通过无载体聚集技术，提高了来自Trametes pubescens的漆酶的催化转化效率和稳定性

《RSC Sustainability》：Enhanced catalytic turnover and robustness of laccase from Trametes pubescens through carrier-free aggregation

　　绿色生物催化技术通过用耐用的固定化生物催化剂替代全细胞系统，彻底改变了工业加工过程，大幅简化了下游纯化步骤。本研究报道了利用由白腐菌Trametes pubescens通过固态发酵产生的漆酶制备的无载体交联酶聚集体（CLEAs）的制备及其生物催化性能表征。与可溶性漆酶（SL）相比，所得的L-CLEAs显示出更优异的热稳定性和催化性能。动力学分析显示，尽管由于传质限制，表观底物结合亲和力（Km）增加了5.4倍，但这被催化速率常数（kcat）提高了4.1倍所部分补偿。此外，L-CLEAs的活化能（Ea）显著降低了2.2倍，而失活能（Ed）增加，表明其结构更加稳定。热稳定性测试验证L-CLEAs在60°C下的酶半衰期（t1/2）几乎翻倍，延长至406分钟。而且L-CLEAs在连续使用20次后仍保持>80%的活性，证明了其出色的操作耐久性和通过简单离心即可回收的特性。这些发现，加上其优异的可重复使用性，使L-CLEAs成为降解酚类化合物及其他绿色化学应用的高效稳定混合体系。

酶是一种催化机制，通过控制代谢系统来维持生命。多次重复使用它们可以降低生产成本，并减少碳排放。我们的目标是建立一种稳定的不溶性酶形式（漆酶），以便回收利用，从而减少生化加工的工业步骤。漆酶能够氧化酚类化合物；因此，基于漆酶的交联酶聚集体（L-CLEAs）可用于去除水基污染物。本研究工作强调了这种技术在实现可持续发展目标（SDGs）方面的作用，包括经济实惠和清洁能源（SDG-7）、工业创新和基础设施（SDG-9），以及在一定程度上的气候行动（SDG-13）。

**引言**

由于酶的绿色属性，它们在工业中找到了多种应用，从而限制了传统化学催化剂在制造各种代谢产物中的使用。微生物酶可以根据应用需求以可溶形式或固定化形式使用。许多研究者强调了克服与使用可溶性或游离酶相关问题的必要性，因为这些酶不易回收或重复使用，并且稳定性较低。为了解决这些问题，人们开发了酶固定化技术，将兼容的载体材料应用于固体支持物上以限制酶分子的活动。随着时间的推移，将生物催化剂固定在不同类型的有机或无机基质上已成为研究中最活跃的领域之一。这种载体束缚技术也被证明是解决可溶性酶稳定性和可重复使用性问题的最适宜方法之一。固定化的単一酶、固定化的多酶或固定化的微生物细胞在学术界和工业界得到了广泛的研究和应用。然而，固定化技术本身也存在一些局限性，包括由于复杂的固定化过程和所使用的基质类型导致的酶活性和稳定性损失。成本和可扩展性也是使用固定化酶时面临的问题。如果仔细考虑固定化的几个重要方面，可能会改善该技术的实际应用。选择合适的固定化方法（物理吸附、包封、离子键合、共价键合、包陷和交联技术）、使用的兼容支持系统类型（无机材料、生物聚合物和氢凝胶）、高效的酶回收过程以及提高固定化酶的动力学性能，都是实现固定化酶可扩展应用的关键参数。为了克服上述挑战，引入了一种新的无载体交联固定化技术，其主要重点是提高酶的操作稳定性。目前，研究人员正在广泛研究多种交联策略，包括交联酶聚集体（CLEAs）、交联酶晶体（CLECs）、磁性交联酶聚集体（MCLEAs）、多孔交联酶聚集体（PCLEAs）和组合及多重交联酶聚集体（CCLEAs）。虽然这些策略已应用于不同的酶类，但固定化技术的选择取决于特定的初级氨基酸序列和结构基序，而非酶的功能分类。在各种氧化还原酶中，漆酶已经使用上述方法中的几种与不同类型的基质或支持物进行了固定化。这是因为漆酶具有较高的催化性能，并且经常被用于开发水修复等绿色应用。它已经使用氢凝胶、磁性纳米颗粒和其他固体支持物进行了固定化，并且也以CLEAs的形式进行了研究。

根据联合国的可持续发展目标（SDGs），探索和利用不同类型的可持续材料以支持绿色环境变得至关重要。这一趋势也影响了在各种加工过程中使用可持续生物材料（如酶）的趋势。在追求可持续生物催化的过程中，酶固定化领域越来越重视无载体策略。这些无基质技术，如交联酶聚集体，继续被广泛利用以提高工业过程的体积产出率并减少环境足迹。本文研究了一种无支持物的酶固定化方法，以支持工业加工中的可持续发展目标（SDGs）。漆酶的CLEAs被认为是一种多功能的方法，可用于污染物的生物修复，因此目前正在被广泛研究；然而，它们的动力学性能尚未在其他地方详细讨论。利用漆酶CLEAs的另一个重要方面是它们的简单性和稳健性，因为这种方法可以直接用于原始酶而无需额外的纯化步骤。因此，本研究报道了从白腐菌Trametes pubescens MB89通过固态发酵制备漆酶，对其进行了部分纯化并制备成CLEAs。还详细研究了基于漆酶的CLEAs的动力学性能。在此，我们首次报道了使用Trametes pubescens产生的漆酶来制备漆酶基交联酶聚集体，并对其进行了全面的动力学研究。

**实验**

**2.1 化学品和试剂**

研究中使用的所有化学品均为分析级，从不同的来源/供应商处购买。ABTS [2,2′-偶氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]二钠盐（98% HPLC纯度）、硫酸铜(II)五水合物（ACS级）和聚乙二醇-6000购自Sigma Aldrich，而Tween-80和异丙醇购自Scharlau。25%的戊二醛水溶液来自韩国Daejung。

**2.2 漆酶的生产**

漆酶由白腐菌Trametes pubescens MB89通过固态发酵在30°C下连续生产长达10.0天，以预处理的甘蔗渣作为底物基质。最初，将该菌株培养在含有土豆提取物（30 ml：由50 g切块土豆制备）和葡萄糖（0.5%）的培养基（100 ml）中。2020年7月从卡拉奇当地市场收集甘蔗渣，首先进行彻底清洗以去除灰尘和其他污染物，然后在100°C下干燥。这种烘干后的甘蔗渣被粉碎成小颗粒（100 μm），并将之前在土豆-葡萄糖液体培养基中培养的菌株与含有0.1%硫酸盐木质素和0.5 mM Cu2+的矿物质盐介质混合，以刺激漆酶的胞外产生。

**2.3 原始酶的提取和真菌漆酶的部分纯化**

原始漆酶使用一升100 mM柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH-4.0）提取，并添加Tween-80（0.01%）以最大化回收率。通过Whatman 1号滤纸过滤收集真菌生物量和甘蔗渣，随后通过0.45 μm膜进行二次过滤。得到的无细胞滤液（原始漆酶）用于酶测定和后续实验。原始漆酶使用硫酸铵（70.0%）进行部分纯化，并通过截留分子量为2000 Dalton的透析膜（Servapor?）在柠檬酸磷酸盐缓冲液（100 mM, pH-4.0）中脱盐。脱盐后的样品蛋白含量为1200 ± 110单位，蛋白质质量为1.3 ± 0.058 mg。这种脱盐后的酶储存在-20°C下，用于可溶性酶的表征以及CLEAs的制备。

**2.4 可溶性漆酶和漆酶-CLEAs的酶测定**

对于漆酶测定，使用部分纯化的可溶性酶和一种名为2,2′-偶氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）的显色底物。ABTS溶液（1.0 mM）作为酶测定的工作浓度，与漆酶（10.0 μl）混合并在50°C下保持5.0分钟。在420 nm处测量吸光度。同样的程序用于5.0 mg的CLEAs在50°C下的酶活性测定，但时间为10.0分钟。样品中的总蛋白含量使用Lowry方案进行分析。使用牛血清白蛋白（250 μg ml?1）作为标准蛋白。

**2.5 酶单位计算**

通过监测2,2′-偶氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）的氧化来光谱法测定酶活性。酶单位按照以下公式计算：

其中A是在420 nm波长处测得的吸光度；V是反应混合物的总体积；t是反应所用的时间（分钟）；ε是底物的摩尔消光系数（ε = 36?000 M?1 cm?1）；Ve是反应中使用的酶体积（ml）。一个酶单位定义为“在标准测定条件下，在一分钟内将1.0 μM的ABTS氧化为其自由基ABTS+形式所需的酶量”。

特定活性按以下公式计算：

百分残留酶活性按以下公式计算：

百分相对酶活性按以下公式计算：

**2.6 可溶性漆酶的表征**

**2.6.1 可溶性漆酶的酶反应优化**

将脱盐后的可溶性漆酶稀释至1:60的比例，以确保酶反应保持在分光光度计的线性范围内。这种稀释在标准测定条件下使420 nm处的吸光度值保持在0.1至1.0之间，考虑到可溶性酶的高催化速率。实验参数如下：

为了确定将ABTS转化为其自由基阳离子（ABTS+）的最佳反应时间，在420 nm处每隔5分钟监测反应20分钟。随后将反应时间固定在10分钟，并评估30°C至70°C之间的温度影响。底物浓度在100 mM柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH 4.0）中从0.01 mM变化至1.0 mM。最后，使用四种缓冲系统（均为100 mM）研究了pH对可溶性漆酶活性的影响：柠檬酸磷酸盐（pH-3.0至pH-8.0）、乙酸钠（pH-4.0至pH-7.0）、磷酸钾（pH-6.0至pH-9.0）和甘氨酸–NaOH（pH-9.0至pH-12.0）。

**2.6.2 可溶性漆酶的热稳定性和储存稳定性**

通过将可溶性漆酶在50°C、60°C和70°C下孵育长达180分钟来评估其热稳定性。同时，在4°C下每隔6天监测储存稳定性，包括可溶性酶和CLEAs的稳定性。在这两项研究中，稳定性均以残留酶活性的百分比表示。

**2.7 基于漆酶的生物催化系统（漆酶-CLEAs）的开发**

通过适当的试剂沉淀可溶性酶，然后加入交联剂来制备不可溶性漆酶基交联酶聚集体（L-CLEAs）。根据上述初步沉淀实验，选择硫酸铵作为该过程的最佳沉淀剂。然而，为了开发漆酶-CLEAs，改变了这种盐的浓度（50%、60%和70%；w/v）和交联剂的浓度（戊二醛：50.0 mM至150.0 mM），以确保有效开发不可溶性酶聚集体。交联因素包括反应温度（20°C）、摇动时间（72.0小时）和搅拌速度（150 rpm），如前所述。72.0小时后，使用离心（2000×g）在4.0°C下离心30.0分钟收集合成的不可溶性酶聚集体（漆酶-CLEAs）。上清液被用来评估剩余的总蛋白含量以及在交联反应过程中未能聚集的酶单位。乳木果酶-CLEAs（laccase-CLEAs）用柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH 4.0，100 mM）多次洗涤，以去除未结合的交联剂分子和未结合的可溶性乳木果酶。洗涤后的总蛋白含量和酶单位也进行了计算。经过连续的洗涤步骤后，乳木果酶-CLEAs使用硅胶珠作为干燥剂，在4.0°C的真空室中干燥。制备好的乳木果酶-CLEAs在4.0°C下储存，以进行进一步的表征。

2.8

扫描电子显微镜

通过日本的JSM 6389 A Jeol仪器，在不同的放大倍数下拍摄了制备好的乳木果酶-CLEAs的表面地形图像。

2.9

聚集产率（%）和聚集效率（%）的计算

聚集产率代表了交联过程的效率，量化了可溶性乳木果酶转化为不溶性聚集体的过程。在本研究中，产率是在受控环境参数（20°C和150 rpm）下孵育72小时后确定的。使用以下公式进行计算：

而聚集效率百分比是指成功聚集的蛋白质浓度，计算方法如下：

2.10

交联乳木果酶聚集体的表征（laccase-CLEAs）

在合成了具有功能活性的乳木果酶-CLEAs后，通过优化各种交联参数对其进行了动力学性能表征，并与可溶性乳木果酶进行了比较。还优化了底物和乳木果酶-CLEAs的催化反应时间，时间跨度为20.0分钟，间隔5.0分钟。通过在30°C到70°C的范围内进行催化反应，间隔10°C，确定了乳木果酶-CLEAs的最佳温度。ABTS浓度在0.5 mM到2.75 mM的范围内变化，用于计算最大速度（Vmax）、底物结合亲和力（Km）、底物特异性（Vmax/Km）、催化速率常数（kcat）和催化效率（kcat/Km）。还测试了四种不同的缓冲液，包括柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH-3.0到8.0）、醋酸钠缓冲液（pH-4.0到7.0）、磷酸钾缓冲液（pH-6.0到9.0）和甘氨酸NaOH缓冲液（pH-9.0到12.0），以测量有效的催化活性。

2.11

乳木果酶-CLEAs的热稳定性和储存稳定性

通过将CLEAs放置在50°C、60°C和70°C下长达180分钟来测定其热稳定性。酶活性以剩余活性的百分比来衡量。酶聚集体的储存稳定性则是通过定期进行酶测定来分析的，时间跨度为120天，间隔为06天。乳木果酶CLEAs与可溶性乳木果酶一样，也储存在4°C下。

2.12

乳木果酶-CLEAs的可重复使用性

通过在优化条件下进行连续的酶测定来评估乳木果酶-CLEAs的可重复使用性。在初始循环中测得的活性被定义为100%的剩余活性。为了确保去除任何残留的底物或产物，每次循环后用100 mM的柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH-4.0）洗涤乳木果酶-CLEAs三次。

2.13

可溶性乳木果酶和乳木果酶-CLEAs的热活化能的测定

在20°C到50°C的温度范围内确定了可溶性乳木果酶的活化能，在30°C到50°C的温度范围内确定了乳木果酶-CLEAs的活化能。活化能使用以下阿伦尼乌斯方程计算：

其中k是反应的速率常数；Ae是阿伦尼乌斯指数因子；Ea是活化能；R是气体常数；T是开尔文温度。活化能是使用以下方程计算得出的，该方程是从阿伦尼乌斯方程推导出来的，并且绘制了ln k与1/T之间的图表：

Ea = ?slope × R

其中Ea是活化能，R是气体常数。

2.14

可溶性乳木果酶和乳木果酶-CLEAs的热失活测定

在40°C到70°C的不同温度下，估计了可溶性乳木果酶和乳木果酶-CLEAs的各种参数，包括失活能（Ed）、吉布斯能变化（ΔG）、焓变（ΔH）和熵变（ΔS），以及特定时间间隔内的变化。还计算了可溶性乳木果酶和乳木果酶-CLEAs的剩余活性百分比，以估计热失活常数（kd）。对于每个温度，计算了剩余活性的自然对数（ln）。使用以下方程计算了失活常数：

其中A是热处理后的剩余活性；A0是初始活性；t是暴露于热的时间。观察到酶活性降低50.0%的温度被称为酶分子的半衰期（t1/2）。可溶性乳木果酶和乳木果酶-CLEAs的半衰期（t1/2）是按照之前的方法计算得出的：

十倍减少（1-log）D值所需的温度增加称为Z值，使用以下方程计算：

Z值是从log D与温度（°C）绘制的图表斜率计算得出的：

最后，通过绘制失活常数（Kd）与绝对温度的倒数的图表，考虑了非线性的阿伦尼乌斯方程来计算失活能：

Ed = ?slope × R

其中Kd是失活常数；k0是指数因子；Ed是失活能；T是开尔文温度；R是气体常数；ΔG是吉布斯能变化；ΔH是焓变；ΔS是熵变。

3

结果和讨论

通常，在化学计量反应中，使用特定量的反应物来生产特定数量的产品分子。在这种类型的化学反应中，所有的反应物分子都被完全消耗掉，因此具有较高的经济影响。大多数情况下，这些化学计量反应非常缓慢，需要高能量输入，同时在反应过程中也会产生一些不需要的副产品。许多化学过程成本高昂，而且产生的副产品对环境也有危害。随着时间的推移，来自不同类别的许多生物催化剂已经超越了传统的设置，用于合成多种化学代谢物和中间体。随后引入了不同类型的生物催化剂，以促进快速化学反应。生物过程中的自由酶分子对环境友好，但由于其可溶性，在反应完成后无法回收，有时还会在产品纯化步骤中造成干扰。考虑到这一点，当前的研究工作旨在支持可持续的绿色化学过程，这可能帮助行业降低生产成本，并且还可以支持多次重新利用生物催化剂反应物分子，因为重点是无溶剂版本的酶。许多不同类型的酶已被用于不同的工业化学过程中，但这些可溶性生物催化剂在化学反应完成后无法从反应混合物中回收。因此，为了克服这一缺点，之前引入了各种固定化技术，使用了不同类型的基质或支持系统。然而，这些不溶性基质在大规模应用上并不可行；因此，研究人员引入了一种新的无支持的不溶性酶固定化方法，称为交联酶聚集体。乳木果酶[E.C. 1.10.3.2.]是最稳定和坚固的生物催化剂之一，在工业应用中具有广泛的应用。在本研究中，详细地研究了基于乳木果酶的CLEAs的动力学特性，以支持其热动力学和稳定性，以及其在有毒化合物生物降解中的潜在应用。

3.1

可溶性真菌乳木果酶的生产和纯化

乳木果酶[E.C. 1.10.3.2]普遍由多种细菌、植物和真菌产生，而真菌乳木果酶因其在不同工业和环境设置中的多种应用而被广泛研究。此前，来自白腐真菌Trametes versicolor、Fomes fomentarius和Cerrena sp.的乳木果酶已被广泛研究。到目前为止，Trametes pubescens的乳木果酶在催化性能上被证明比其他真菌物种的乳木果酶更有效。这是因为它显示出显著的更高的催化效率，即在某些酚类底物上的活性大约是商用T. versicolor乳木果酶的四到五倍，并且对某些二酚类（如咖啡酸和没食子酸）具有更强的亲和力。在同一研究中，作者发现使用T. pubescens乳木果酶开发的生物传感器可能比基于Trametes versicolor乳木果酶的生物传感器更活跃，这是因为该酶的特异性。通常，选择T. pubescens乳木果酶是基于其高效的动力学性能和在废物流上可实现的高产量、低成本生产潜力。因此，在本研究中，使用蔗渣通过固态发酵生产了Trametes pubescens MB 89的乳木果酶。农业生物质是营养物质的复杂来源，特别是碳和氮，能够加速真菌的生长速度，无需任何补充；因此，利用农业剩余物和木质纤维素材料是一种环保且经济有效的方法，用于生产有用的生物材料和工业上重要的酶。在本研究中，使用农业工业废物在固态发酵下培养了真菌，得到了200 U的粗乳木果酶活性，比活性为434 U mg?1（表1）。发酵在30°C下进行了10天。类似的研究也报告了使用天然生物废物材料作为生产可溶性乳木果酶的有效底物。为了最大化从生物质中回收可溶性乳木果酶的量，使用柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH-4.0）加上Tween-80提取了细胞外酶。提取是在恒定搅拌速度180 rpm下进行的。提供缓冲液是为了维持酶的生理条件和稳定性；然而，也有报道称可以使用无菌蒸馏水进行酶的提取。之后，使用0.45 μM硝酸纤维素膜盘（Merck）进行了过滤，以确保去除残留的生物质。表1

从Trametes pubescens MB89中纯化可溶性乳木果酶

沉淀剂和浓度
总体积（ml）
酶活性（U）
总蛋白（mg）
比活性（U mg?1）
纯化倍数（%）
产率（%）

粗乳木果酶
1000
200 ± 50
0.46 ± 0.008
434 ± 20
1.0
100

硫酸铵（70%）
100
1200 ± 110
1.3 ± 0.058
923 ± 40
2.13
60

脱盐乳木果酶
90
1434 ± 120
1.3 ± 0.05
1103 ± 80
2.54
72

沉淀剂的性质在生物催化剂的沉淀过程中起着重要作用；一些沉淀剂可能导致酶活性的损失。一些水溶性的有机溶剂可能会促进酶的变性，?ztürk等人在serine碱性蛋白酶的情况下就证明了这一点。最初使用三种不同的沉淀剂（硫酸铵、PEG-6000和异丙醇）沉淀可溶性乳木果酶，观察到使用盐作为沉淀剂时乳木果酶可以有效沉淀。这表明基于聚合物或溶剂的沉淀剂可能导致酶活性的损失或可溶性酶的变性。结果显示，用70.0%硫酸铵沉淀的粗酶活性为1200 U（表1），而使用PEG-6000（25.0%）和异丙醇（50.0%）时观察到的乳木果酶活性要低得多（数据未显示）。之后，使用三种不同浓度的硫酸铵进行了梯度沉淀，观察到在最高硫酸铵浓度70.0%时，乳木果酶活性最高，比活性为1103 U mg?1。先前的研究也报告称，硫酸铵可能是对漆酶进行部分提纯的有效沉淀剂。15,32

3.2 漆酶交联聚集体（L-CLEAs）的开发

CLEAs的传统合成过程是一种简单、快速且经济的方法，它涉及在适当的二醛连接分子存在下生物催化剂分子之间的物理和化学相互作用。33,34 之前已经通过沉淀酶分子开发出了物理酶聚集体，而这些聚集体中的化学交联剂则导致了酶的不溶性稳定形式的合成。35 早期，基于漆酶的酶聚集体的开发和利用已被证明是脱色、氧化和生物降解染料和酚类化合物的有效且环保的方法。23 因此，在当前的研究中，最初通过添加硫酸铵盐（70.0%）通过物理相互作用方法沉淀了外源性生产的粗制可溶性漆酶，其比活性为434.0 ± 20.0 U mg?1，得到了923.0 ± 40.0 U mg?1的比活性（表1）。沉淀的酶分子经过脱盐处理（1103.0 ± 80.0 U mg?1），并在特定条件下通过结合戊二醛分子（50.0 mM）作为交联剂进行了化学交联。成功回收的不溶性形式的漆酶以聚集体形式存在，被命名为漆酶-CLEAs（L-CLEAs），其比活性为1639.0 ± 20.0 U mg?1，从而证明了催化活性漆酶分子的有效聚合。L-CLEAs的生产、纯化和合成完整流程在示意图中展示（图1）。图1

3.3 L-CLEAs的扫描电子显微镜图像

根据经典的成核理论，酶分子以聚集体形式发生共价交联是由于酶分子的可溶状态和不可溶状态之间的自由能变化引起的。合成聚集体的结构和大小取决于聚集体的成核和生长比率。通过扫描电子显微镜（SEM）对CLEAs的结构阐明有助于将其分类为两种不同类型之一，即I型和II型，正如先前所提出的。36 L-CLEAs的物理外观呈细粉状（图2A），而不同放大倍率下的表面形貌显示了聚集体的均匀多孔结构，类似于II型的特征（图2B–D）。II型L-CLEAs的合成可能是因为真菌漆酶的高糖基化以及更亲水的表面。37

3.4 优化L-CLEAs的开发交联参数

通过优化交联参数（包括沉淀剂和交联剂分子的特定浓度）进一步提高了催化活性（图3）。在评估了不同的沉淀剂（硫酸铵、PEG-6000和异丙醇）对可溶性漆酶的影响后，选择了硫酸铵，因为它具有高效的沉淀性能，适用于基于漆酶的酶聚集体的开发。硫酸铵是最常用的无机盐之一，用于CLEAs的合成；然而，应优化盐的适当浓度以获得更高功能活性的CLEAs。33 因此，在当前研究中，分析了三种不同浓度的硫酸铵（50.0%、60.0%和70.0%），观察到70.0%的硫酸铵浓度产生了大约53.0%的最大聚合效率（图3A）。而在50.0%和60.0%的浓度下，与70.0%相比，聚合效率较低。聚合效率较低的原因可能是沉淀剂的数量不足，不足以使漆酶分子聚集。其他研究者也报告了类似的效果。38,39 然而，除了硫酸铵外，据报道PEG-4000也能实现Trametes versicolor IBL-04产生的漆酶的最大沉淀。32

3.5 反应时间、反应温度和反应pH值的优化

还研究了催化性能对时间、反应pH值和反应温度的影响，结果以相对活性的百分比表示。每个参数的初始活性设定为100%。进行的实验探索了可溶性漆酶和L-CLEAs的最佳催化反应时间，结果表明，在可溶状态下，漆酶在05分钟内表现出最大催化作用；而在从可溶状态转变为聚集状态后，时间延长到了10分钟（图4A）。可能是通过交联剂分子的交联使酶分子在较小空间内聚集在一起，从而限制了底物分子的可用性。另一种可能是由于酶的聚集形式导致底物分子的质量传输受限，最终延长了酶-底物反应时间。36,48

3.6 选择具有特定pH值的合适缓冲液对生物催化剂的高效催化性能至关重要。因此，研究了使用不同缓冲液和恒定离子强度下的pH值来评估可溶性和L-CLEAs的催化性能。本研究的结果表明，L-CLEAs的催化性能高度依赖于缓冲液，在pH-4.0的柠檬酸-磷酸缓冲液中达到了最佳活性（98%相对活性）（图4C）。虽然可溶性漆酶和漆酶-CLEAs都明显偏好酸性条件，但CLEAs显示出更宽的pH稳定性。值得注意的是，固定化的聚集体在中性和微碱性环境中仍保持催化功能，而在这些条件下可溶性酶完全失活。这种扩展的pH耐受性表明，共价交联提供了一个坚固的结构框架，保护酶的活性位点免受脱质子化或高pH值下常见的羟基离子干扰的影响。先前的研究显示， Histidine和Cysteine残基是真菌漆酶催化 domain中比Lysine更为关键的氨基酸。42–44 此外，选择适当的酶和交联剂分子比例也是开发催化活性交联聚集体的关键任务。45 因此，在本研究中选择了三种不同浓度的戊二醛（50 mM、100 mM和150 mM）来有效交联可溶性漆酶/沉淀漆酶，注意到100 mM浓度的戊二醛产生了最高的聚合效率，即使浓度增加到150 mM，这一效率也基本保持不变（图3B）。另一方面，在50 mM浓度的戊二醛下观察到了大约33.0%的低聚合产量。在低交联剂浓度下聚合活性较低的一个可能原因是，二醛在同一酶内的分子内交联限制了酶之间的分子间交联，这阻碍了高效酶交联系统的合成。相反，过量的交联剂会导致过多的分子间和分子内连接，使蛋白质的构象结构变得僵硬，从而限制了质量传递，最终降低了CLEAs的酶活性。46–48 另一个可能性是，由于CLEAs的结构更为紧凑，底物结合口袋被阻止与特定底物对接，从而导致酶-底物反应延迟。

3.5 可溶性漆酶和基于漆酶的交联酶聚集体（L-CLEAs）的催化性能受反应时间、反应温度和反应pH值的影响也进行了研究，结果以相对活性的百分比表示。每个参数的初始活性设定为100%。进行的实验发现，在可溶状态下，漆酶在05分钟内表现出最大催化作用；而在从可溶状态转变为聚集状态后，时间延长至10分钟（图4A）。可能是通过交联剂分子的交联使酶分子聚集在一起，从而限制了底物分子的可用性。另一种可能是由于酶的聚集形式导致底物分子的质量传输受限，最终延长了酶-底物反应时间。36,48

选择具有特定pH值的合适缓冲液对生物催化剂的高效催化性能至关重要。因此，使用了各种缓冲液和恒定离子强度下的pH值来评估可溶性和L-CLEAs的催化性能。本研究的结果表明，L-CLEAs的催化性能高度依赖于缓冲液，在pH-4.0的柠檬酸-磷酸缓冲液中达到了最佳活性（98%相对活性）（图4C）。虽然可溶性漆酶和漆酶-CLEAs都明显偏好酸性条件，但CLEAs表现出更宽的pH稳定性。值得注意的是，固定化的聚集体在中性和微碱性环境中仍保持催化功能，而可溶性酶在这些条件下完全失活。这种扩展的pH耐受性表明，共价交联提供了一个坚固的结构框架，保护酶的活性位点免受脱质子化或高pH值下常见的羟基离子干扰的影响。先前的研究表明，将漆酶固定在各种固体载体上或将其发展为聚集体显著提高了其在更宽pH范围内的催化效率。15,52 可能是可溶性漆酶中较高的羟基离子浓度在铜位点上阻碍了氧化还原反应，从而在碱性条件下降低了催化性能。53 然而，在聚集体形成过程中，酶和交联剂之间的共价键的形成显著改变了酶的微环境。这种结构加固可能解释了与可溶性酶相比在更宽pH范围内性能的提高。54

3.6 可溶性漆酶和漆酶聚集体的稳态动力学和热力学参数

使用Hanes–Woolf图估计了以ABTS为底物的可溶性漆酶和漆酶聚集体的酶动力学参数（表2）。在漆酶聚集体的情况下，其Km值远高于可溶性漆酶的Km值，表明固定的漆酶对其底物的亲和力较低，因此漆酶聚集体的转化速率也较高，但催化效率较低。这种底物亲和力的降低归因于多种因素，包括固定化后蛋白质结构的构象变化、交联剂与底物分子之间的静电相互作用，以及增加的质量传递阻力限制了底物向酶活性位点的扩散。55 在基于漆酶的CLEAs的扩散限制情况下，漆酶分子的密集交联形成了多孔矩阵，阻碍了底物的质量传递。这通常会导致Km值升高，因为需要更高浓度的底物来饱和位于酶聚集物内部的酶。同时，从结构角度来看，也不能完全排除戊二醛交联可能导致轻微的构象扭曲或空间位阻（活性位点阻塞）。然而，显著活性的保留表明，即使在交联之后，漆酶的活性位点仍然大部分是可接近和具有功能的。虽然也观察到催化效率（kcat/Km）有所下降，但这种权衡是由于操作稳定性的显著提高。在工业生物催化中，能够在多个循环中恢复和重新使用酶及其对热/溶剂变性的增强抵抗力通常比初始催化速率更为经济重要。催化效率（kcat/Km）略有下降（从11.86降至9.09 s?1 mM?1），这完全是由于表观米氏常数（Km,app）增加了五倍。重要的是，催化速率常数（kcat）实际上在CLEA形式中增加了四倍多（5.355 s?1，相比于可溶性酶的1.281 s?1）。这表明，一旦底物到达活性位点，在固定化状态下催化转化明显更快。早期研究报道，来自Oudemansiella真菌分离物的漆酶聚集物的Km值高于可溶性酶。在另一项研究中，通过有序交联制备的交联酶具有更好的还原活性和更高的NADPH产生率，这些酶是通过戊二醛介导的纯醛酮还原酶和醇脱氢酶蛋白的交联获得的。这表明，在受控条件下制备的CLEA在酶反应催化方面存在差异。同样，另一项研究表明，有序交联产生的Km值较低，且催化效率优于位点特异性无序和随机交联方法。这些结果表明，有序CLEA中的酶保持了更高的底物亲和力，这可能是由于更有利的构象取向。因此，可以推断，当酶分子以最小的酶间距离组装，并且交联位点相互最佳定位时，底物转移被最大化。在本研究中，还观察到CLEA的活化能（Ea）从7.423 kJ mol?1下降到3.329 kJ mol?1。较低的Ea表明催化反应的能量障碍已经降低，这强烈表明活性位点仍然完全功能正常，甚至可能处于更有利于过渡态的构象中。失活能（Ed）从48.55 kJ mol?1增加到53.30 kJ mol?1，提供了CLEA对热展开更耐受的证据。同样，吉布斯自由能（kJ?1 mol?1 K?1）的变化也从95.56增加到100.10 kJ mol?1，从而证实了CLEA基体的热稳定性。还评估了可溶性漆酶和漆酶聚集体的热稳定性。L-CLEA的活化能（Ea）低于可溶性漆酶（3.329 kJ mol?1），而L-CLEA的失活能（Ed）高于可溶性漆酶（53.29 kJ mol?1），这表明CLEA更稳定，进行化学反应所需的能量更少。总体而言，Ea的降低和kcat的四倍增加表明交联过程没有损害内在的催化机制。当与在60°C时半衰期（t1/2）的显著延长和更高的失活能Ed相结合时，尽管底物亲和力看似降低，CLEA在长期操作中显示出明显的净收益。同样，当这两种酶形式在包括50.0°C、60.0°C和70.0°C在内的三种不同温度下暴露以计算半衰期（t1/2）时，结果再次支持L-CLEA具有更稳定的半衰期的假设，特别是在60.0°C时。L-CLEA在60.0°C下暴露时，半衰期大约增加了2.0倍。吉布斯自由能变化（ΔG）、焓变（ΔH）和熵变（ΔS）的略微较高值也表明了酶的热稳定性。在这项研究中，数据表明固定化的漆酶具有更高的吉布斯能量，这可能与酶的热稳定性相关。先前的文献也表明，酶聚集体的形成和固定化过程提高了固定化酶的热稳定性和热耐受性。

表2

Trametes pubescens MB 89产生的可溶性漆酶和漆酶基交联酶聚集体的动力学研究

参数
单位
Trametes pubescens MB 89产生的漆酶

可溶性漆酶
漆酶的CLEA

最大速度（Vmax）
U mg?1
1794
1639

底物结合亲和力（Km）
mM
0.108
0.589

底物特异性（Vmax/Km）
U mg?1 mM?1
16?611.11
2782.68

催化速率常数（kcat）
s?1
1.281
5.355

催化效率（kcat/Km）
s?1 mM?1
11.86
9.09

吉布斯自由能（ΔG）
kJ?1 mol?1 K?1
95.56
100.10

活化焓（ΔH）
kJ?1 mol?1 K?1
45.94
50.53

活化熵（ΔS）
kJ?1 mol?1 K?1
?0.155
?0.145

活化复合物形成的自由能（ΔGE–T）
kJ mol?1
?6867.95
?6129.56

活化能（Ea）
kJ mol?1
7.423
3.329

失活能（Ed）
kJ mol?1
48.554
53.295

50°C下的半衰期（t1/2）
min?1
423
494

60°C下的半衰期（t1/2）
min?1
210
406

70°C下的半衰期（t1/2）
min?1
127
154

3.7

可溶性漆酶和漆酶聚集体的储存稳定性和回收效率

酶的长期储存对于工业应用是一个重要参数。因此，也确定了可溶性和L-CLEA的储存稳定性，观察到在4°C下可溶性漆酶只能保持其酶活性长达24天（90.0%），而L-CLEA表现出类似的稳定性长达72天（图5A）。在此时间之后，两种情况都观察到了逐渐的下降。与可溶性漆酶相反，开发的漆酶聚集体即使在实验后120天内也能保持酶活性，这表明L-CLEA可以在更长的时间内使用，并具有有效的催化性能。图5

可溶性漆酶和基于漆酶的交联酶聚集体（L-CLEAs）的催化性能。(A) 随时间的储存稳定性；(B) 随使用循环次数的回收效率。在工业规模上利用酶时，酶的再利用也是一个重要参数。开发固定化版本的酶是提高生物催化分子回收效率的有效方法。当前研究表明，在20个循环中，L-CLEA在16个循环内仍然保持超过85.0%的催化活性（图5B），这比之前的报道数据要高得多。在依赖基质的固定化情况下，之前报告的回收效率仅减少到8-12个循环。这种催化性能的丧失可能是由于每个研究循环后涉及的多次洗涤步骤中固定化酶分子的泄漏或失活。因此，与依赖基质的固定化相比，开发酶聚集体可能在酶分子的再利用方面具有优势。

结论

漆酶被应用于各种绿色化学过程，包括聚合物合成和生物修复。对环境和工艺条件的敏感性阻碍了其广泛使用。本研究得出结论，交联酶聚集体可以作为提高真菌漆酶操作稳定性的有效技术。我们的发现表明，尽管聚集体基质引入了与扩散相关的Km增加，但它同时优化了酶的催化和结构韧性。催化速率常数（kcat）的四倍增加和活化能（Ea）的显著降低证实了漆酶活性位点在交联框架内仍然高度可接近且催化效率高。此外，其他参数强调了这种方法的成功；失活能（Ed）的增加和60°C下半衰期的翻倍表明了对热展开的优越保护效果。最终，这项研究表明，对于工业漆酶应用来说，操作寿命和周转频率的增加有效地抵消了底物亲和力的明显降低，提供了一个能够承受严苛工艺条件的强大生物催化平台。固定化的漆酶（L-CLEA）保持了长达120天的酶活性，并在20个循环中有16个循环保持催化活性。未来关于L-CLEAs在生物质预处理、纺织品废水修复和芳香族聚合物合成中的应用将进一步扩展基于酶的绿色化学的范围。

作者贡献

Afsheen Aman：概念化、资金获取、项目管理、资源、监督、验证、原始草稿编写以及审阅和编辑。Mohammad：数据整理、正式分析、方法论。Faiza Shahid：验证、可视化、原始草稿编写。Asma Ansari：方法论、审阅和编辑。Muhammad Sohail：资源。

利益冲突

作者声明他们没有可能被视为潜在竞争利益的财务利益和个人关系。

数据可用性

作者没有其他结果可以分享，因为所有数据都显示在本文中。

致谢

作者感谢卡拉奇生物技术及基因工程研究所（KIBGE）和巴基斯坦卡拉奇大学提供的本土支持、实验室设施和本土资金。