适用于荧光定量PCR方法的Vero细胞DNA标准品的开发与验证

《Frontiers in Microbiology》：Development and validation of a Vero cell DNA standard for residual DNA measurement suitable for quantitative PCR method

　　

摘要：引言：人用狂犬病疫苗中Vero细胞残留DNA的荧光定量PCR检测方法亟需配套的Vero细胞DNA定量国家标准品。方法：简要而言，提取Vero细胞基因组DNA，稀释至100 μg/mL，分装于无菌螺帽管中，每管0.1 mL。完成DNA制备后，由多家实验室联合开展浓度标定、适用性及稳定性验证。结果：本次协作标定确定该Vero细胞DNA定量（限量qPCR法用）国家标准品浓度为107 ± 6 μg/mL，DNA纯度（OD260/OD280）为1.83。该标准品仅适用于qPCR方法，平均扩增效率为92%。经37 °C加速降解1至4周后，其扩增曲线与?70 °C储存样品无显著差异，扩增效率亦无显著变化，显示良好的稳定性。结论：本研究成功开发了适用于荧光定量PCR法的Vero细胞DNA定量国家标准品，对规范人用狂犬病疫苗中Vero细胞DNA残留检测具有重要应用潜力。

研究背景与问题提出

Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）是世界卫生组织（WHO）推荐用于人用疫苗生产的连续传代细胞系，广泛应用于冻干人用狂犬病疫苗、乙型脑炎灭活疫苗等产品的制备。由于连续细胞系的DNA存在致瘤风险，各国药品监管机构均对病毒疫苗中Vero细胞残留DNA设定了严格限度，现行国际标准分为不高于10 ng/剂、100 pg/剂和10 pg/剂三档，中国《中华人民共和国药典》（2010年版三部）规定人用狂犬病疫苗（Vero细胞）的宿主细胞残留DNA限值为100 pg/剂，因此检测方法必须具备极高的灵敏度与稳定性。当前主流检测技术包括分子杂交技术、DNA结合蛋白法（Threshold^?免疫分析法）和荧光定量PCR（qPCR）。其中qPCR技术凭借高灵敏度、强特异性、高通量及快速检测的优势，成为残留DNA定量的关键方法——国家药品监督管理局基于Vero细胞特有的172 bp靶基因序列建立了TaqMan qPCR检测方法，扩增片段长度为154 bp，灵敏度可达0.003 pg/10 μL，且无与人二倍体细胞、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、酵母细胞及大肠杆菌的交叉反应，超声片段化DNA在100~2000 bp范围内不影响检测，尤其适用于人用狂犬病疫苗原液阶段的残留DNA监测。然而，该qPCR方法的规范化应用长期缺乏配套的Vero细胞DNA国家标准品，导致不同实验室检测结果的一致性难以保障，成为疫苗质量监管的技术瓶颈。为此，研究人员依据《中华人民共和国药典》生物制品标准物质制备要求，开发并验证了适用于qPCR法的Vero细胞DNA液体国家标准品，相关研究发表于《Frontiers in Microbiology》。

关键技术方法概述

研究人员采用液体剂型制备策略，委托辽宁成大生物技术有限公司进行大规模Vero细胞培养，由中国科学院上海营养与健康研究所湖州研发中心完成基因组DNA提取，经紫外分光光度法调整浓度至100 μg/mL、纯度OD₂₆₀/OD₂₈₀介于1.8~2.0，使用低吸附平底螺帽离心管分装（100 μL/支）。通过8家具备核酸定量检测资质的实验室开展协作标定，以紫外分光光度法测定浓度，取算术平均值作为标准品定值；邀请15家检测机构开展适用性验证，通过10倍梯度稀释标准品评估qPCR扩增曲线的典型性、标准曲线拟合度（R²）及扩增效率；采用37 °C加速稳定性试验（1、2、3、4、8周），结合琼脂糖凝胶电泳与qPCR扩增效率变化评价标准品的稳定性。

研究结果

3.1 标准品制备与分装

候选标准品原液（批号Y20190311）的平均浓度为112.6 μg/mL，纯度OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.85；稀释至目标浓度后平均浓度为99.7 μg/mL，纯度为1.88，最终分装5066支。分装精度评估显示初始阶段偏差±5%、中期±4%、终末期?6%~5%，虽未完全符合药典要求，但因标准品为液体剂型，分装精度不影响浓度定值，且单次检测仅需4~5 μL，对实际应用无影响。

3.2 协作标定结果

8家实验室共提交24组有效数据，实验室间检测变异系数（CV）为5.9%，24次检测的算术平均浓度为107 ± 6 μg/mL，纯度OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.83，符合标准物质定值要求。

3.3 qPCR适用性验证

15家实验室验证结果显示，标准品经10倍梯度稀释后均呈现典型扩增曲线，标准曲线R²均≥0.990（平均0.998），在30 pg/μL至0.3 fg/μL的浓度范围内线性良好，平均扩增效率为93%，证实该标准品适用于qPCR检测。

3.4 稳定性评估

37 °C加速放置0、1、2、3、4周的样品经0.8%琼脂糖凝胶电泳，条带大小与?70 °C储存样品无差异；qPCR检测显示扩增效率介于89%~94%之间，CV为2.3%，各时间点扩增效率无显著差异，表明标准品在测试条件下稳定性良好。

讨论与结论

Vero细胞是目前全球（尤其是发展中国家）病毒疫苗生产的主要细胞基质，中国每年约有1000万人接种Vero细胞人用狂犬病疫苗，占国内狂犬病疫苗市场的90%以上。连续细胞系宿主DNA的致瘤风险需严格控制，WHO指出其在150代内使用是安全的，但中国药监部门仍高度重视其致瘤潜力风险评估。传统《中华人民共和国药典》（2015年版）收录的“探针杂交法”（3407）虽操作简便，但属于半定量分析，易受主观判断影响，且操作周期长、重复性差。相比之下，qPCR可实现实时定量，灵敏度高、通量大，尤其适合疫苗纯化前后的工艺控制与监测。本研究通过8家实验室协作标定确定了Vero细胞DNA国家标准品的浓度（107 ± 6 μg/mL）与纯度（OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.83），15家实验室验证证实其适用于qPCR检测，且37 °C加速4周内稳定性良好。该标准品已获中国官方批准（编号：250021–201901），填补了qPCR法检测Vero细胞残留DNA的国家标准品空白，为疫苗生产企业与质量检验机构的残留DNA检测提供了统一的量值溯源依据，对提升疫苗质量安全水平具有重要的理论与实践价值。