《Journal of Virological Methods》：Development of dual-mode recombinase polymerase amplification assays integrated with fluorescence and biosensor for rapid Monkeypox detection
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摘要
猴痘病毒（Monkeypox virus, MPXV）的再次出现凸显了对快速、可部署的诊断方法的迫切需求，以支持有效的监测和疫情应对。本研究开发了两种基于重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA
摘要
猴痘病毒（Monkeypox virus, MPXV）的再次出现凸显了对快速、可部署的诊断方法的迫切需求，以支持有效的监测和疫情应对。本研究开发了两种基于重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）的检测方法，通过将RPA与荧光监测或侧向流动生物传感器（Lateral Flow Biosensor, LFB）读数相结合，分别称为荧光RPA-MPXV和LFB-RPA-MPXV检测法。两种检测均在39 °C的等温条件下进行，可在20分钟内有效完成。荧光RPA-MPXV检测法可通过实时荧光监测或蓝光辅助的终点可视化实现检测，而LFB-RPA-MPXV检测法则允许使用免疫层析试纸条进行无需仪器的检测。分析评估显示其具有卓越的灵敏度，使用质粒模板的检测限（Limit of Detection, LoD）为14拷贝，并且特异性高，对28种非MPXV病原体未观察到交叉反应。进一步使用模拟临床标本（包括掺有假型MPXV的皮肤拭子、痰液和血浆）评估了其诊断适用性。在所有测试的基质中，浓度低至45拷贝时均可实现一致检测，且所有阴性对照均保持阴性，表明基质干扰可忽略不计，检测性能高度稳定。总的来说，荧光RPA-MPXV和LFB-RPA-MPXV检测法提供了快速、多功能的诊断工具，可作为现有分子检测方法的补充，支持即时检测（Point-of-Care Testing, POCT）和面向现场的MPXV监测，特别是在实验室基础设施有限的环境中。
一、 研究背景、问题与研究目的
猴痘（Mpox）是由猴痘病毒（MPXV，一种双链DNA病毒）引起的人畜共患病毒性疾病。2022年的全球疫情将MPXV的流行病学影响范围显著扩大，尽管疫情规模相比高峰时期已大幅缩减，但散发性传播持续存在，凸显了对灵活的监测工具的持续需求。根据世界卫生组织（WHO）的临时指南，核酸扩增检测（NAATs）是确认MPXV感染的推荐实验室方法。其中，实时聚合酶链式反应（qPCR）由于其卓越的分析灵敏度和特异性而被广泛视为参考标准。然而，qPCR通常需要专门的仪器、受控的实验室环境和训练有素的人员，这限制了其在分散式检测环境和资源有限地区的应用。等温NAAT方法，如重组酶聚合酶扩增（RPA）、环介导等温扩增（LAMP）和多重交叉置换扩增（MCDA），因其在恒定温度下实现核酸扩增、降低设备需求的特点，有望成为传统PCR的替代方案，非常适用于即时检测（POC）。与通常在较高温度（60-70 °C）下运行且涉及复杂引物设计的LAMP和MCDA相比，RPA在较低温度（37-42 °C）下进行，仅需单个引物对，且扩增时间短，简化了检测方法的开发和操作，便于与多种信号读出形式整合。为了应对现场快速诊断的需求，本研究旨在开发两种基于RPA的检测平台，用于快速检测MPXV，以补充现有的实验室检测方法，支持现场监测。
研究人员开展了整合荧光与侧向流动生物传感器（LFB）读数的双模式RPA检测方法研究，分别称为荧光RPA-MPXV和LFB-RPA-MPXV检测法。研究发现，这两种方法具有高灵敏度、高特异性、快速、对设备要求低等优点，适用于实验室和资源有限的环境。这项研究发表在《Journal of Virological Methods》上，对于应对猴痘疫情、发展现场快速诊断技术具有重要意义。
二、 关键技术方法
本研究的关键技术方法围绕两种RPA检测平台的建立与评估展开，主要包括：1. 靶点与引物/探针设计：选择MPXV的A型包涵体（ATI）基因的一个保守片段作为扩增靶点，以确保特异性。基于RPA原理设计了5组RPA引物（经评估后选择第3组）及对应的exo探针（用于荧光检测）和nfo探针（用于生物传感器检测）。2. 检测平台构建：将RPA与exo探针结合构建荧光RPA-MPXV平台，可实现实时荧光监测和蓝光终点可视化；将RPA与nfo探针结合构建LFB-RPA-MPXV平台，通过侧向流动生物传感器试纸条实现无需仪器的检测。3. 性能评估体系：通过使用含靶标ATI序列的质粒进行10倍系列稀释，评估检测灵敏度（确定检测限，LoD）。利用来自中国疾病预防控制中心（China CDC）和首都儿科研究所（CIP）的28种非MPXV病原体核酸样本，通过湿实验验证检测特异性。4. 模拟临床样本评估：通过将不同浓度的假型MPXV病毒颗粒掺入健康个体捐赠的皮肤拭子、痰液和血浆样本中，制备了24份模拟临床样本，以评估检测方法在实际样本基质中的适用性。所有实验均包含空白对照和阴性对照，关键实验进行三次重复以确保可靠性。
三、 研究结果
3.1. 荧光RPA-MPXV和LFB-RPA-MPXV平台的开发
研究人员构建了两种互补的RPA检测平台，共享相同的等温扩增基础（RPA技术），但在信号呈现和应用场景上不同。荧光RPA-MPXV平台可将扩增结果转换为荧光信号，支持实时监测或蓝光终点观察。LFB-RPA-MPXV平台则适用于便携和低资源场景，扩增产物通过LFB试纸条在5分钟内实现肉眼判读。两种平台均能在40分钟内（包括约15分钟样本准备时间）完成MPXV检测。
3.2. 荧光RPA-MPXV和LFB-RPA-MPXV平台的验证
通过设计5组靶向ATI基因的RPA引物并进行评估，选择了扩增效率和特异性高的第3组引物用于构建检测平台。验证实验证实，两种检测方法均能准确识别MPXV靶标。荧光RPA-MPXV检测中，仅含ATI质粒模板的反应产生典型的扩增曲线和荧光信号；LFB-RPA-MPXV检测中，仅含ATI质粒模板的反应在测试线（TL）和控制线（CL）均出现红色条带，而空白对照（蒸馏水）仅在CL显示条带。这证实了两种方法用于MPXV检测的可行性。
3.3. 荧光RPA-MPXV和LFB-RPA-MPXV平台的灵敏度和特异性
灵敏度评估显示，两种检测方法对ATI质粒DNA的检测限（LoD）均为14拷贝/微升（1.4 × 101copies/μL）。低于此浓度的样本未检测到信号，表明两种方法具有可比的优异分析灵敏度。特异性评估显示，两种检测方法对28种非MPXV病原体（包括多种病毒和细菌）的核酸样本均无交叉反应，仅对MPXV ATI质粒产生阳性信号。此外，通过生物信息学序列比对也证实，所设计的引物和靶标扩增子与牛痘病毒（CPXV）、天花病毒（VARV）、疫苗病毒（VACV）和骆驼痘病毒（CMLV）等同属正痘病毒具有极低的同源性，进一步验证了其严格的特异性。
3.4. 荧光RPA-MPXV和LFB-RPA-MPXV在模拟临床样本中的表现
在模拟临床样本（皮肤拭子、痰液、血浆）中的评估表明，两种检测方法在病毒浓度≥45拷贝/样本时均能一致产生阳性结果。所有阴性对照样本（未掺入假型病毒）均为阴性。三种不同样本基质中均未观察到基质依赖性干扰，表明检测方法在模拟临床样本中保持了稳健的检测能力，适用于实际的MPXV诊断。
四、 讨论与结论
讨论总结：
MPXV的持续传播凸显了在分散式和资源有限环境中对快速、现场诊断工具的迫切需求。本研究开发的荧光RPA-MPXV和LFB-RPA-MPXV平台通过将RPA技术与exo和nfo探针整合，提供了灵敏、特异、设备依赖度低且具有多种直观读出格式的解决方案。与需要复杂仪器的qPCR相比，这两种方法显著降低了设备要求和操作复杂性。与LAMP、MCDA等其他等温技术相比，RPA在接近生理温度下运行，具有更高的抑制剂耐受性，并支持实时荧光、终点荧光和LFB三种实用检测格式。该方法表现出与qPCR相当的分析灵敏度，且对非MPXV病原体无交叉反应。尽管本研究使用假型病毒模拟样本进行了评估，但在多样本基质中一致、稳定的性能显示了其在真实世界诊断中的潜力。研究人员也指出，未来需要使用真实临床样本进行进一步验证，以确立其临床诊断性能。此外，该方法目前为定性检测工具，若需定量评估病毒载量则需进一步改进。高灵敏度等温扩增方法普遍存在的交叉污染风险也需在操作流程设计中加以考虑。尽管靶向的是保守的MPXV基因组区域，但在推广应用于谱系鉴别或大规模实施前，仍需使用代表不同临床背景、地理区域和病毒进化支的样本进行更广泛的验证。
研究结论（翻译）：
在本研究中，研究人员开发了荧光RPA-MPXV和LFB-RPA-MPXV检测法，通过将重组酶聚合酶扩增与荧光和生物传感器读数整合，用于快速MPXV检测。该检测法表现出优异的分析灵敏度，检测限为14拷贝，并且对广泛的非MPXV病原体具有完全特异性，同时需要最少的仪器，并支持通过实时荧光、蓝光可视化或侧向流动分析进行灵活的结果判读。使用多种样本基质中的模拟临床样本进行的评估证明了所提出方法的稳健性和转化潜力。尽管需要使用真实临床样本进行进一步验证以确定其临床性能，但这些检测法提供了适应性强的工具，可作为现有分子诊断方法的补充，并支持在基于实验室和分散式检测环境中的MPXV监测。
