《Journal of Virological Methods》：Development of an ELISA-Based Pulldown Approach for Functional Analysis of Antigen-Specific Antibodies
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丽贝卡·斯蒂文顿（Rebecca Steventon）|卢卡斯·斯托勒（Lucas Stolle）|丽安娜·格雷戈里（Reanna Gregory）|露西亚·盖塔尼（Lucia Gaetani）|乔治·W·卡内尔（George W Carnell）|卡罗尔·麦金纳利（Carol
丽贝卡·斯蒂文顿（Rebecca Steventon）|卢卡斯·斯托勒（Lucas Stolle）|丽安娜·格雷戈里（Reanna Gregory）|露西亚·盖塔尼（Lucia Gaetani）|乔治·W·卡内尔（George W Carnell）|卡罗尔·麦金纳利（Carol McInally）|丽莎·贾维斯（Lisa Jarvis）|奈杰尔·坦珀顿（Nigel Temperton）|克雷格·P·汤普森（Craig P Thompson）
华威大学医学院，华威市，考文垂，CV4 7AL
摘要
识别抗原特异性中和抗体对于疫苗开发和治疗发现至关重要，然而现有的方法要么缺乏功能检测手段，要么不适用于大规模队列中的多克隆血清。在这里，我们描述了一种基于ELISA的沉淀法，可以从血清样本中分离出具有中和活性的功能性抗体，以供后续应用使用。我们使用3M MgCl?在HEPES缓冲液中优化了洗脱条件，这种方法能有效破坏抗体-抗原相互作用，而不会使固定化的抗原脱落或影响抗体功能。该检测方法对已知阳性样本的检测显示出100%的特异性和77.78%的敏感性。该方法与假型中和试验兼容，并确定了可以直接使用的最大可耐受MgCl?浓度，无需透析。作为概念验证，我们应用该方法识别了针对流感病毒血凝素（haemagglutinin）的域特异性中和抗体，区分了人类血清中的头部靶向和茎部靶向反应。这种方法提供了一个可扩展的平台，能够以表位水平解析功能性抗体反应。
引言
识别和表征抗原特异性抗体在推进临床治疗和疫苗开发方面具有巨大潜力。例如，单克隆抗体（mAb）疗法依赖于抗原特异性抗体通过受体阻断、膜融合抑制或抗体依赖性细胞毒性（ADCC）等机制来中和病毒（Both等人，2013年；Chen等人，2020年；Hessell等人，2007年）。在流感背景下，针对血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）表面糖蛋白的单克隆抗体在临床前和临床研究中均显示出有效性（Sloan等人，2020年；Steventon等人，2025年；Wolters等人，2024年）。
在疫苗开发中，识别抗原特异性抗体有助于合理设计能够引发广泛中和反应的免疫原。由于流感病毒等病毒经常发生抗原漂变和偶尔的变异，因此识别针对保守且功能关键表位的抗体至关重要（Lin等人，2025年；Thompson等人，2018年）。这些抗体不仅为疫苗设计提供信息，还支持旨在追踪新出现变种和指导公共卫生响应的免疫监测工作（Harvey等人，2021年；Jian等人，2025年）。
目前有多种方法用于识别功能性抗体并绘制其表位特异性。单B细胞分选后进行单克隆抗体生产可以精确绘制表位图谱，特别是结合冷冻电镜（cryo-EM）或X射线晶体学等结构技术时（Madsen等人，2020年；Wu等人，2010年）。然而，这些方法通量低、资源消耗大，且通常仅限于单克隆抗体，而不适用于多克隆血清。使用已知单克隆抗体的竞争性ELISA可以推断血清中的表位特异性，但无法直接测量抗体的功能能力（Bansal等人，2024年）。突变扫描和逃逸突变分析可以提供功能图谱（Starr等人，2020年；Stuart等人，2017年），但在大规模应用时往往不切实际，且难以应用于复杂的多克隆反应。结合中和试验的域特异性ELISA更具可扩展性，但依赖于相关数据，因为它们分别测量结合和中和作用，而不是直接将表位特异性与中和功能联系起来（Van Ert等人，2022年）。因此，现有方法存在一个空白：需要一种可扩展的功能性检测方法，能够直接识别多克隆样本中针对特定抗原区域的中和抗体。
为填补这一空白，本研究描述了一种基于ELISA的沉淀法，旨在分离具有中和活性的抗原特异性抗体，以便将其用于后续应用，如假型中和试验和抗体亚类、同型和糖基化的质谱表征。通过检测针对流感HA全长和头部域的中和抗体，评估了该方法的适用性。这项工作提供了一个广泛适用的平台，能够以域水平解析功能性抗体反应，支持治疗和疫苗相关研究。
章节片段
病毒、抗体和蛋白质
使用6x-His标签单克隆抗体（Invitrogen）来确定his标签蛋白的存在，并作为优化步骤的对照抗体。Anti-Strep标签抗体（Biotrend）也用作优化步骤的对照抗体。山羊抗小鼠IgG（Merck Millipore）用于蛋白质和抗体的化学发光检测。Strep标签蛋白由Nicholas Briggs博士提供。获得了B/Phuket/3073/2013和B/Washington/02/2019全长流感HA。
确定功能性抗体洗脱的最佳缓冲条件
最佳洗脱缓冲液必须满足三个标准：（1）不得破坏抗原与ELISA板的结合；（2）必须破坏抗体-抗原相互作用；（3）洗脱后的抗体必须保持其功能。通过文献搜索和行业标准筛选多种洗脱条件后，我们发现MgCl?在不同浓度和洗脱时间下都不会破坏抗原与ELISA板的结合（图1A）。为了评估MgCl?
讨论
现有方法在检测抗原特异性抗体的功能能力方面存在显著空白。基于结合的检测方法（如ELISA和Luminex多重血清学）可以解析抗原或表位特异性，但无法评估抗体功能；而功能性检测方法（如假型或活病毒中和）可以测量活性，但无法将其归因于针对抗原特定区域的抗体。这些方法通常
资金支持
R.S.获得了医学研究委员会Impact Accelerator Account的资助[资助编号MR/X502674/1]。RG由英国华威大学的全球大流行规划研究所资助，作为一项慈善支持的博士项目的一部分。L.G.通过医学研究委员会的博士培训项目资助[MC_UP_A025_1011]。C.P.T.获得了国防科学技术实验室的资助[资助编号RQ31692]。C.P.T.还获得了
CRediT作者贡献声明
丽贝卡·斯蒂文顿（Rebecca Steventon）：概念构思、研究、方法设计、验证、可视化、初稿撰写、审稿与编辑。克雷格·汤普森（Craig Thompson）：概念构思、资金获取、项目管理、监督、初稿撰写、审稿与编辑。丽安娜·格雷戈里（Reanna Gregory）：研究、方法设计、可视化、初稿撰写、审稿与编辑。卢卡斯·斯托勒（Lucas Stolle）：概念构思、研究、方法设计。乔治·W·卡内尔（George W Carnell）：资源提供
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
