用 Wiener 滤波器得到样品的定量相位图 ?(r)，同时使用一个信号噪声参数 κ 来创建空间频率的高通截止。为了减少这种积分产生的条纹效应，可以使用 Regan 等人提出的最小化算法来惩罚空间梯度（21）。

**结果与讨论**

**DOPC 脂质的双层结构**

如我们之前的工作（20）所述，旋涂的脂质薄膜在水化后会在玻璃表面上形成薄的“分支状”脂质网络，除了平面脂质双层之外。这些网络是来自旋涂脂质薄膜的自发形成的。图 1 给出了一个支撑的 DOPC 脂质双层堆栈的例子，展示了相位差 δ(r)（a），重建的相位 ?(r)（c）以及荧光图像（b）。我们之前的工作（20）中详细讨论了用于表征平面双层的 qDIC 图像。在这里，我们专注于管状结构的表征。如图1所示，我们观察到这些结构与单层平面双层区域相连（见中等的灰度对比度），并显示出类似双层堆叠的鲜明对比度。图1：(a) 一张qDIC δ(r)图像，显示了一个自旋涂层的DOPC SLB堆叠区域，其中形成了管状网络，尺度从m = ?6 mrad到M = +6 mrad。(b) 相应的荧光图像，尺度从m = 80到M = 260计数。(c) 同一区域以最小化的qDIC相位?(r)图像显示，尺度从m = 0 mrad到M = 20 mrad。(d) 管状的相位轮廓；剖面线在插图中显示。黄色线是使用方程3和所示参数进行拟合的结果，灰色虚线是使用f = 0（即没有双折射）进行拟合的结果。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片。

为了提取定量结构信息，我们取垂直于管方向的线轮廓，如图1d所示。为了减少这些横截面轮廓中的噪声，我们对4到8个像素（0.9到1.7 μm）的宽度进行平均处理。为了最小化qDIC积分伪影的影响，我们只取几乎平行于DIC剪切方向的横截面（关于积分伪影的更多讨论见我们的早期工作(20,21)）。然后使用以下公式对这些横截面进行拟合：??(??)=??[sech2(???????)+??tanh(???????)]+??+????。其中sech2项表示一个小于我们成像系统光学分辨率的结构，因此在相位轮廓中表现为一个峰值。参数a是峰值幅度，b是峰值位置，c是峰值宽度，它衡量了与光学分辨率卷积后的管直径。图像中的局部背景梯度通过线性项d + ex来考虑。tanh项及其相对幅度参数f模拟了双折射的效应，具体细节稍后会有说明。

图1d展示了一个通过管状结构的相位横截面及其对应的拟合示例。通过积分曲线内的面积，我们可以量化横截面中的双层材料量。sech2项的积分结果是2ac。我们可以将这个值转换为相应的双层长度，除以单个双层的光学厚度，该厚度在我们的先前工作中确定为5.73 mrad(20)。对于图1d中显示的结构，我们发现横截面中的脂质双层长度为(1096 ± 57) nm，不确定性给出了拟合的95%置信区间。将观察到的结构归因于圆形管状几何形状，可以得到半径为(174 ± 9) nm，这与它的分辨率限制外观一致。另一种由两个平坦双层堆叠组成的配置需要超过500 nm的宽度才能包含这种量的脂质，而图1d中拟合的峰值宽度接近分辨率限制（c = 325 nm）。

膜具有管状几何形状的进一步证据是相位轮廓中峰值两侧背景水平的轻微不匹配。这是通过方程3中的tanh项来模拟的，前因子f描述了台阶的相对幅度。图1d中的灰色虚线展示了将f设为零时的拟合结果。这种围绕峰值的相位变化可以通过脂质双层的双折射来解释，这些双层对于沿着双层平面偏振的光具有正常折射率（n0 = 1.445），而对于垂直于该平面偏振的光具有异常折射率（ne = 1.460)(25)。在DIC中，两个剪切光束分别沿着和垂直于剪切方向偏振。在管状几何结构中，双层部分地偏离平面，因此对于垂直于剪切方向排列的管子，一个光束沿着管子偏振，只经历n0，而另一个光束垂直于管子偏振，因此经历n0和ne的混合，这取决于管状几何形状。这导致两个光束之间的相位差异，经过积分后产生一个相位台阶。值得注意的是，这种现象在平面双层几何结构中不会发生，因为在平面双层中两个DIC偏振都是同面的。因此，观察到的相位台阶提供了管状几何形状的证据。

扩展图1中显示的区域，我们观察到不同对比度的管状结构，如图2所示，表明管子大小存在变化。我们沿着彩色线条对管状横截面进行了拟合，并在更多视野中也进行了类似的处理（见S9节）。图3e显示了管周长的相位台阶函数，图3f显示了宽度函数的峰值幅度。假设管子是具有圆形截面的单层结构，半径的平均值和标准差为181.8 ± 47 nm，基于n = 125次测量。平均直径364 nm接近衍射极限，与拟合宽度一致。这些支撑管的半径与从GUVs中提取的管子相似(17)，但大于细胞器中管子的典型半径（通常小于100 nm)(10)。为了理解这些差异，可以做出以下考虑。

对于具有圆形截面的管子，半径r由双层的弯曲刚度η和管内的张力σ之间的平衡决定，即：??=??2????????√r=η2σ(4)。弯曲刚度取决于存在的脂质种类以及这些脂质在双层两个叶片之间的相对分布。我们的系统几乎完全由具有较低自发曲率的磷脂（PC）脂质组成(26)。相比之下，生物膜通常含有诱导曲率的蛋白质(10)，以及大量具有高内在曲率的脂质，如磷乙醇胺（PE）(27,28)，它们提供有限的平衡半径r0，从而得出：???1=2??????????√+???10r?1=2ση+r0?1(5)。实际上，之前已经表明，从GUVs中提取的管子如果可以从具有较高自发曲率的PE脂质储存库中获取脂质，管子直径会减小(26)。

管内的表面张力受整体样品几何形状和膜-基底相互作用的影响。与我们类似的模型系统由流动诱导的挤出产生的线性支撑膜管组成，其半径范围为10到40 nm(19)，明显小于我们观察到的相似脂质组成的管子半径。使用qDIC，我们可以探索我们系统内的张力变化，因为在脂质组成恒定的情况下（因此η也恒定），管半径的变化必须对应于张力的变化。在图3e中，我们清楚地看到数据中不同圆周值的分组，围绕650、950和1300 nm聚集，这些对应于在不同样品区域进行的测量。即使在单个视野内，如图2所示，我们也能看到不同圆周值的分组；在左下角，我们看到具有较低圆周值的管子属于650 nm组，而右上角的管子属于950 nm组。这表明管周长反映了SLB内几百微米范围内的膜张力变化（另见支持信息，图S3）。

除了图1中看到的从双层堆叠边缘突出的短而分支的管子外，我们还观察到了具有长直部分的管子。图3a展示了一个例子，其中形成了一个结构独特的管状网络，附着在从左上到右下延伸的SLB带状结构上。这些管子似乎位于双层之上，而不是之下，因为如果它们位于双层之下，会导致双层围绕它们弯曲，这可能会表现为光学厚度的增加。它们的直段长度通常超过10 μm，而玻璃上的管子长度只有几μm，表明管-基底相互作用在塑造管状网络中起着重要作用。我们将玻璃上的较短管子长度归因于玻璃表面上的粘附点，这些点在网络中形成了角或终点。在双层涂层区域中，这些粘附点被屏蔽，允许表面张力形成长直管子。

图3e中展示了在其他双层上形成的管子的拟合结果，以洋红色点显示，再次显示出圆周值的分组。较低组的平均圆周值为1213 nm，标准差为90 nm（n = 27），与同一区域玻璃上的管子圆周值（1332 nm，标准差161 nm，n = 66）相似。这表明这两种类型的管子处于相似的张力下，如果它们是由连续的双层形成的，则是预期之中的。

对于具有圆形截面的管子，半径r由双层的弯曲刚度η和管内的张力σ之间的平衡决定，即：??=??2???????√r=η2σ(4)。弯曲刚度取决于存在的脂质种类以及这些脂质在双层两个叶片之间的相对分布。我们的系统几乎完全由磷脂（PC）组成，它们具有较低的自发曲率(26)。相比之下，生物膜通常包含诱导曲率的蛋白质(10)，以及大量具有高内在曲率的脂质，如磷乙醇胺（PE）(27,28)，它们提供有限的平衡半径r0，从而得出：???1=2??????????√+???10r?1=2ση+r0?1(5)。实际上，之前的研究已经表明，从GUVs中提取的管子如果可以从具有较高自发曲率的PE脂质储存库中获取脂质，管子直径会减小(26)。

管内的表面张力受到整体样品几何形状和膜-基底相互作用的影响。与我们类似的模型系统由流动诱导的挤出产生的线性支撑膜管组成，其半径范围为10到40 nm(19)，明显小于我们观察到的类似脂质组成的管子半径。使用qDIC，我们可以探索我们系统内的张力变化，因为在脂质组成恒定的情况下（因此η也恒定），管半径的变化必须对应于张力的变化。在图3e中，我们可以清楚地看到数据中不同圆周值的不同分组，围绕650、950和1300 nm聚集，这些对应于在不同样品区域进行的测量。即使在单个视野内，如图2所示，我们也可以看到不同圆周值的分组；在左下角，我们看到圆周值较低的管子属于650 nm组，而右上角的管子属于950 nm组。这表明管周长反映了SLB内几百微米范围内的膜张力变化（另见支持信息，图S3）。

除了图1中看到的从双层堆叠边缘突出的短而分支的管子外，我们还观察到了具有长直部分的管子。图3a展示了一个例子，其中形成了一个结构独特的管状网络，附着在从左上延伸到右下的SLB带状结构上。这些管子似乎位于双层之上，而不是之下，因为如果位于双层之下，会导致双层围绕它们弯曲，这可能会表现为光学厚度的增加。它们的直段长度通常超过10 μm，与玻璃上的管子仅几μm的长度相比，表明管-基底相互作用在塑造管状网络中起着重要作用。我们将玻璃上的较短管子长度归因于玻璃表面的粘附点，这些点在网络中形成了角或终点。这些粘附点在双层涂层区域中被屏蔽，允许表面张力形成长直管子。

图3e中展示了在其他双层上形成的管子的拟合结果，以洋红色点显示，再次显示出圆周值的分组。较低组的平均圆周值为1213 nm，标准差为90 nm（n = 27），与同一区域内玻璃上的管子圆周值（1332 nm，标准差161 nm，n = 66）相似。这表明这两种类型的管子处于相似的张力下，如果它们是由连续的双层形成的，则是预期之中的。假设管子的圆形截面为单层结构，直径约为800 nm，这在我们的qDIC显微镜中应该是可分辨的。图3c给出了其中一个管子的例子，相应的相位轮廓和拟合在图3d中以橙色显示。作为对比，图3b中显示了一个较低圆周值的管子，在图3d中以绿色显示。虽然图3c中管子的拟合宽度为417 nm，大于图3b中接近分辨率限制的352 nm宽度，但这对于800 nm直径来说要小得多。因此，我们考虑了图3g中所示的其他管状截面。我们注意到，qDIC相位轮廓的拟合参数，特别是峰值幅度a、宽度c和相位台阶2fa，取决于管子的几何形状。为了识别不同的管子几何形状，我们计算了不同截面的预期相位台阶，如图3e中以彩色线显示。我们还模拟了忽略双折射的空间相位轮廓，并应用了方程3（详见S2节）。结果中的峰值幅度和宽度分别在图3f中显示，包括两种堆叠双层的非管状排列（蓝色线）、具有64.8 nm边缘半径的扁平单层管（深绿色线）、单层管（浅绿色线）、并排排列的一对单层管（橙色线）和具有圆形截面的双层管（红色线）。我们可以看到，在玻璃上形成的管子的峰值幅度通常位于扁平单层双层截面和圆形截面的模拟之间，这可能是由于基底粘附导致的膜略微压缩的结果。我们注意到，图像的轻微失焦会导致宽度增加，这可能解释了双层堆叠模拟结果下方的数据点。当横截面主要由平坦部分组成时，扁平化的膜与双层堆叠几乎没有差异。然而，由于双折射效应（见图3e），这两种配置对于相位步长的预测是不同的，这表明使用qDIC技术我们可以区分这两种情况。双折射数据通常位于圆形横截面（绿线）和扁平化几何形状（深绿线）之间。不过，相位步长的误差（由拟合参数a和f的95%置信区间得出）约为±0.7 mrad，导致数据存在显著差异。回到图3f中的峰值幅度，我们发现位于其他双层上的管状结构（洋红色点，详见图S25中的对应图像及测量位置）分为两个群体。其中一个群体与在玻璃上形成的管状结构一致，表明它们具有相同的结构。另一个群体的峰值明显高于预期的单层圆形横截面双层结构（浅绿线），但低于双层圆形横截面双层结构（红线）。值得注意的是，这个群体分布在红线和橙线之间的一个区域内，橙线代表两个并排的等半径圆形管状结构，如图3g所示。这个区域可以很好地用一对连接在一起的圆形横截面管状结构来描述，这些管状结构从并排排列到堆叠排列不等，其半径由孤立管状结构的平均值（193 nm，深灰色虚线）或上下一个标准差（207或179 nm，浅灰色虚线）给出。因此，qDIC表明这个管状群体不是双层的，而是由相互缠绕的管状结构组成的，类似于扭曲的双绞线。这一解释与图S26中展示的管状结构变化一致。

使用其他技术独立验证这种几何形状是具有挑战性的，因为这些结构处于液态且柔软，在较长时间内不稳定。利用AFM进行相关测量可能会有问题，因为AFM探针会干扰DIC测量，而且探针对管状结构施加的压力可能导致变形，同时内部结构将无法被观察。冷冻电子显微镜需要快速高压冷冻，这可能会因机械冲击和脂质相变而扭曲结构。相比之下，qDIC方法特别适合研究脂质双层结构，因为它具有非接触式几何特性，适合完整的样本。值得注意的是，我们在之前的研究（Hamilton等人，21）中通过与AFM和TEM的比较证明了qDIC方法的定量准确性。

除了表征管状结构本身外，研究管状结构与样品中平面支撑的双层区域相接处的脂质结构也很有趣。我们在图1中看到，从这些管状网络突起的单层双层区域周围似乎有一圈较厚的边界，这些边界在荧光图（图1b）和qDIC相位图（图1c）中表现为对比度更高的线条。图4展示了一个单层区域边界上的相位剖面示例，显示出从裸露的玻璃到单层双层的转变以及边缘处的峰值。

图4：
(a) 具有较高光学厚度的单层区域相位图像。
(b) 边界处提出的横截面拓扑示意图，包含双层三重连接结构。
(c) 指定区域上的相位剖面及其拟合结果。

我们使用方程3对这些边界处的相位剖面进行了拟合，通过将tanh项中的位置b替换为一个额外的参数g来允许双层边缘和管状结构中心的位置独立变化，其中tanh项主要由平面脂质双层的光学厚度决定，而不是管状双折射。在这些拟合中，我们发现边界位置b与双层边缘b–g之间的平均差异在误差范围内为零（32 nm，标准误差为49 nm），表明它们以某种物理方式相连。管状边界结构内包含的双层平均长度为（666 ± 55）nm（n = 24，误差为标准误差）。我们提出边缘管状结构包含一个双层三重连接结构，如图4b所示。我们注意到管状边界结构的长度约为观察到的双层平均长度（861 ± 21）nm（n = 49）的（77 ± 7）%，与假设的几何形状相符，后者缺少一个圆周的四分之一。使用模拟预测边界结构（包括相对长度）并与实验结果进行比较将是有趣的。

DC15PC脂质在相变过程中的双层结构
DC15PC双层在室温下处于So相，并在温度Tm = 33.7°C时从So相转变为Ld相。So相的厚度和脂质分子的面积密度都高于Ld相。SLBs是通过在37°C下预水化，然后冷却几分钟，最后在室温下水化制备的。这些样品随后被安装到预先加热到37°C的Ti–U显微镜中。安装后，样品至少稳定10分钟，然后温度缓慢降低，通常以0.3°C的步长逐渐降低，每间隔10分钟。图5a–f展示了膜双层中发生的形状变化，包括管状结构的形成。

图5：
(a–f) qDIC相位图像显示了DC15PC双层在冷却过程中的形状变化（m = ?33 mrad，M = 23 mrad）。伪彩色表示不同的层状结构：单层（红色）、双层（绿色）和多层（蓝色）。红色圆圈标记选定的膜-表面固定点。未标记的图像见图S19。
(g,h) (a)中蓝色和绿色虚线所示的双层排列示意图。
(i) 沿着双层边缘的相位剖面及其拟合结果，以及相应的相位图像和结构示意图。
(j) 双层到管状重组的机制示意图，分别以平面视图和横截面显示。

图5a显示了在显微镜中加热到36.2°后的双层堆叠的一部分。利用qDIC相位信息，我们识别出一个大的双层区域（用绿色高亮显示），它连接在右侧的一个单层区域（用红色高亮显示）。双层区域由两部分组成，这一点通过两者交汇处的较高相位对比度线可以看出。这种边界的存在表明，在这些双层部分的边缘，双层结构正在向内折叠，如图5g所示。这种折叠阻止了两个区域合并，可以在双层区域边缘的相位剖面中量化。图5i展示了从视野其他位置切割的一条线，连接到同一个单层区域（见图S21），显示出明显的相位峰值，其中双层垂直排列，随后趋于平缓，这是两个双层堆叠的预期结果。因此，这些双层区域可以被视为位于表面的凹陷囊泡，类似于内质网中的囊泡。通过整合图5i中的拟合结果，我们发现该峰值包含558纳米的总脂质长度；假设半圆形横截面，这对应于178纳米的曲率半径。

随着样品的冷却（图5b–f），两个双层区域逐渐收缩。最初，每个双层区域的边缘均匀后退，但随着面积的减小，边缘在某些点被固定，使得这些区域首先呈现多边形，然后变得不规则。图5a–f中用红色圆圈标出了两个这样的固定点。随着双层区域面积的进一步缩小，后退的边缘会遇到更多的固定点，最终双层区域完全重组为连接这些固定点的扁平管状网络。这一过程在图5j中得到了说明，展示了从双层区域（i）到管状结构（iii）的转变。图6提供了这种管状形成过程的另一个示例。更多细节见第S5节。

我们还注意到，虽然双层区域在缩小，但单层区域和双层区域之间的边界位置基本保持不变。换句话说，双层区域本身并没有变成单层，而是双层区域中的两个双层从外缘向内收缩。因此，我们推测单层-双层边界处的结构（见图5a中的绿色虚线）是一个三层连接结构，如图5h所示，与我们之前在图4中展示的类似。然而，其位置似乎固定的现象很有趣，因为人们可能认为这样的三层连接可以移动以减小双层面积。需要考虑的因素包括双层中的封闭水体积和局部几何形状。对这种情况的模拟可能会有所帮助，但目前似乎还没有这样的模拟可用。

观察到的管状形成机制类似于之前提到的方法，即通过将GUV表面的部分附着在固体基底上，然后物理拉动GUV，留下连接GUV和附着点的膜管。（13）有趣的是，在我们的系统中，没有引入额外的分子来将膜脂质结合到玻璃基底上，也没有进行表面钝化处理以防止管状结构塌陷成双层结构（19），或者限制管状结构与基底的相互作用。因此，观察到的效应纯粹是由膜与亲水玻璃表面之间的局部相互作用变化驱动的。

由于图5中显示的管状形成发生在膜的双层区域脂质面积减少的过程中，接下来我们将讨论驱动这种减少的原因。首先，我们注意到未与单层区域连接的双层区域在冷却过程中通常不会发生显著的形状变化。图5b中的星号标记的孤立双层区域就是一个例子，它们的面积保持不变。这些区域中的物质量可以量化（见第S6节）。在减去对相位剖面的二次拟合（考虑每个区域周围的背景）并进行积分后，我们得到了它们的相位面积。对于左上角和左下角的区域，分别在36.2°C时的相位面积为（90.9 ± 6.0）mrad μm2和（893.0 ± 10.3）mrad μm2，而在29.2°C时的相位面积为（101.2 ± 5.8）mrad μm2和（974.1 ± 7.8）mrad μm2。

总的来说，这些观察结果表明，双层区域需要与单层区域连接才能形成管状结构，并表明在冷却过程中脂质会从双层区域迁移到单层区域。作为这种迁移的驱动机制，我们在之前的研究中表明，强烈的双层-表面相互作用会导致上层膜片的拉伸。（20）表面连接的双层显示其厚度减少了约10%，相当于上层膜片面积拉伸了20%，假设这种减少仅由上层膜片的变化引起。这种膨胀对应于大约25毫牛顿/米的张力，使用单层区域弹性系数120毫牛顿/米对于DOPC来说，（32）这提供了下层叶片对玻璃的粘附强度的估计。我们注意到20%的拉伸远高于典型的自由双层断裂阈值，并且根据公式4计算出的管子半径为1.2纳米。因此，我们可以得出结论，表面粘附力要比观察到的管子中的表面张力强得多。因此，我们可以预期单层区域的下层叶片的表面积是固定的，所以在冷却过程中需要更多的脂质来覆盖附着在表面的双层的上层叶片，考虑到So相的较高面积密度。这导致脂质从双层区域的上层叶片通过三重连接处流动到单层区域的上层叶片。预计双层区域之间的脂质交换会随着时间的推移而平衡这种不平衡。反过来，除非双层区域被牢固地锚定（例如在蚀刻玻璃的小凹陷中），否则它们会逐渐从表面被拉掉。这些位置形成了剩余管状结构的末端或角点。有趣的是，单层斑块相对恒定的面积表明，尽管脂质转移到这些区域是为了补偿上层叶片在冷却过程中脂质表面密度的增加，但下层叶片的附着面积保持不变。这表明在旋涂过程中建立的表面相互作用比水合后的相互作用要强得多，这是由于水屏蔽了静电相互作用。因此，单层区域的面积由初始旋涂的脂质薄膜配置决定，而在形成具有圆润边缘的双层结构时，下层叶片可以从表面剥离。相应的更强剥离力的发展类似于机械滑轮的作用，使双层边缘的张力加倍。下层脂质叶片与玻璃的直接接触是由于通过旋涂制备双层结构的结果，在此过程中脂质与极性玻璃表面直接接触，而不会受到水的影响。对于通过SUVs破裂并附着在极性玻璃表面的双层结构来说情况并非如此，因为极性头基团在到达表面时已经与水协调，这导致了广泛报道的约1纳米厚的水层。（33）为了支持直接接触的假设，我们在补充材料S4中展示了一个实验，我们发现在含有2毫摩尔Tris的介质中，这种接触会逐渐丧失。我们观察到脱离前沿，即ATTO488-DOPE的荧光增加，这只有在形成了水层之后才会在下层叶片中出现，为头基团提供了空间。双层区域中脂质损失的另一种可能机制是转移到囊泡中。在DC15PC样品中，我们看到了尺寸低于光学分辨率的小囊泡，以及一些较大的多层囊泡。后者可能靠近正在重新排列成管状的双层区域，如图5a–f所示。然而，这些较大的囊泡在双层区域重新排列成管状之前和之后其脂质含量没有增加（见图S11），排除了显著的转移。膜相变影响预先形成的管状结构的半径，我们通过监测样品冷却到其主要转变温度Tm以下时由DC15PC双层堆叠形成的管的相变剖面的变化来测量这一点。对于这项研究，我们使用了一个表面覆盖率高的样品（大约72%为单层，20%为双层，2%为多层）并且具有整体的均匀结构（见图S14）。这种均匀性有助于最小化由于膜几何形状差异引起的样品中的局部张力变化，因此观察到的任何相变剖面的变化都可以归因于整个样品的全球效应。重要的是，该系统的相行为由单一脂质物种DC15PC的性质决定（0.1摩尔%荧光标记的DOPE的影响可以忽略不计）。因此，预期冷却后管状结构将完全处于So相。然而，之前关于在曲面上SLB的研究表明，几十到几百纳米的曲率可以将Tm降低几度，（34,35），因此管状结构中的相变可能发生在较低的温度。图7显示了当样品以每24分钟0.3°C的步骤冷却时，12个不同管的积分qDIC相变过程。平面双层相变发生的温度范围在相应的荧光图像中可见（见图S13），通过在相变过程中荧光素选择性分配到与So相共存的Ld相中，并在图7中用虚线标出。积分qDIC相量化了管状结构从Ld相变为So相时的演变。在定义的脂质相内，层的光学厚度是已知的，我们可以如前所述将积分qDIC相转换为半径。图7的右轴显示了假设Ld相参数计算出的过渡半径（使用So相参数得出的半径估计值会小21%）。图7。(a,b) 三个不同温度点下的两个管的示例，(i) 31.7 °C，(ii) 29.3 °C，(iii) 27.5 °C。qDIC相位从?14变化到14毫弧度，图像大小为10.8微米平方。(c) 随着样品冷却到其主要相变温度以下，12个DC15PC管的积分相与温度的关系（SLB中的相共存区域由虚线表示）。a和b中显示的管子对应的线条以粗体突出显示。灰色方块显示了仍连接到双层堆叠的管的平均值。右轴给出了假设Ld相参数时的管子半径。显示的温度是显微镜室的目标温度。误差条是管子的标准偏差。有关所有管的图像，请参见图S12。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片如图7b所示，仍然连接到双层堆叠的管子在冷却过程中其积分光学相的演变表现出一致的行为。积分qDIC相位缓慢降低，直到平面双层区域开始发生主要相变，然后急剧下降，在相变温度范围内达到最低点。之后逐渐恢复并在转变完成后趋于平稳。在转变过程中断开的管子，如图7a中所示的粉红线所代表的，则不遵循这种行为。这表明一致的行为是由连接到平面双层结构在之前讨论的相变期间的共同张力驱动的。图7中显示的仍然连接到平面双层的管的平均积分相位以灰色方块表示。在Ld相中，相位面积约为7.8弧度纳米，对应的半径为266纳米。然后随着相变的进行，半径逐渐减小到大约107纳米。转变后，测得的积分相位约为5.2弧度纳米，对应于So相中的半径约为141纳米。为了讨论相变过程中平均半径的变化，我们考虑了公式4。弯曲刚度η将半径缩放为????√η，并且在Tm处达到最小值，这是由于在一级相变附近的软化效应。实际上，对结构相似的脂质DMPC的实验表明，在Tm时η几乎小一个数量级，（5）这将导致半径减小三倍，与观察到的平衡Ld相和相变期间的最小值之间的变化一致。然而，在So相中η大约是Ld相的五倍，（5）因此预计在进一步冷却时半径会增加大约两倍，与我们观察到的30%的半径减小相反。这表明膜张力σ的影响，半径与1/????√1/σ成正比变化。从Ld相冷却到So相后半径大约减少三倍，与从η的变化预期的相比，相当于σ增加了大约九倍。我们回想一下，表现出这种特征形状演变的管子与附着在表面上的单层区域连续。如前所述，我们对管子形成驱动力的理解是，将脂质从薄膜的双层区域中拉出比减少单层区域的表面覆盖率更有能量优势，这是由于双层下层叶片与基底之间的强相互作用。So相中较高的脂质堆积密度驱动单层区域从系统的其他地方拉取脂质以保持它们的表面积，从而导致σ的增加。这与图5中观察到的行为一致，也需要在相变期间增加σ，因为附着在表面的单层区域和双层区域脂质面积的减少。也可以考虑动力学效应，假设在So相中结构被冻结在原地，不允许在观察的时间尺度上进行脂质扩散。如果在相关时间尺度上双层更像是固体而不是液体，那么公式4就不适用。那么在So相中的半径将比预期的要小，仅仅因为冻结后没有更多的脂质可以被输送到管子中。然而，图S13中相变后荧光素的平衡表明在相变后的24分钟内荧光素在几微米范围内发生了扩散，这将允许足够的传输，这与冻结结构的假设相矛盾。结论我们已经证明，通过在固体支撑上旋涂具有控制脂质组成的脂质薄膜可以产生管状结构，并且我们通过定量DIC显微镜对其半径进行了量化，该显微镜对于光学衍射极限以下的纳米级脂质厚度的结构非常敏感。我们使用在室温下处于液态无序（Ld）相的DOPC脂质分析了它们在平衡状态下的管子，以及在形成过程中使用在冷却时转变为固态有序（So）相的DC15PC脂质。玻璃上的DOPC脂质管状网络的半径为150–200纳米。此外，直接附着在玻璃上的双层具有局部粘附点，导致形成了管状网络，而位于脂质双层上的管子与表面的相互作用很小，展现出延展的直线几何形状。发现了具有不同层状结构的复杂排列，与玻璃表面的相互作用决定了液态Ld相中脂质的管径。值得注意的是，由于qDIC对双折射的敏感性，我们能够区分不同的管状排列（例如，同心多层与孪生单层），并且还揭示了如折叠的双层边缘和三重连接等配置。在玻璃上形成管状结构是由脂质薄膜的双层区域中的脂质耗尽所驱动的，并提出了一种机制，即脂质耗尽是由于迁移到牢固附着在玻璃表面的单层斑块中。利用具有从Ld相到So相相变的DC15PC脂质，研究了冷却过程中形成的管状结构的特征尺寸。这些管状结构是通过增加表面张力并改变弯曲刚性来实现的，其中弯曲刚性在相变过程中达到最小值。利用这一模型系统，能够制备出成分和几何结构均可控的、清晰的脂质管状结构，这为研究脂质间的相互作用以及自然界中许多生物纤维的生物物理特性提供了新的实验途径。