利用多光谱二维光谱技术分离光系统I中红色叶绿素的振动光谱

《The Journal of Physical Chemistry Letters》：Isolating the Vibrational Spectra of the Red Chlorophylls in Photosystem I with Multispectral Two-Dimensional Spectroscopy

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光系统I（PSI）利用叶绿素（Chl）分子的天线以高量子效率产生电荷分离状态。目前，对电荷分离机制的理解受到天线和反应中心（RC）叶绿素之间的光谱重叠以及能量转移和电子转移发生在相似时间尺度上的限制。在这里，我们通过对具有封闭RC的PSI复合物应用二维电子（2DES）和二维电子-振动（2DEV）光谱来表征天线激发态。通过比较具有相同动力学特性的2DES和2DEV光谱，我们能够表征光谱不同叶绿素之间能量平衡过程中的天线振动模式。通过全局分析，我们了解了能量在体相叶绿素和红色叶绿素之间的传递方式，并明确识别了与红色叶绿素相关的混合激子及分子间电荷转移态中的阳离子组分的振动。这项工作为未来使用2DEV光谱研究PSI的初始电荷分离机制奠定了基础。

光系统I（PSI）通过捕获阳光并高效进行电荷分离（CS）来驱动氧气光合作用。在生物体内，CS导致电子转移到可溶性铁氧还蛋白上，最终用于碳固定。当分离出来时，电荷分离态（CSS）具有较长的寿命，可以在光生物电化学电池中加以利用。(1,2) 为了实现高效的光捕获和CS，PSI使用一个由叶绿素分子组成的天线网络，该天线吸收光子并将激发能量引导至反应中心（RC），即由六个叶绿素组成的簇，在那里CS几乎以100%的量子效率发生。(3?6) 本手稿研究的来自Synechocystis sp. PCC 6803的PSI结构（PDB: 5OY0）以单体形式显示在图1中。(7) 每个PSI单体包含95个叶绿素。在RC核心的六个叶绿素中，特殊的对（P700）是能量最低的位点。其余89个叶绿素构成光收集天线。大多数天线叶绿素在比P700更高的能量下吸收光，被称为“体相叶绿素”（绿色叶绿素，图1），其吸收波长受局部蛋白质环境的影响。少数天线叶绿素形成二聚体和三聚体，其电子跃迁能量低于P700，这些被称为“红色叶绿素”。(8?15) 红色叶绿素在蓝细菌PSI天线中的位置因物种而异；在Synechocystis sp. PCC 6803中，已经鉴定出二聚体和三聚体红色叶绿素的位置，并在图1中用红色标出。(14) 红色叶绿素的红移跃迁是由于局部环境对吸收波长的调节以及叶绿素的空间排列造成的。(14) 叶绿素在红色位点内的紧密排列导致形成了Frenkel激子（FE）态，这是局部激发态（对于二聚体为Chl*Chl和ChlChl*）的线性组合。此外，分子轨道的重叠可能导致叶绿素间的电荷转移态（对于二聚体为Chl–Chl+和Chl+Chl–）的形成。局部激发态与CT态的混合产生了混合激子-CT态，这种混合也导致了红色叶绿素态的红移。(16,17) 以往的研究集中在使用多种技术（包括瞬态吸收、(22,23) 荧光、(14,24,25) 穴燃烧、(21,26?28) 和Stark光谱学。(18,19,29?31) 来表征从植物(17?20) 和蓝细菌(16,21) 中分离出的PSI复合物中红色叶绿素的混合FE/CT态。

图1
图1. 从Synechocystis sp. PCC 6803提取的PSI的标准化UV–vis光谱，该溶液位于50 mM D2O Tris缓冲液（pH 8.3）中；体相叶绿素Qy（绿色）、P700（蓝色）和红色叶绿素（红色）的吸收波长被突出显示，同时标出了PSI单体结构中的相关位点（PDB: 5OY0）。可见光泵浦脉冲的光谱显示在红色阴影区域。根据先前的研究，706、707和714纳米处的吸收分别归属于B31-B32、B7-A31-A32和B37-B38叶绿素。(14) 每个红色叶绿素位点的局部环境也显示出来，包括距离叶绿素5 ?范围内的氨基酸残基。用作振动探针的131-酮羰基用虚线圆圈标出。

目前，我们对能量如何从光谱不同的天线叶绿素流向RC核心以及CSS如何在较长时间尺度上演变有一个大致的了解。(8,9,28,32?37) 然而，RC核心中CS初始阶段的一些基本机制仍然未知，(34) 包括主要电子供体的身份。(38) 解决这些机制问题是理解PSI高量子效率的关键。然而，由于光谱数据中的严重光谱和时间重叠，表征PSI中的初始CS机制非常困难。与PSII不同，PSI的RC核心无法与天线叶绿素分离。因此，最小的分离PSI复合物包含RC叶绿素、红色叶绿素和体相叶绿素，在室温下它们的Qy吸收带重叠。除了光谱重叠外，PSI复合物还表现出时间重叠，即天线激发态在类似的时间尺度（飞秒到皮秒）上与RC核心的初始CS过程同时演变。因此，与RC核心中的CSS相关的Qy吸收总是会与体相叶绿素和红色叶绿素的光谱特征混合。

超快时间分辨红外（TRIR）光谱已被证明是表征光合系统中CS的强大技术。(39) 叶绿素的振动吸收带比电子带具有更窄的线宽，并且对叶绿素的电子密度及其局部静电环境敏感。Di Donato等人(40)和van Thor等人(41)对PSI的研究有效地展示了TRIR在表征能量转移和CS方面的实用性。TRIR实验揭示了在超快时间尺度上形成的阳离子叶绿素的吸收带。然而，在这些研究中，阳离子叶绿素的特征并未明确归属于特定的叶绿素，而是归因于红色叶绿素的电荷转移态或RC核心中的CS过程（亚皮秒时间尺度）。(40,41) 另一种可能性是之前观察到的叶绿素阳离子特征是由红色叶绿素和RC核心共同贡献的。

为了研究RC核心中的初始CS，需要明确分配红色叶绿素和RC激发态的叶绿素阳离子特征。在这项工作中，我们专注于表征PSI复合物中的红色叶绿素激发态。为了解析红色叶绿素的振动吸收光谱，我们使用了可见光和中红外区域的多光谱二维（2D）光谱技术。2D光谱提供了高光谱和时间分辨率，因此是研究光合系统的优秀技术。(10,42?47) 例如，2DES已被用于表征光收集复合物中的能量转移。(48) 在2DES实验中，两个宽带的可见光泵浦脉冲以t1时间延迟分开，激发天线叶绿素。然后通过一个与泵浦脉冲相隔population时间延迟（t2）的可见光探测脉冲来跟踪叶绿素激发态的演变。沿t1轴对检测信号进行傅里叶变换会产生一个2D相关图，其中对角线上的峰代表激发态的自响应，而对角线外的“交叉峰”报告了光谱不同叶绿素位点之间的能量转移。2DEV也被用于表征光收集复合物中的能量转移和CS。(44,45,49?51) 在2DEV实验中，(49) 可见光探测脉冲被宽带中红外脉冲取代，以检测叶绿素的电子态和振动模式之间的交叉相关性。实际上，在2DEV光谱中，观察到电子激发态和振动正常模式之间的交叉峰。(52) 最近，Ogilvie团队展示了多光谱2D光谱技术，其中2DES和2DEV光谱的结合对于表征PSII中的CS机制非常有效。(44) 2DES和2DEV的结合非常强大，因为两个探测区域中的激发态的光谱特征以相同的动力学演变。(44) 2DES也被用于研究PSI中的能量转移，(36,42,53) 但尚未对PSI进行2DEV测量。我们希望使用2DEV来表征PSI RC核心中的CS机制，正如在PSII中所展示的那样。(44) 然而，如上所述，PSI RC核心无法与天线叶绿素分离，因此我们必须首先了解如何解释2DEV光谱中与体相叶绿素和红色叶绿素相关的信号以及它们随时间的变化。为此，我们对来自Synechocystis sp. PCC 6803的蓝细菌PSI三聚体应用了2DES和2DEV光谱。为了分离天线的光谱响应，我们在封闭的反应中心进行测量，其中主要供体P700处于氧化状态，从而能够在没有RC内部电荷分离过程干扰的情况下表征初始天线激发态。我们的测量在室温下进行，以实现从红色叶绿素到体相叶绿素的能量向上转移，并利用2DES光谱中已知的平衡动力学来解释1660–1730 cm–1光谱区域的振动吸收特征。通过2D全局拟合，我们明确将2DEV光谱中约1708 cm–1处的光诱导振动吸收归属于红色叶绿素的混合激子-CT态的叶绿素阳离子特征（Chlδ+）。这项工作首次提供了PSI的2DEV光谱，为未来使用多光谱多维光谱技术表征PSI RC早期电荷分离阶段奠定了基础。

在PSI复合物上进行了多光谱2D光谱研究，这些复合物的光合作用由于存在氧化的P700而无法进行CS（见补充信息，S2节）。防止PSI中的CS使我们能够专注于天线内的能量转移过程。入射可见光激光脉冲的光谱在图1中绘制（见补充信息，S1节中的中红外脉冲光谱），多光谱数据在图2A中展示，显示了电子激发后PSI天线在可见光和中红外区域的响应。2D光谱包含重叠的正（红色）和负（蓝色）峰。在2DES中，正峰被归因于叶绿素的电子激发态吸收（ESA）带。负峰归因于叶绿素的基态漂白（GSB）和受激发射（SE）跃迁。2DES光谱的初始主要特征（图2A，顶部）是红色叶绿素（700纳米以上）或体相叶绿素（700纳米以下）的GSB/SE信号。由于光谱重叠，我们无法完全解析2DES光谱中的交叉峰。然而，随着t2延迟时间的增加，通过对光谱线形状的明显变化可以观察到对角线外的增长。这些特征是由于体相叶绿素和红色叶绿素之间的能量转移而增长的。在更长的时间尺度上，GSB/SE带向基线衰减，因为能量被RC核心捕获。

图2
图2. (A) 从Synechocystis sp. PCC 6803提取的PSI的2DES和2DEV光谱，该样品在Tris缓冲液pH 8.3中，使用覆盖660–740 nm（1.35 × 104–1.52 × 104 cm–1）光谱区域的可见光脉冲激发，并使用覆盖620–746 nm（1.34 × 104–1.61 × 104 cm–1）区域或1660–1740 cm–1光谱区域的中红外脉冲检测。在714、708、700和678纳米（1.400 × 10^4、1.412 × 10^4、1.43 × 10^4和1.475 × 10^4厘米^-1）的泵浦波长处绘制了相关线。（B）从多光谱数据中获得的2D-DAS，其中正值（红色）对应于峰值衰减，负值（蓝色）对应于峰值增长。（C-F）沿着泵浦轴线在每个图表上方给出的检测轴位置处取得的切片。每个光谱获得的t2延迟分别在D和F面板中显示。（G, H）在2DES和2DEV实验中，通过对Bulk和Red Chls的激发得到的动力学轨迹，这些实验是在（A）插图中的频率坐标下进行的。（I, J）从2DEV光谱中取得的代表性切片，这些光谱是在t2延迟下对Bulk和Red Chls进行激发的。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片

2DEV光谱（图2A底部）报告了与2DES相同的激发态动力学，并包含许多重叠的正负振动跃迁。在2DEV光谱中，正带对应于激发态电子的振动，而负带对应于基态电子的振动。在分析2DEV光谱时，我们将关注Chl 131-酮羰基（C=O）团的吸收。先前的TRIR研究（40,41）已经指定了基态和激发态Chls的131-酮团的跃迁，并证明这些跃迁对Chls的电荷敏感：处于电子基态（GS）和电子激发态（ES）的中性Chls在1640–1670厘米^-1和1610–1650厘米^-1区域有振动，而阳离子Chls的131-酮振动在1700–1730厘米^-1区域。（38,40,41,54,55）在SI中报告了覆盖1545–1800厘米^-1区域的2DEV光谱，其中观察到了中性GS、中性ES和阳离子Chl带的131-酮跃迁。在这项工作中，我们关注1708厘米^-1处的振动带，该振动带之前被归因于Red Chl状态或RC核心中的初始CS的Chl cation特征；这里的峰值对应于电子密度降低的Chlδ+的131-酮模式。为了分析1708厘米^-1带，我们关注了覆盖1660–1740厘米^-1区域的2DEV光谱（图2A），这些光谱是在更高的检测轴分辨率下记录的，尽管光谱范围较小。在这个区域，我们主要监测GS中的中性Chls和Chl cation带。我们将使用这些振动模式作为报告器，以识别Bulk和Red Chls之间能量转移过程中Chl电子密度的变化。

多光谱2D光谱可以分辨出Bulk和Red Chls沿激发轴的响应。为了突出光谱响应对激发频率的依赖性，沿着ωPump轴线在特定的ωProbe频率处取得了切片（图2C–F）。对于2DES数据，沿着泵浦轴线在678纳米（1.47 × 10^4厘米^-1）和708纳米（1.41 × 10^4厘米^-1）处取得了切片，这些波长分别与Bulk或Red Chls相关（图2C,D）。在短时间延迟时，最强的信号出现在对角坐标处，即ωPump = ωProbe。随着延迟时间的增加，这些对角峰值衰减，而交叉峰区域出现增长——这是Bulk和Red Chls之间能量转移的标志。（36,42,43）图2G显示了2DES特征随t2延迟增加的变化，其中动力学轨迹是从图2A中的2DES光谱中标记的点获得的，并由示意图光谱（图2A，插图）标注。示意图光谱中标记了跃迁，其中RE和BE是Red和Bulk Chl的对角峰值，在t2 ≈ 0 ps时强度最高，并在皮秒时间尺度上向基线衰减。RE′和BE′峰值表示由于Bulk和Red Chls之间的平衡而出现的交叉峰。在实验光谱中，由于光谱拥挤，没有观察到明显的交叉峰，但我们仍然可以通过交叉峰区域的增长来监测平衡过程。（42）这里我们关注BE′交叉峰区域而不是RE′交叉峰区域，因为BE′交叉峰区域位于对角线下方，因此与ESA特征的重叠最小。BE′交叉峰区域的初始幅度非常小，并在皮秒时间尺度上增长，大约在激发后3 ps达到最大幅度。增长完成后，BE′峰值随着能量被P700+淬灭而衰减到基线。获得的动力学轨迹和切片说明了平衡过程如何在2DES光谱中表现出来，类似于之前对PSI的研究。（36,42,43）

在2DEV光谱中，131-酮振动对激发频率的响应也发生了变化，这一点通过沿着泵浦轴线在中红外检测频率1678厘米^-1和1708厘米^-1处取得的切片得到了证实，其中我们看到了与Bulk Chls相关的负跃迁，而在之前的TRIR研究（40,41）中，1708厘米^-1被归因于Chl cation带（图2E,F）。在ωProbe = 1678厘米^-1的早期t2时间切片中，观察到Red Chls激发后的正峰值，而在较高泵浦能量下激发Bulk Chls后观察到负特征。随着t2时间的增加，所有光谱特征都变为正的，如图2H中的相关动力学轨迹所示。在ωProbe = 1708厘米^-1的泵浦轴线切片中，我们观察到跨越Bulk和Red Chl区域的正特征。在早期t2时间，我们在689纳米（1.45 × 10^4厘米^-1）观察到最大强度，随着t2延迟的增加，689纳米处的幅度迅速衰减，而在后来的t2时间，幅度在Red和Bulk Chls之间分布。我们注意到，沿着泵浦轴线的切片的强度轮廓可能会受到入射泵浦脉冲光谱的影响（见SI第S7节的图1和图S7），因为不同的Chl组可能会被优先激发。

为了进一步表征Bulk或Red Chls对激发的振动响应，沿着ωProbe轴线在ωPump = 708纳米（1.41 × 10^4厘米^-1）（对应于Red Chls）和ωPump = 674纳米（1.484 × 10^4厘米^-1）（对应于Bulk Chl区域）处取得了切片（图2I,J，有关更宽光谱范围的中红外探测轴切片的更多信息，请参见图S4）。1676和1708厘米^-1处的光谱特征由叠加在切片上的虚线标记，并根据之前对PSI进行的FTIR和TRIR研究（40,41,54,56?58）以及Chl a的电子结构计算（59）进行分配。

在674纳米的光谱蓝边激发Bulk Chls时，得到的2DEV探针轴切片与之前报告的PSI的TRIR光谱（40,41）非常相似。在1661–1695厘米^-1之间观察到一个显著的负特征，归因于GS 131-酮模式。图2H中的动力学轨迹显示，这些负特征（BV2）在最早测量的t2延迟（t2 = 150 fs）时具有最大负幅度。然后这些峰值向基线衰减，同时新的正特征在约1678厘米^-1处出现，导致信号幅度随着时间的推移而变得越来越正，因为负峰值衰减。在1700–1730厘米^-1区域也观察到了多个重叠的峰值。这里我们关注ωPump = 1.484 × 10^4厘米^-1（674纳米）ωProbe = 1708厘米^-1（BV1）处的峰值，这是一个与Chlδ+相关的信号。沿着探针轴线的切片和图2中的动力学轨迹显示，在1708厘米^-1处有一个初始的正幅度。然后，1708厘米^-1处的峰值在皮秒时间尺度上增长，随后衰减。在SI的第S4节中绘制了更宽检测范围内的2DEV光谱的额外轨迹，与图2一致。

在激发Red Chls后，PSI的2DEV光谱也显示出变化，这一点通过在1678厘米^-1的中红外检测频率处取得的切片得到了证实（图2J）。在ωProbe = 1678厘米^-1的早期t2时间切片中，观察到Red Chls激发后的正峰值，而在较高泵浦能量下激发Bulk Chls后观察到负特征。随着t2时间的增加，所有光谱特征都变为正的，如图2H中的相关动力学轨迹所示。在ωProbe = 1708厘米^-1的泵浦轴线切片中，我们观察到跨越Bulk和Red Chl区域的正特征。在早期t2时间，我们在689纳米（1.45 × 10^4厘米^-1）观察到最大强度，随着t2延迟的增加，689纳米处的幅度迅速衰减，而在后来的t2时间，幅度在Red和Bulk Chls之间分布。我们注意到，沿着泵浦轴线的切片的强度轮廓可能会受到入射泵浦脉冲光谱的影响（见SI第S7节的图1和图S7），因为不同的Chl组可能会被优先激发。

为了进一步表征Bulk或Red Chls对激发的振动响应，沿着ωProbe轴线在ωPump = 708纳米（1.41 × 10^4厘米^-1）（对应于Red Chls）和ωPump = 674纳米（1.484 × 10^4厘米^-1）（对应于Bulk Chl区域）处取得了切片（图2I,J，有关更宽光谱范围的中红外探测轴切片的更多信息，请参见图S4）。1676和1708厘米^-1处的光谱特征由叠加在切片上的虚线标记，并根据之前对PSI进行的FTIR和TRIR研究（40,41,54,56?58）以及Chl a的电子结构计算（59）进行分配。

在674纳米的光谱蓝边激发Bulk Chls时，得到的2DEV探针轴切片与之前报告的PSI的TRIR光谱非常相似（40,41）。在1661–1695厘米^-1之间观察到一个显著的负特征，归因于GS 131-酮模式。图2H中的动力学轨迹显示，这些负特征（BV2）在最早测量的t2延迟（t2 = 150 fs）时具有最大负幅度。然后这些峰值向基线衰减，同时新的正特征在约1678厘米^-1处出现，导致信号幅度随着时间的推移而变得越来越正。在1700–1730厘米^-1区域也观察到了多个重叠的峰值。这里我们关注ωPump = 1.484 × 10^4厘米^-1（674纳米）ωProbe = 1708厘米^-1（BV1）处的峰值，这是一个与Chlδ+相关的信号。沿着探针轴线的切片和图2中的动力学轨迹显示，在1708厘米^-1处有一个初始的正幅度。然后，1708厘米^-1处的峰值在皮秒时间尺度上增长，随后衰减。在SI的第S4节中绘制了更宽检测范围内的2DEV光谱的额外轨迹，与图2一致。

在激发Red Chls后，PSI的2DEV光谱与在Bulk Chl激发时获得的光谱不同。关键的变化是在1662–1690厘米^-1之间出现了强烈的正峰值。在ωPump = 1.412 × 10^4厘米^-1（708纳米）ωProbe = 1678厘米^-1（图2H中的RV2）处的动力学轨迹显示，该区域的信号幅度最初处于最大幅度，然后在皮秒时间尺度上向基线衰减。正特征与最初在Bulk Chl激发后观察到的与GS中的131-酮振动相关的预期负特征重叠并抵消了。因此，在Red Chl激发后没有观察到与电子GS相关的预期负特征，因为这些正峰值与之重叠。在激发Red Chls后，也在1700–1730厘米^-1区域观察到了正峰值，这些峰值也被归因于Chlδ+振动，与之前的TRIR研究一致（40,41）。在ωPump = 1.412 × 10^4厘米^-1 ωProbe = 1708厘米^-1（图2H中的RV1）处的动力学轨迹显示，Chlδ+峰值在Red Chl激发后向基线衰减，没有初始的信号强度增长，这与Bulk Chl泵浦区域观察到的情况不同。我们注意到，在这里使用的实验条件下不会发生CS（见SI第S2节），因此动态的Chlδ+特征不是由预氧化的RC核心产生的。

2DES和2DEV光谱都探测了PSI天线中的能量转移，因此它们的时间演变受到相同的光诱导动力学控制。现在，我们将比较2DEV光谱中的时间依赖性峰值幅度与2DES中电子GSB/SE峰值（RE、BE和BE′）的已知演变，以确定Red Chls的振动光谱报告器，并确定天线Chls之间的平衡如何在2DEV光谱中表现出来。

在1708厘米^-1处的正振动吸收特征（RV1），对应于Chlδ+的131-酮振动，在Red Chl激发后衰减。在Bulk Chl激发（BV1）时，这个特征显示出初始增长，在t2 = 2–3 ps时达到最大值，随后衰减。在2DES光谱中也可以找到相同的动力学，其中Red Chl的对角峰值（RE）衰减，而下降能量转移的交叉峰（BE′）增长然后衰减。这种峰值动力学的相似性表明Chlδ+特征与Red Chl位点相关，2DEV光谱的演变与Bulk和Red Chls的2DES平衡动力学一致。

这种比较也可以应用于1660–1690厘米^-1区域的峰值（RV2、BV2）。在Red Chl激发后最初观察到的正峰值向基线衰减（类似于RE峰值），而在激发Bulk Chls后，在这个区域观察到与初始负峰值重叠的正特征的增长。与1708厘米^-1处的峰值（V1峰值）一致，这些正振动特征的演变也可能反映了Bulk Chl到Red Chl的能量转移动力学，因此它们可以归因于Red Chl位点。这些分配通过多光谱数据的全局拟合得到了加强，其中2D-衰减相关光谱（2D-DAS）显示在图2B中，并在下面进行了分析。

为了进一步确认Red Chls的振动吸收特征的分配，进行了全局分析以获得2D-DAS。关于全局拟合过程的详细信息在SI的第S6节中提供。2DEV和2DES数据被独立拟合，以确保分析和结果的解释在实验技术之间是一致的。2DEV-DAS在图2B中展示，其中两个动力学组分在2.2皮秒和22皮秒的时间尺度上发生变化。之前已经表征的2DES-DAS中的两个（SI，图S2）（42）与2DEV-DAS具有相似的衰减常数，也展示在图2B中。我们注意到，红外探测脉冲的时间带宽比可见光脉冲更大，因此无法从2DEV光谱中分离出亚皮秒时间尺度的组分，而这些组分在2DES-DAS中已被观察到，其中2DES-DAS 1和2DES-DAS 2之前被归类为超快松弛和未松弛叶绿素（Chls）之间的飞秒（fs）平衡过程（42）。相似的动力学特性使我们能够将这两个2DEV-DAS归类为与2DES-DAS 3和4相同的过程。因此，在2DEV光谱中观察到的动力学现象归因于皮秒时间尺度上的平衡以及P700+的能量淬灭。我们认为这些皮秒过程发生在振动松弛的激发态之间。这与之前的测量结果一致，这些测量表明在蛋白质环境中，叶绿素的振动冷却发生在飞秒时间尺度上（60）。这也与我们之前对PSI的2DES研究结果一致，其中皮秒过程并未受到泵浦脉冲调谐的显著影响（42）。从电子和振动探测得到的平衡2D-DAS（2DES-DAS 3和2DEV-DAS 1）也具有非常相似的泵浦频率依赖性。在2DES光谱中，如果我们先激发然后检测红色叶绿素（Red Chls），我们会观察到它们的对角峰（RE）的衰减；相反，如果我们激发的是大量叶绿素（Bulk Chls），则会在较低的交叉峰区域（BE′）观察到红色叶绿素的增长。2DEV-DAS 1中的正131-酮峰（RV1, BV1）也表现出相同的行为。因此，多光谱分析证实了2DEV-DAS 1被归类为平衡过程，并明确地将1708厘米–1附近的峰归属于红色叶绿素。能量捕获组分（2DES-DAS 4和2DEV-DAS 2）不表现出任何泵浦波长的依赖性。所有峰都在约20皮秒的时间尺度上同步衰减至基线，这与Synechocystis sp. PCC 6803的报道捕获寿命一致（33）。光谱中激发依赖性的消失与2D-DAS的归类结果以及之前对LHCII的2DEV研究结果一致，这些研究表明在能量平衡完成后，光谱特征的激发依赖性会消失（51）。为了进一步验证1708厘米–1处的正131-酮模式归属于红色叶绿素，我们构建了一个动力学模型来描述与天线叶绿素相关的平衡和松弛过程。根据这个动力学模型，我们生成了模型2DES和2DEV光谱，然后提取了2D-DAS数据与实验数据进行了比较。详细信息见SI的第S7节。最能再现实验2D-DAS（图3）的动力学模型是大量叶绿素和红色叶绿素之间的平衡，随后是天线激发态的衰减，其中1708厘米–1频率区域的正带被归属于红色叶绿素状态。我们注意到，该动力学模型没有考虑亚皮秒组分，例如在2DES光谱中观察到的那些组分；然而，该模型在定性上复制了具有皮秒衰减时间的实验2DEV-DAS和2DES-DAS，从而进一步支持了我们将1708厘米–1处的正峰归属于红色叶绿素的结论。

图3：
(A) 示意图展示了代表大量叶绿素和红色叶绿素的动力学组分之间的相互联系。
(B) 通过求解对应于图A中方案的常微分方程组得到的浓度-时间曲线。
(C) 从图B中的动力学轨迹得到的模拟多光谱2D数据，这些数据被用作生成图D中所示2D-DAS组分的输入。

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动力学分析表明，1708厘米–1带的激发依赖性时间演化是红色叶绿素激发态振动的特征。我们还注意到，我们的测量是在封闭的叶绿素-蛋白质复合物（RCs）上进行的，因此2DEV数据无法提供关于RC的叶绿素-蛋白质（CS）状态的见解。在之前的实验TRIR工作中（40,41），2DES和2DEV光谱显示，中红外光谱这一区域的阳离子叶绿素特征包含了红色叶绿素激发态的贡献。这种归类与之前的工作和已建立的模型一致，这些模型将PSI中的红色叶绿素激发态归类为混合激子-叶绿素-电荷转移（CT）状态（16,21,25）。叶绿素的局部激发态（Chl*Chl和ChlChl*），即弗伦克尔激子（Frenkel excitons），可以与叶绿素-叶绿素-电荷转移（Chl–Chl+和Chl+Chl–）状态耦合（16,17）。由于这种耦合，产生的激子态具有一些CT特性。与1708厘米–1峰相关的131-酮振动模式被归属于与混合FE/CT状态相关的Chlδ+组分。由于1708厘米–1峰对应于混合激子-CT状态中的Chlδ+特征，人们也可以预期光谱中会出现Chlδ?特征，其中Chlδ?酮模式的振动频率相对于中性叶绿素a发生了红移（40,57）。阴离子叶绿素在色素-蛋白质复合物中的振动吸收带尚未得到很好的表征，这可能是由于与其他光谱特征的重叠。我们推测，在1660–1690厘米–1区域观察到的红色叶绿素带可能对应于与激子-CT状态相关的Chlδ?的C═O伸缩模式，这与观察到的动力学和模型光谱一致。

在这项工作中，我们首次将2DEV光谱技术应用于室温下的溶液相蓝细菌PSI的多光谱2D光谱研究。为了解释光谱，我们应用了2D全局分析来提取光合天线的激发态动力学。大量叶绿素和红色叶绿素的激发依赖性松弛动力学使我们能够识别红色叶绿素混合激子-CT状态的131-酮振动，其中2DEV光谱中的1708厘米–1带被归属于Chlδ+组分，而在较低频率（1660–1690厘米–1）发现的光诱导振动吸收暂时被归属于阴离子组分Chlδ?。通过比较从2DES和2DEV光谱中提取的2D-DAS数据以及光谱建模，我们确定了PSI天线叶绿素之间的能量传递方式。对初始红色叶绿素激发态的表征以及对天线动力学的分析对于研究具有开放反应中心的PSI复合物中的电荷分离至关重要，因为电荷分离可能发生在这些复合物中。通过将开放RC的PSI 2DEV光谱与本工作中封闭RC的数据进行比较，我们将能够更好地区分天线叶绿素和RC叶绿素的振动信号。这种方法将有助于有效分离天线叶绿素内的能量传递过程与RC核心内的电子传递过程。因此，这项研究为未来使用2DEV光谱技术研究PSI中的电子传递过程奠定了基础。

实验方法：
PSI是从Synechocystis sp. PCC 6803中分离出来的，使用的是已建立的程序（61）。多光谱2D实验的详细信息见SI的第S9和S10节。