综述：T细胞耗竭在肿瘤免疫学中的机制、异质性及治疗策略

《Frontiers in Immunology》：T-cell exhaustion in tumor immunology: mechanisms, heterogeneity, and therapeutic strategies

　　

T细胞耗竭是限制抗肿瘤免疫持久性和癌症免疫疗法长期疗效的核心机制。在持续的抗原刺激和持续的微环境压力下，耗竭的CD8+T细胞经历进行性功能损伤，并伴有稳定的转录、表观遗传和代谢重编程。重要的是，耗竭现在被理解为并非统一的、功能失调的终点，而是一种按层级组织且依赖于背景的分化连续体，包括具有不同可塑性和治疗反应性的祖细胞样耗竭、中间耗竭和终末耗竭状态。该框架有助于解释为何免疫检查点阻断（ICB）和相关疗法通常产生不完全和非持久的临床反应，因为它们主要作用于祖细胞样耗竭T细胞，而让终末耗竭群体在很大程度上无法被重编程。本综述中，研究人员整合了关于T细胞耗竭的发育异质性、分子机制和肿瘤微环境调控的现有知识，并探讨了这些特征如何影响主要免疫治疗策略的疗效。研究人员进一步指出，未来的进展将取决于超越试图全面逆转耗竭的思路，转而采用针对状态导向的方法，以保护祖细胞样T细胞库、抑制终末分化并重塑免疫抑制性肿瘤微环境。

1 引言

T淋巴细胞是负责免疫介导肿瘤控制的主要效应细胞。然而，在持续抗原暴露的条件下，如慢性病毒感染和癌症，具有抗原经验的CD8⁺T细胞逐渐失去增殖能力、效应功能和长期持久性，最终获得一种称为T细胞耗竭的功能失调状态。耗竭不应等同于短暂激活、衰老或简单的低反应性。它是一个特殊的适应性状态，使T细胞在慢性刺激下得以存续，但代价是效应能力降低。在肿瘤中，持续的抗原呈递、缺氧、营养竞争、乳酸积累和抑制性细胞因子共同强化了这种功能障碍程序。重要的是，耗竭T细胞并非同质群体，而是包含具有不同分子特征、解剖定位和功能潜能的多种发育状态。祖细胞样耗竭T细胞（Tpex）优先定位于三级淋巴结构（TLS）和肿瘤基质周围，保持自我更新能力，而终末耗竭T细胞（Texterm）主要浸润缺氧的肿瘤实质。临床相关性在免疫检查点阻断（ICB）中尤为明显，但许多患者表现出原发性或获得性耐药。一个主要原因是耗竭T细胞亚群在增殖潜力、发育可塑性和治疗性重振的敏感性方面存在显著差异。本综述旨在提供一个全面的、以状态为导向的框架来理解肿瘤免疫学中的T细胞耗竭。

2 T细胞耗竭的生物学特征

2.1 功能特征

在感染和癌症的慢性抗原暴露下，CD8⁺T细胞逐渐丧失增殖能力、细胞因子产生和持久的效应功能，并进入异质性的耗竭状态。这种功能衰退是渐进式的。IL-2产生减少和增殖潜力受损通常是早期特征，而更晚期的功能障碍则与多功能性降低相关。耗竭并不意味着功能完全沉默，因为某些功能失调或中间耗竭亚群在特定条件下仍可保留残余的细胞毒性程序。

2.2 表型特征

耗竭T细胞的定义性表型特征是多种抑制性受体的持续共表达，同时伴随增殖和效应能力降低。单个检查点受体的表达并不足够，因为最近激活的T细胞也可能瞬时表达PD-1等分子。相反，包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4和TIGIT在内的受体的持续共表达更能可靠地反映耗竭状态，尤其是在伴随功能损伤时。在许多情况下，更广泛的抑制性受体共表达与更深度的功能障碍相关。

3 耗竭T细胞亚群

3.1 耗竭连续体

在肿瘤微环境（TME）内持续的抗原刺激下，激活的CD8⁺T细胞逐渐偏离典型的记忆分化，进入耗竭轨迹。T细胞耗竭越来越被理解为一个按层级组织且受表观遗传约束的发育连续体。一个具有生物学意义的框架将此连续体大致分为三个主要状态：祖细胞样耗竭T细胞（Tpex）、中间或过渡性耗竭T细胞（Texint）和终末耗竭T细胞（Texterm）。亚群划分应基于谱系相关的转录程序和表观遗传特征。

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  祖细胞样耗竭T细胞（Tpex）：构成耗竭谱系的干细胞样区室，最一致的特征是表达TCF-1（由Tcf7编码），并具有自我更新能力和产生更多分化耗竭子代的能力。功能上，Tpex细胞通常表现出有限的即时细胞毒性，但保留显著的增殖和发育潜力。它们是维持对PD-1通路阻断反应的主要群体，其丰度与检查点疗法抗肿瘤反应的持久性密切相关。例如，在黑色素瘤患者中，TCF-1⁺PD-1⁺T细胞频率较高预示着抗PD-1疗法的积极临床结果。
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  中间/过渡性耗竭T细胞（Tex^int）：随着祖细胞样耗竭细胞失去TCF-1并进一步分化，它们获得一种中间耗竭状态，其特征是细胞毒性编程增加，并表达CX3CR1、KLRG1、GZMB、PRF1以及T-bet、Zeb2、Id2、Prdm1等转录调节因子。当前证据表明，这些细胞中的许多应被解释为耗竭连续体内的分化或过渡状态，而非一个完全独立、稳定的谱系。检查点阻断似乎主要作用于祖细胞样区室，促进其增殖性扩张并分化为更具细胞毒性的子代。这些动力学可能有助于解释PD-1阻断后观察到的抗肿瘤效应活性短暂增加，而持续的抗原暴露和抑制性TME可能仍然限制长期持久性，并促进向更终末的、固定的功能失调状态发展。
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  终末耗竭T细胞（Tex^term）：代表慢性抗原刺激下耗竭谱系中分化程度最高的终点。这些细胞已失去TCF-1表达，并受以TOX、EOMES、NFAT和NR4A家族成员为核心的耗竭相关转录程序主导。它们通常共表达多种抑制性受体，包括PD-1、TIM-3和CD39，并且增殖能力有限。更根本的是，Texterm细胞的特征在于根深蒂固的转录和表观遗传重塑，而非仅表面表型。持续性的TOX和NFAT相关程序，以及耗竭相关的染色质重塑和de novoDNA甲基化，有助于稳定这种功能失调状态，并限制其对单纯检查点阻断的反应性。需要强调的是，Texterm并非完全功能惰性；它们具有残余的细胞毒性潜力，其存在与肿瘤免疫原性标志物（如微卫星不稳定性、高肿瘤突变负荷和新抗原负荷）密切相关。因此，终末耗竭最好被视为一种高度受限的细胞状态，在治疗上仍难以完全重编程。如文中图1所示，耗竭连续体与主要免疫治疗模式下的治疗反应性密切相关。

3.2 耗竭T细胞亚群的异质性

T细胞耗竭是一个高度异质性和动态的过程。耗竭T细胞的异质性是由一个复杂的调控网络塑造的，该网络整合了慢性抗原刺激、转录和表观遗传重塑、代谢限制以及微环境信号。因此，耗竭T细胞包含具有不同分子特征、解剖分布和功能容量的多种发育状态。即使在终末耗竭阶段，也存在多个亚群，表明耗竭包含多种终末状态而非单一表型。空间异质性进一步增加了这种复杂性。前体样耗竭CD8⁺T细胞，特别是TCF1⁺亚群，优先富集在基质区域和三级淋巴结构内或周围，而分化程度更高的耗竭T细胞在肿瘤实质内更为丰富。研究表明，CD39⁺PD-1⁺CD8⁺前体样耗竭T细胞集中在TLS内及周围，支持了淋巴样生态位是较少分化耗竭状态的储存库这一观点。相反，Ttex细胞通常在肿瘤核心内缺氧区域和代谢应激的抗原呈递细胞（APC）附近形成紧密的簇，创造了一个强化耗竭固定的基质-代谢生态系统。耗竭程序也因肿瘤类型而异。例如，在侵袭性乳腺癌中，肿瘤来源的细胞外囊泡可将TGF-β II型受体（TβRII）转移至CD8⁺T细胞，从而激活SMAD3，后者与TCF1协同促进耗竭相关程序。在儿科B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）中，功能失调的CD4⁺骨髓T细胞，特别是TIM-3⁺亚群，与复发风险相关，表明该疾病中临床相关的T细胞功能障碍可能在CD4⁺区室尤为突出。而在多发性骨髓瘤中，经典的抗原驱动的终末耗竭可能不如在许多实体瘤中占主导地位。

4 T细胞耗竭的潜在机制

从机制角度看，T细胞耗竭不是由单一抑制信号引起的，而是由持续性抗原刺激、转录和表观遗传重连、受体介导的抑制性强化、代谢不足以及肿瘤微环境抑制的逐步整合所导致的。慢性TCR信号是耗竭的起始轴，转录因子网络决定谱系定向，表观遗传重塑稳定功能失调状态，而抑制性受体信号、代谢应激和TME共同维持并随时间放大功能障碍。如文中图3所示，这些机制以协调方式运作，启动、稳定和维持耗竭状态。

4.1 细胞内转录和表观遗传调控

4.1.1 转录因子网络

在耗竭早期，祖细胞样耗竭T细胞（Tpex）由以TCF-1为核心的干性相关转录网络维持。TCF-1保持自我更新能力，抑制过早的终末分化，并在持续抗原暴露下支持响应性前体库的长期维持。TCF-1并非孤立起作用，而是与LEF1、MYB、ID3等转录因子协同稳定祖细胞样身份并保持发育可塑性。随着慢性刺激持续，T细胞逐步启动由持续性TCR信号驱动的耗竭诱导转录轴。持续的钙内流激活钙调蛋白-钙调神经磷酸酶-NFAT通路，在经典的AP-1协同作用受限的条件下，NFAT优先诱导耗竭相关调节因子，如TOX和NR4A家族成员。TOX和NR4A因子协同施加并强化耗竭转录程序，促进抑制性受体的持续表达，同时限制效应相关基因并限制功能恢复。TOX不应仅仅被视为效应功能的抑制因子，而应被视为一种谱系稳定因子，使细胞适应慢性刺激，同时限制效应可塑性。包括BATF、IRF4和Blimp-1在内的其他转录因子进一步加强了这种分化的功能失调状态。在慢性抗原刺激下，这些因子有助于抑制记忆相关程序，并促进CD8⁺T细胞向终末耗竭进展。T-bet和Eomes相关程序的相对平衡变化也伴随着从分化程度较低状态向更终末耗竭状态的转变。通常，T-bet与效应能力的保持和抑制性受体过度表达的抑制更为相关，而Eomes更多与晚期分化和残余但受限的细胞毒性程序的维持相关。

4.1.2 表观遗传重编程

虽然转录因子网络启动并塑造耗竭程序，但表观遗传重塑为其长期稳定和有限可逆性提供了主要基础。耗竭T细胞获得了一种独特的表观遗传景观，其特征是“表观遗传疤痕”，包括染色质可及性改变、组蛋白修饰、DNA甲基化和更广泛的染色质重组。在祖细胞样耗竭T细胞内，与干性和持久性相关的基因座相对开放，并富含H3K4me3和H3K27ac等激活型组蛋白标记。然而，随着细胞向终末耗竭进展，与效应基因相关的染色质区域逐渐受限，而耗竭相关基因座保持开放和转录活跃。TOX中心的调控复合物通过协调染色质重塑，有助于维持耗竭相关基因的可及性，同时限制经典效应程序的重新激活。同时，持续刺激促进DNMT3A介导的de novoDNA甲基化，进一步巩固功能失调状态，并限制耗竭T细胞恢复为经典效应或记忆命运的能力。染色质重塑复合物如PBAF也可能调节祖细胞维持和分化转变。总的来说，这些发现有助于解释为什么包括检查点阻断在内的治疗性重振通常是部分的，而非完全恢复性的。

4.2 抑制性受体的持续上调

持续的抑制性受体信号传导是T细胞耗竭的主要强化机制。在生理条件下，PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3和TIGIT等受体对于维持免疫耐受和限制过度炎症至关重要。然而，在慢性病理刺激下，这些通路持续被激活，并逐步抑制T细胞活化、增殖、细胞因子产生和存活。重要的是，抑制性受体不应仅仅被解释为表型标记或耗竭的唯一来源，而应被视为一旦慢性抗原驱动的谱系程序已经建立，便会强化功能障碍的受体介导回路。从机制上讲，PD-1主要在胞质基序磷酸化后募集SHP-2，从而抑制近端TCR/CD28信号传导及下游PI3K/AKT和ERK通路。CTLA-4通过与CD28竞争CD80和CD86来限制共刺激，而TIM-3和TIGIT则通过其各自的配体（如galectin-9和CD155）提供额外的非冗余抑制性输入。由于耗竭T细胞通常共表达多种抑制性受体，阻断一条通路常会触发对其他通路的代偿性依赖，这凸显了耗竭相关信号通路的冗余性和适应性。

4.3 代谢不足与线粒体功能障碍

代谢功能障碍是耗竭T细胞的另一个核心特征，尤其是在肿瘤内部。一个主要后果是葡萄糖获取减少，这损害了肿瘤反应性CD8⁺T细胞的糖酵解通量和合成代谢适应性。这一缺陷因PD-1信号传导而加剧，PD-1抑制PI3K/AKT/mTOR通路，从而限制葡萄糖摄取和代谢支持。因此，耗竭T细胞失去了维持持久抗肿瘤活性所需的生物能量灵活性。线粒体功能不足进一步加剧了这种状态。耗竭T细胞通常表现出线粒体适应性受损、线粒体形态异常和氧化能力降低，这些都限制了其长期存续和功能。研究表明，Ttex经历由PGC1α抑制、氧化磷酸化受损和活性氧（ROS）积累驱动的线粒体功能障碍。受损的线粒体还会产生过量的ROS，促进应激反应、凋亡和进一步的功能衰退。氨基酸剥夺是第三个主要的代谢轴。肿瘤细胞和髓源性抑制细胞（MDSC）通过高表达Arg1和吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）消耗精氨酸和色氨酸，同时产生免疫抑制代谢物，激活T细胞中的应激反应通路，包括GCN2相关信号传导和mTORC1抑制。这些变化损害细胞周期进程、生物合成能力和效应功能。

4.4 肿瘤微环境的调控

肿瘤微环境（TME）通过提供持续的抗原刺激、有缺陷的启动条件、抑制性细胞因子、代谢限制和抑制性细胞相互作用，作为一个整合的生态系统来维持T细胞耗竭。持续的抗原呈递是慢感染和癌症中耗竭的主要上游驱动因素之一。在肿瘤中，树突状细胞的组成和功能常常发生改变，共刺激减少，抑制性配体表达增加，对有效T细胞启动的支持受损。在这些条件下，抗原呈递偏向于维持慢性刺激而非有效清除，从而有利于易耗竭的分化。可溶性抑制介质提供了额外的抑制层。IL-10和TGF-β等免疫调节细胞因子在TME内逐渐积累，通过损害APC功能、减少炎性细胞因子产生并直接限制T细胞增殖和效应分化来抑制抗肿瘤免疫。这些细胞因子本身不会独立产生耗竭，但一旦慢性刺激建立，它们会强烈强化和稳定功能失调状态。肿瘤内的生物物理和代谢应激也有很大贡献。实体瘤异常的血管系统创造了严重的缺氧环境，损害氧化磷酸化，重塑代谢和转录程序，并加剧线粒体应激和ROS积累。同时，肿瘤细胞持续的有氧糖酵解导致细胞外乳酸积累和微环境酸化。细胞外乳酸升高会阻碍活化T细胞的乳酸外流，破坏细胞内pH稳态，并抑制增殖和细胞因子产生。最后，多种免疫抑制细胞群协同维持肿瘤内的耗竭。调节性T细胞（Tregs）通过高亲和力CD25表达和CTLA-4依赖性调节APC功能来限制IL-2的可用性和抑制共刺激。重要的是，髓源性抑制细胞（MDSC）已成为免疫抑制和疗法耐药的关键外部驱动因素。MDSC产生抑制性代谢物和活性物质，表达PD-L1，并利用多种氨基酸代谢途径建立和维持免疫抑制，从而直接导致T细胞耗竭，并强化了疗法耐药性不仅是T细胞固有的，也是髓系驱动的观点。肿瘤相关巨噬细胞（TAM），特别是那些极化为M2样表型的TAM，通过抑制性细胞因子、趋化因子和抑制性配体表达进一步放大耗竭。这些细胞成分共同降低了肿瘤反应性T细胞in situ恢复持久效应能力的可能性。

5 耗竭连续体在癌症免疫疗法中的治疗学意义

T细胞耗竭制约当前癌症免疫疗法的主要方式总结于文中表2。

5.1 免疫检查点阻断

免疫检查点阻断（ICB）仍然是使用最广泛、临床最重要的癌症免疫疗法形式之一。然而，ICB的疗效深受肿瘤反应性T细胞分化状态和可塑性的影响。虽然PD-1通路阻断可以部分重振耗竭T细胞并在部分患者中诱导肿瘤消退，但这些反应通常不完全且常常缺乏持久性。一个主要原因是检查点抑制并不能完全消除稳定耗竭状态的转录和表观遗传程序。相反，当前证据表明，对PD-1阻断的主要响应者是祖细胞样耗竭T细胞，特别是TCF-1⁺区室，该区室保留增殖潜力，并能在治疗后产生更多分化的效应样子代。相比之下，当肿瘤内T细胞库以终末耗竭、表观遗传受限的细胞为主时，单独的PD-1阻断通常不足以恢复持久的抗肿瘤免疫。因此，ICB有限的持久性不仅反映了不完全的功能重振，也反映了限制长期细胞可塑性的耗竭相关染色质状态的持续存在。从机制上讲，持续的PD-1接合通过抑制近端TCR和CD28信号传导以及限制参与增殖、存活和效应分化的下游通路来减弱T细胞活化。在此背景下，PD-1阻断应主要被理解为一种释放响应性耗竭T细胞群体功能限制并扩增再生性前体库的策略，而非一种完全逆转终末耗竭的干预措施。CTLA-4阻断具有相关但不完全相同的生物学特性。与主要在周缘组织和肿瘤内作用于慢性刺激T细胞的PD-1抑制不同，CTLA-4阻断对淋巴组织中的启动和共刺激有更强影响，也可以改变肿瘤内的调节性T细胞活性。因此，CTLA-4靶向疗法最好被视为与PD-1阻断互补而非机制上可互换。这一区别为联合PD-1和CTLA-4抑制提供了部分理论依据，该联合疗法已在几种情况下显示出临床益处，但也带来了更大的免疫相关毒性。由于耗竭T细胞通常共表达多种抑制性受体，包括LAG-3、TIM-3和TIGIT，单一检查点阻断通常仅产生部分益处。因此，未来的进展可能将更多地依赖于更精确的联合策略，这些策略由肿瘤类型、T细胞亚群组成和局部免疫微环境的特性所指导。临床上，靶向PD-1和CTLA-4的药物已成为现代肿瘤学的基石，特别是在黑色素瘤和其他几种实体瘤中。

5.2 过继性细胞疗法

过继性细胞疗法（ACT）通过输注在体外扩增或经基因修饰的自体或同种异体免疫细胞来发挥抗肿瘤作用。在所有ACT平台中，输注产品的疗效深受所转移T细胞分化状态的影响。虽然高度分化的效应细胞可提供即时的细胞毒活性，但持久的临床获益更一致地与分化程度较低、干细胞样克隆型相关，后者保留自我更新能力、增殖适应性和in vivo长期持久性。因此，如果输注的细胞产品以终末耗竭细胞为主，则可能发生短暂的肿瘤杀伤，但持续扩张和持久的疾病控制不太可能。有效的治疗因此要求转移的T细胞保持持久性、连续增殖能力以及在遇到抗原后功能性再扩张的能力。在工程化T细胞疗法中，包括CAR-T和TCR-T，耗竭是持久疗效的主要障碍，尤其是在实体瘤中。在CAR-T细胞中，功能障碍甚至可能在输注前就开始了，因为某些受体设计会通过scFv框架、铰链或跨膜结构域的特性相关的自发受体聚集，促进抗原非依赖性强直信号传导。这种慢性基础信号传导可在体外制造过程中驱动过早活化和启动耗竭程序。输注后，进入肿瘤微环境的CAR-T细胞进一步暴露于持续的抗原刺激、缺氧、营养限制和免疫抑制因子（如TGF-β），所有这些都加速了功能衰退。在这些条件下，CAR-T细胞逐步上调抑制性受体，失去细胞因子产生能力，表现出增殖能力下降，并无法维持长期肿瘤监视。类似的限制也适用于TCR-T细胞，特别是在具有持续抗原负荷的实体瘤中。这些见解使得耗竭不仅是ACT中的障碍，也成为直接的工程靶点。一项主要策略是优化受体结构以减少强直信号传导并提高细胞适应性。CAR结构的结构性重新设计，包括调整scFv特性和铰链-跨膜配置，可以降低自聚集倾向并减弱组成性信号传导。此外，