《Molecular & Cellular Proteomics》：A proteogenomic approach to discover novel lncRNA-derived microproteins and their potential clinical utility in hepatocellular carcinoma
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微蛋白（即多肽）在多种生物学背景下发挥的功能日益得到认可，但其临床相关性和应用价值在很大程度上仍未得到探索。蛋白基因组学方法通过整合蛋白质组数据与基因组学和转录组学证据，可以加速在临床样本中发现微蛋白。然而，长链非编码RNA (long noncoding R
微蛋白（即多肽）在多种生物学背景下发挥的功能日益得到认可，但其临床相关性和应用价值在很大程度上仍未得到探索。蛋白基因组学方法通过整合蛋白质组数据与基因组学和转录组学证据，可以加速在临床样本中发现微蛋白。然而，长链非编码RNA (long noncoding RNA, lncRNA) 来源的微蛋白 (lncRNA-derived microproteins, lncPeps) 在很大程度上仍未得到鉴定，导致存在无法匹配的串联质谱 (MS/MS) 谱图。为解决此问题，研究人员利用高质量核糖体测序 (Ribo-seq) 翻译组数据集，构建了一个广泛的人类肝脏lncRNA来源的开放阅读框 (lncRNA-derived open reading frames, lncORFs) 数据库，随后将其应用于来自肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma, HCC) 患者的肿瘤-癌旁正常组织对的蛋白质组学数据。通过使用新数据库，研究人员发现了104个新的lncPeps，其中包括46个在肿瘤与非肿瘤组织间差异表达的lncPeps，以及13个与患者预后显著相关的lncPeps。值得注意的是，在LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) 回归模型中，将lncPeps的表达与经典蛋白的表达相结合，提高了对HCC复发的预测性能，在三个复发时间点上将受试者工作特征曲线下面积 (Area Under Curve, AUC) 提高了0.005至0.085。这些发现表明，lncPeps的发现有助于我们理解HCC的分子异质性和进展，并拓宽了该疾病的潜在生物标志物候选物或治疗靶点的范围。
论文解读：基于翻译组学的蛋白基因组学方法揭示肝细胞癌中新型lncRNA来源微蛋白及其临床潜力
一、 研究背景、问题与动因
肝细胞癌是全球癌症相关死亡的第三大原因，在西方国家是增长最快的癌症相关死因。尽管早期手术治疗可能有效，但HCC一旦发展，其总体五年生存率仍仅为50-70%。分子异质性是HCC面临的主要挑战，导致低应答率、耐药性和免疫逃逸。深入了解肿瘤异质性的分子机制至关重要。同时，HCC的早期诊断依然困难，临床上可用于HCC管理的生物标志物开发缓慢。甲胎蛋白作为生物标志物在临床上已使用超过六十年，但其诊断价值因敏感性和特异性不稳定而存在争议。因此，发现新的生物标志物和治疗靶点具有迫切需求。
蛋白质组学分析为生物标志物发现和治疗策略提供了关键见解。然而，人类蛋白质组中仍有相当一部分未被表征。其中，微蛋白（即多肽）是长度小于100个氨基酸的多肽，其功能日益受到关注。大量未注释的微蛋白可能嵌套在长链非编码RNA中。lncRNA来源的微蛋白已被证明在多种生理和病理环境中发挥作用，包括癌症。在HCC中，已有研究报道了数个具有特定功能的lncPeps，例如KRASIM、PINT87aa、SMIM30等，它们通过不同的分子机制影响肿瘤进展。然而，由于lncPeps的非经典特性及其在蛋白质组数据中的噪音，传统基因组注释工具难以对其进行系统注释，导致大量lncPeps未被识别，这限制了对其临床相关性和应用潜力的全面评估。为了系统地发现HCC中具有临床意义的lncPeps，研究人员开展了此项研究。
二、 关键研究方法概要
本研究采用了一个整合翻译组学和蛋白质组学的蛋白基因组学工作流程。研究人员首先从公共数据库获取了来自人类肝脏细胞系和组织（包括HCC细胞系、正常肝细胞、癌及癌旁组织）的高质量核糖体测序数据集，经过严格的长度、读框周期性和P位点偏移等质量控制，筛选出17个高质量数据集用于后续分析。利用GENCODE (v46) 和NONCODE (v6) 的lncRNA注释，结合RiboCode、Ribo-TISH和ribotricer三种ORF识别工具，预测了人类肝脏中具有翻译潜力的lncORFs，并构建了三个不同严格程度的lncORF定制数据库。为了在HCC患者样本中鉴定lncPeps，研究人员从已发表的两个独立HCC患者队列中获取了蛋白质组学数据：一个是来自Jiang等人的103例早期HCC患者的无标记定量数据集，另一个是来自Gao等人的159例与乙肝病毒感染相关的HCC患者的串联质量标签数据集。使用FragPipe计算平台，将定制lncORF数据库与UniProt人类蛋白数据库结合，对质谱数据进行搜索和肽段鉴定。为控制假阳性率，采用了组特异性错误发现率估计和两轮搜索策略。对鉴定到的lncORF来源肽段，研究人员从谱图支持度、肽段-谱图匹配质量和肽段分配准确性三个层面进行了系统的质量评估，并计算了总体肽段置信度评分。最后，对鉴定出的lncPeps进行了定量、生物统计学分析（包括差异表达、生存分析和回归建模）以及功能预测。
三、 研究结果
1. 基于编码潜力系统评估人类肝脏中的lncORFs
研究人员整合了来自肝脏相关样本的31个Ribo-seq数据集，经过严格质控，构建了高质量的人类肝脏Ribo-seq数据集。利用三种工具预测了活跃翻译的lncORFs，其中Ribo-TISH、RiboCode和ribotricer分别从不同数量的基因中预测了数千个lncORFs。与已知编码序列相比，预测的lncORFs在相位分数和读段密度上具有可比性，且显著高于lncRNA随机序列对照，表明其具有类似的核糖体占据和翻译特征。实验验证的HCC相关lncPeps，如KRASIM和MPM，也被成功预测，其RPF读段轨道显示出显著的三联体周期性，验证了预测流程的可靠性。
2. 从质谱数据中鉴定lncPeps
为优化lncPep的鉴定，研究人员评估了三种lncORF数据库和两种错误发现率控制策略。结果显示，由至少一种工具预测的lncORF构成的数据库2，结合组特异性FDR估计，在保持严格错误控制的同时，显示出最佳的鉴定灵敏度。将肽段与已知蛋白进行比对后，过滤掉完全匹配或仅有一个氨基酸错配的肽段，以排除潜在的单氨基酸多态性产物。最终，在Jiang和Gao的两个数据集中，分别鉴定出43个和126个推定的lncORFs来源的肽段。
3. 对匹配lncORF的肽段进行质量评估
研究人员对鉴定到的肽段进行了全面的质量评估。在肽段-谱图匹配层面，lncORF来源肽段与经典ORF来源肽段在HyperScore、Delta分数和PeptideProphet概率等指标上具有可比的质量。开放搜索分析进一步评估了可重复性。在肽段分配准确性层面，通过ProteoMapper和miniprot评估了肽段与已知蛋白或基因组的匹配情况，以排除可能的序列变异事件。整合各项评估指标后，研究人员为每个肽段计算了总体置信度评分，并将其分为三个置信等级，其中36个肽段被归类为高置信度。
4. 理化性质限制了lncORF的质谱检测
整合两个数据集共鉴定出104个lncPep，对应153个lncORF。研究人员分析了质谱匹配与不匹配lncORF的理化性质差异。通过LASSO回归和随机森林建模发现，ORF长度是影响质谱可检测性的最重要特征，其影响很大程度上可由理论胰蛋白酶酶切肽段数量所解释。此外，某些与蛋白质结构域接头和α螺旋倾向相关的AAindex特征也与检测率相关。对鉴定到的lncPeps进行Pfam结构域分析发现，最常见的结构域包括肌动蛋白家族、Gp_dh_C和HSP90家族。亚细胞定位预测显示lncPeps主要定位于细胞质。
5. 新型lncPeps显示出作为HCC患者预后生物标志物的潜力
研究人员评估了lncPeps的临床效用。在肿瘤组织分类和生存预后模型中，仅使用lncPeps的模型性能不佳，且加入lncPeps信息未能显著提升基于经典蛋白的模型性能。然而，在复发预后模型中，结合lncPeps表达显著提高了预测性能。这表明lncPeps在HCC复发预后中具有功能相关性和积极的贡献。
6. 单个lncPeps与肿瘤和患者预后相关
通过差异表达和回归分析，研究人员发现了一批与癌组织状态或患者预后显著相关的lncPeps。例如，PPIAP79 lncORF1在肿瘤组织中上调，SEPTIN7P8 lncORF1在非肿瘤组织中表达更高。HNRNPA1P36 lncORF1在肿瘤中上调，其高表达与较差的总体生存期相关。POTEKP lncORF2同样在肿瘤中上调，高表达与较差的无病生存期相关。对TCGA转录组数据的分析显示，部分来源lncRNA的表达也与患者预后相关。基因集富集分析揭示了这些代表性lncPeps可能参与的生物学过程，如线粒体翻译、免疫反应和mRNA加工。
四、 讨论与结论
本研究构建了一个整合组织特异性核糖体测序数据的蛋白基因组学工作流程，用于在HCC中系统地发现lncPeps。通过优化计算蛋白质组学流程，研究人员成功鉴定了104个lncPep。研究发现，大多数鉴定到的lncPeps来源于假基因，这可能反映了不同基因组来源的lncRNA编码的lncPeps具有不同的生物学角色。理化性质分析表明，ORF长度和理论酶切肽段数量是影响质谱检测率的关键因素，蛋白质结构特征如结构域接头倾向性和α螺旋含量也与之相关，这解释了为何较短的lncORFs（如ribotricer预测的）在基于胰蛋白酶的蛋白质组学中检出率较低。
本研究聚焦的三个代表性lncPeps中，POTEKP lncORF2和HNRNPA1P36 lncORF1均与肿瘤状态和患者预后显著相关。这些关联在TCGA RNA-seq数据中也有部分体现，表明非经典蛋白质编码可能为解释RNA表达与癌症的相关性提供了除竞争性内源RNA机制外的另一种解释。
总之，本研究的发现证实了所构建的蛋白基因组学流程在发现新型lncPeps方面的潜力。尽管目前对这些lncPeps的理解仍非常有限，但越来越多的证据表明它们在人类生理功能和疾病中扮演重要角色。这项工作值得未来在更多癌症类型中研究lncPeps，以帮助更好地表征肿瘤异质性，扩展生物标志物库，并最终使患者受益。论文发表于《Molecular & Cellular Proteomics》期刊。
