基于Olink技术的免疫球蛋白A血管炎炎症生物标志物的诊断价值

《Frontiers in Immunology》：Diagnostic value of inflammatory biomarkers of IgA vasculitis based on Olink technology

　　

摘要 背景：腹型免疫球蛋白A血管炎（IgAV）常表现为非特异性症状，使得准确诊断复杂化。迫切需要能够可靠区分患者与健康个体的血浆生物标志物。 目的：利用Olink技术鉴定和验证用于腹型IgAV的血浆炎症生物标志物。 方法：收集10名伴有腹部受累的IgAV患者和10名健康对照者的空腹血浆样本。采用Olink Target 96炎症芯片对92种炎症相关蛋白进行定量，随后在扩大队列中通过酶联免疫吸附测定（ELISA）进行验证。 结果：与对照组相比，IgAV患者中有22种细胞因子显著上调。其中，IL-8、OSM、TGF-α、TNFSF-14和HGF显示出强大的诊断潜力。在验证队列中，IL-8、OSM和TNFSF-14仍然显著升高。这三种标志物联合的ROC曲线下面积（AUC）为0.922（95%置信区间[CI]：0.823–1.021），灵敏度为83.3%，特异度为90.0%，显著优于任何单一标志物。决策曲线分析证实了该联合标志物组的临床效用。功能富集分析显示，这些蛋白与炎症通路密切相关，包括细胞因子-细胞因子受体相互作用和核因子κB（NF-κB）信号级联。 结论：IL-8、OSM和TNFSF-14是腹型IgAV有前景的血浆生物标志物。研究发现为疾病发病机制提供了新见解，并指出了一种更具可及性的诊断策略。

研究背景与目的

免疫球蛋白A血管炎（IgAV），旧称过敏性紫癜，是一种以免疫球蛋白A（IgA）免疫复合物沉积为特征的系统性小血管炎。腹型IgAV是其主要临床表现之一，但其腹部症状（如腹痛）常常缺乏特异性，易与外科急腹症混淆，导致诊断延迟或漏诊。目前，临床缺乏方便、敏感、普适性强的血浆生物标志物用于IgAV的早期筛查。因此，识别能够可靠区分腹型IgAV患者与健康个体的生物标志物，对实现及时识别和优化治疗具有重要临床价值。炎症细胞因子在IgAV的发病过程中被认为扮演了核心角色，然而针对腹型IgAV的系统性高通量蛋白质组学筛查及其诊断性能的评估仍然缺乏。为此，本研究旨在利用Olink高通量蛋白质组学技术，筛选并验证可用于腹型IgAV诊断的血浆炎症生物标志物，以期为该病的早期诊断和机制理解提供新依据。本研究成果发表于《Frontiers in Immunology》期刊。

关键技术方法

研究人员采用了一项前瞻性、单中心的研究设计。研究对象来自天津儿童医院，包括腹型IgAV患者和年龄匹配的健康儿童对照。研究分为探索队列（各10例）和三个独立的扩大验证队列。关键技术方法包括：

1. 1.
   样本采集与队列设计：采集研究对象空腹静脉血，分离血浆并冻存。研究遵循STARD 2015指南，设计了清晰的入组、排除标准和患者流程图。
2. 2.
   高通量蛋白定量：使用基于邻位延伸分析技术（PEA）的Olink Target 96炎症芯片，对92种炎症相关蛋白进行高通量绝对定量，结果以归一化蛋白表达（NPX）值（log₂尺度）表示。
3. 3.
   生物信息学分析：对差异表达蛋白（DEPs）进行主成分分析（PCA）、基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，并构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。
4. 4.
   ELISA验证与统计建模：使用ELISA在独立验证队列中对筛选出的候选标志物进行验证。通过受试者工作特征（ROC）曲线、列线图构建和决策曲线分析（DCA）评估标志物的诊断性能、临床效用和预测能力。

研究结果

3.1 临床基线数据比较

在探索队列和三个验证队列中，病例组与对照组在年龄、性别分布上均无显著差异，且所有病例组均表现出典型的IgAV临床表现，胃肠道、关节和肾脏受累比例在组间一致，表明各队列基线特征具有同质性和可比性。

3.2 炎症相关蛋白的差异表达

PCA分析显示，IgAV组与健康对照组在蛋白质表达整体轮廓上存在显著分离。共鉴定出36个DEPs，其中22个上调，14个下调。

3.3 IgAV患者与健康对照的关键差异

对36个DEPs的分析进一步揭示了最显著的20个差异蛋白。PPI网络分析将IL-6和IL-8置于相互作用网络的核心位置。

3.4 GO和KEGG富集分析

GO分析表明，DEPs主要参与炎症反应、细胞增殖和迁移的正调控等生物过程；定位于细胞外区域和质膜；具有细胞因子和生长因子活性等分子功能。KEGG分析显示DEPs在细胞因子-细胞因子受体相互作用、病毒蛋白-细胞因子/受体相互作用以及NF-κB信号通路中显著富集。

3.5 候选生物标志物筛选

从DEPs中筛选出5个上调最显著的候选标志物：IL-8、OSM、TGF-α、TNFSF-14和HGF。随机森林分析也支持了这5个蛋白的重要性。PPI网络分析表明OSM是核心节点，相关性分析显示IL-8与OSM之间存在最强的两两相关性。

3.6 ELISA验证

在三个独立的外部验证队列中，通过ELISA验证了上述候选标志物。结果显示，TGF-α和HGF在Olink和ELISA结果间不一致，未进一步研究。而TNFSF-14、IL-8和OSM在IgAV患者中仍保持显著升高，确认了它们作为稳健诊断生物标志物的潜力。

3.7 单一与联合标志物预测性能比较

ROC曲线分析显示，IL-8、OSM、TNFSF-14单独诊断的AUC分别为0.756、0.817和0.861。三者联合标志物组的诊断性能显著提升，AUC达到0.922（95% CI: 0.823–1.021），在最佳截断值（0.650）下，灵敏度为83.3%，特异度为90.0%，约登指数为0.733。

3.8 列线图构建

基于IL-8、OSM和TNFSF-14构建了用于预测腹型IgAV发病风险的列线图。校准曲线显示预测概率与观测概率具有良好的一致性，初始C指数和偏倚校正后的C指数均显示模型具有优秀的判别能力和稳定的性能。

3.9 决策曲线分析

DCA结果显示，在广泛的阈值概率范围（约0至0.85）内，使用该联合标志物预测模型进行风险分层所获得的临床净收益，均高于“全部干预”或“全部不干预”策略，表明该模型在多数临床可接受的风险阈值下具有更高的决策精度和成本效益。

讨论与结论

在讨论部分，研究人员阐述了本研究的发现与意义。腹型IgAV诊断困难，本研究发现IL-8、OSM和TNFSF-14在患者血浆中显著上调。IL-8是中性粒细胞趋化因子，OSM通过JAK-STAT和MAPK通路促进内皮激活，而TNFSF-14参与T细胞活化调控，三者可能协同作用，在IgAV的炎症和血管损伤中扮演关键角色。功能富集分析提示这些差异蛋白富集于NF-κB等关键炎症通路，为理解疾病机制提供了线索。ELISA验证和诊断模型构建（联合AUC达0.922）证实了该生物标志物组合的强大诊断潜力。DCA进一步支持了其临床应用价值。研究人员也指出了本研究的局限性，包括单中心、样本量较小、缺乏疾病对照组等，未来需通过多中心、大样本前瞻性研究进一步验证，并探索其与治疗反应和预后的关系。

结论

本研究确定IL-8、OSM和TNFSF-14是腹型IgAV有前景的血浆生物标志物。这些发现为改善这一具有挑战性的临床人群的早期诊断和风险分层开辟了新途径。此外，这些见解为理解IgAV的发病机制和设计靶向治疗方法提供了分子基础。展望未来，需要进行大规模、多中心研究来验证该生物标志物组合的诊断效用，并探索其与临床结局和治疗反应的关系。