五磷酸化“魔法斑点”核苷酸：基于化学酶合成与拆解的传感技术?

《Organic & Biomolecular Chemistry》：Pentaphosphorylated magic spot nucleotides: chemoenzymatic synthesis and disassembly-based sensing?

　　帕特里克·莫泽（Patrick Moser）| 苏布拉·康蒂·罗伊（Subhra Kanti Roy）| 马文·赫尔佐格（Marvin Herzog）| 费利克斯·鲍尔（Felix Bauer）| 费利克斯·沃伦萨克（Felix Wollensack）| 伯恩哈德·布赖特（Bernhard Breit）| 海宁·J·耶森（Henning J. Jessen）
弗莱堡阿尔伯特-路德维希大学有机化学研究所
德国弗莱堡布赖斯高区阿尔伯特街21号，79104
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魔法点核苷酸（MSN），即（p）ppGpp和（p）ppApp，在细菌应激信号传导中起着核心作用，但其选择性检测和化学可访问性仍受到限制。本研究提出了一种可扩展的化学酶法合成天然和功能化的五磷酸化MSN的方法，该方法基于环状焦磷酸磷酰胺（cPyPA）介导的磷酸化作用以及RNase T2催化的水解反应。该方法能够制备出定量的3′-单磷酸盐（ppAp、ppGp）以及五磷酸化产物pppApp和pppGpp。同时，还开发了一种基于金属-配体解离的荧光探针，该探针可在水环境中用于选择性地检测MSN。研究表明，当报警素与Fe(iii)-salen复合物结合时，会通过释放水杨醛导致其脱金属化并激发荧光，这一现象得到了理论和光谱学的支持。该探针对（p）ppGpp和（p）ppApp的选择性比其他核苷酸高两到三倍，并且对含有3′-和5′-焦磷酸基团的MSN反应最为敏感。此外，该探针还能在体外检测金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）RelP反应产生的ppGpp。本研究结合了五磷酸化MSN的可靠合成路线和易于使用的荧光传感器，为未来研究细菌应激信号传导奠定了基础。

**引言**
高磷酸化的鸟苷和腺苷核苷酸（（p）ppGpp和（p）ppApp，统称为魔法点核苷酸（MSN），在细菌应激信号传导和适应过程中起着关键作用。1 在氨基酸缺乏、热休克或氧化应激等环境下，RelA酶、SpoT酶和小报警素合成酶（SAS）会将焦磷酸（PPi）从ATP转移至GDP或GTP的3′-羟基上，从而合成（p）ppGpp。2, 3 这一过程触发了所谓的“严格反应”（strict response），这是一种保守的细菌生存机制，会导致细胞代谢的全面重组。（p）ppGpp的积累直接调节RNA聚合酶的活性，进而影响参与代谢、毒力和抗生素抗性的多种基因的表达。2, 3, 4 此外，（p）ppGpp还参与肠球菌（Enterococcus faecalis）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas putida）的生物膜形成，将其与慢性感染和抗生素耐受性的增加联系起来。5 （p）ppGpp也在植物中被发现，它控制叶绿体和细胞核中的转录和翻译，并参与对环境压力的适应。6 另外，如（p）ppApp这样的腺苷衍生物作为一种额外的调控信使正在被研究，尽管其生物功能尚未完全阐明。7 鉴于其核心调控作用，获得（p）ppGpp和（p）ppApp对于理解细菌的持久性和信号通路至关重要。目前可用的检测方法包括放射性标记、薄层色谱、HPLC-UV、LC-MS和CE-MS分析。8, 9, 10 使用UPLC-ESI-qMS/MS还定量测定了拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的ppGpp积累情况。11, 12 尽管基于LC-MS的方法灵敏度较高，但需要复杂的设备，不适合实时测量。8, 13 近年来，虽然开发了比色和荧光传感器，但其中一些系统存在合成复杂或在水介质中稳定性差的问题。14 MSN的高效化学合成也一直是一个挑战。经典的磷酸化策略或酶法通常只能获得毫克级的这些高电荷核苷酸，并可能产生难以分离的2′/3′-区域异构体混合物。15 为了解决这些限制，我们开发了一种稳健且可扩展的化学酶法合成路线，以制备五磷酸化MSN pppGpp和pppApp。该方法基于cPyPa介导的磷酸化，随后通过乙二胺开环和RNase T2催化的水解反应实现区域选择性的3′-单磷酸盐的形成（方案1a）。16, 17, 18 这些中间体可以进一步转化为标准化的和功能化的五磷酸化MSN。

**基于此合成方法，我们进一步开发了一种可用于水中实时检测（p）ppGpp和（p）ppApp的荧光传感器。** 受到磷酸盐和焦磷酸传感器“解离策略”的启发，我们基于Fe(iii)-salen复合物设计了这种探针。目标分析物与金属中心的结合会引发复合物的解离，从而导致荧光信号的产生（方案1b）。

**结果与讨论**
**pppApp和ppGpp的可扩展获取**
以往合成五磷酸化MSN（pppNpp）的方法基于使用cPyPa进行核苷酸磷酸化，19 其中使用了丙炔胺来打开环状中间体。16 尽管这种方法可以获取氨基功能化的pppNpp衍生物，但随后的磷酸酰胺酸催化裂解会导致敏感的五磷酸体的部分水解。为克服这一限制，我们改用了乙二胺，18 这是一种最近被证明能高效打开环式三磷酸中间体的方法。17 腺苷和2-N-(Fmoc)-鸟苷与过量的cPyPa在5-(乙硫)-1H-四唑（ETT）存在下反应，随后用mCPBA氧化，生成相应的双环三磷酸中间体（方案2），这些中间体为5′,2′-和5′,3′-环状三磷酸异构体混合物。由于鸟苷在DMF中的溶解度低，实验前需对其进行Fmoc保护基团的引入。11, 12

这些中间体在乙二胺作用下经历线性化和分子内环化反应，去除γ-磷酸基团（作为磷酰胺）。16, 17 胺同时作为亲核试剂和碱，促进5-外环化为相应的2′,3′-环状磷酸中间体。过量的胺还会断裂鸟苷衍生物上的Fmoc保护基团。所得的2′,3′-环状磷酸体在37°C和pH 5.5条件下经RNase T2催化水解，仅生成相应的3′-单磷酸盐ppAp和ppGp（与先前关于RNase介导MSN水解的报告一致）。16, 17 经SAX色谱纯化后，分别以64%和42%的产率得到ppAp和ppGp的铵盐形式。

**后续磷酸化**
在ETT存在下，使用Fm-P-酰胺化学方法进行进一步磷酸化，随后用mCPBA氧化并去除Fm保护基团，分别得到ppApp和ppGpp，产率分别为89%和86%。该过程仅需两个分离步骤，因为所有其他步骤都可以在同一烧瓶中完成。总体而言，这种方法能够非常高效地合成五磷酸化MSN。

**MSN的化学传感器**
ppGpp和ppApp也是根据Haas等人的方法从腺苷和鸟苷合成的。21 在该方法中，核苷与焦磷酸氯反应生成氯磷酸中间体（方案3），这些中间体水解后产生相应的2′,3′-环状磷酸中间体。21 但在大规模应用时，淬火步骤的选择性较低，可能导致2′/3′-区域异构体混合物的产生，这些混合物难以通过SAX或RP色谱分离，从而限制了定义明确的3′-单磷酸盐构建块的直接获取。为解决这一问题，我们探索了一种化学酶法校正策略（方案3，底部）。首先将区域异构?ppNp混合物转化为相应的ppNpp衍生物，然后在37°C和pH 5.5条件下用RNase T2进行反应，通过短暂的2′,3′-环状磷酸中间体实现选择性的酶促环化。22 31P NMR光谱证实了完全转化（见补充信息，图S1）。该路线以定量产率得到3′-单磷酸盐和ppAp（ppAp）和ppGp（ppGp）的铵盐形式。虽然之前已有报道描述了RNase T2对ppGpp的水解作用，21 但尚未报道其对区域异构体ppNpp混合物（特别是ppApp）的选择性处理能力。这一新的酶促反应代表了从区域异构体ppNpp混合物中高效选择性提取所需成分的有效方法，突显了RNase T2在MSN合成中的实际价值。ppAp随后被用于合成可点击的pppApp类似物（见补充信息，第3.5章）。这类MSN衍生物具有多种化学修饰潜力，例如可衍生为拉下探针（pull-down probes），正如Haas等人先前所展示的。23

**荧光MSN传感器**
尽管已有针对MSN的强大分析方法，8, 9, 10, 11, 12，但在温和的水性缓冲条件下操作的简单荧光读出方法仍然非常吸引人。由于MSN的高电荷密度及其与常见核苷和其他磷酸化物质的结构相似性，选择性检测仍然具有挑战性。迄今为止，只有一种小分子荧光传感器——PyDPA传感器24被报道。基于易于获取且在生理条件下稳定工作的互补传感器策略非常受欢迎。我们介绍了一种基于解离的“开启型”荧光探针，其中MSN与Fe(iii)-salen复合物结合会引发脱金属化并释放荧光水杨醛报告分子。25, 26

根据已知方法制备了Fe-Sal复合体（方案25）。这种Fe(iii)-salen支架之前已被用作焦磷酸的解离传感器。我们研究了其对高磷酸化报警素（（p）ppGpp和（p）ppApp及其他核苷的响应。当Fe-Sal与10当量的（p）ppGpp和（p）ppApp在Tris缓冲液（10 mM，pH = 7.4）中孵育时，在320 nm、392 nm和485 nm波长处检测到吸光度降低。使用五磷酸（pppGpp和pppApp）时的吸光度降低更为显著（图1a）。通过添加（p）ppGpp钠盐到Fe-Sal溶液（50 μM）中，观察到荧光强度逐渐增强。具体而言，375 nm处的激发产生510 nm处的荧光峰，其强度随ppGpp添加量的增加而增加。这种解离过程具有时间依赖性，大约40分钟后达到最大增强。ppGpp引起的解离速度更快，最大增强出现在约25分钟时。然而，在所采用的条件下，整体响应时间排除了实时检测的可能性，因此需要采用终点检测方法。下载：下载高分辨率图像（239KB）下载：下载完整大小图像图1。(a) 在Tris缓冲液（10 mM，pH 7.4）中与10等量的pppGpp、pppApp、ppGpp或ppApp孵育40分钟后，(100 μM)的UV/Vis光谱。(b) 在Tris缓冲液（10 mM，pH 7.4）中与ppGpp孵育40分钟后，(50 μM)的荧光滴定（λex = 375 nm）。(c) 在10等量pppGpp或ppGpp存在下，(50 μM)在λem = 510 nm处的时间依赖性荧光增强。(d) 根据连续变化法对化合物与ppGpp进行的Job图。[ + [ppGpp] = 100 μM。λex = 375 nm，λem = 510 nm。荧光强度以任意单位（a.u.）表示。为了确定与ppGpp之间的结合化学计量比，基于510 nm处的发射强度进行了Job图分析（图1d）。结果表明[ + ppGpp]之间的结合比为1:1，并且在整个实验过程中[ + ppGpp] = 100 μM得到了保持。鉴于对MSN的显著反应，接下来我们评估了其对一系列生物学相关磷酸化分子的选择性。为此，将该探针与无机磷酸盐（Pi）、无机焦磷酸盐（PPi）和常见核苷酸（ATP、ADP、AMP、GTP、GDP和GMP）在相同条件下（10 mM Tris缓冲液，pH 7.4，40分钟）孵育。如图2a所示，探针对MSN的荧光响应比其他磷酸化物种更强，而对无机焦磷酸盐（PPi）没有选择性。下载：下载高分辨率图像（553KB）下载：下载完整大小图像图2. 在Tris缓冲液（10 mM，pH 7.4）中加入10等量分析物后40分钟，探针（50 μM）对磷酸盐物种和报警分子的荧光响应，测量波长为510 nm。(a) 无机（焦）磷酸盐、常见核苷酸和MSN。(b) 结构相关的报警分子。λex = 375 nm；n = 3。荧光强度以任意单位（a.u.）表示。进一步使用一组结构相关的细菌报警分子评估了选择性，包括ppGpp、ppGp、ppAp和腺苷5′-四磷酸盐（Ap4）。在这一系列中，与pGp和Ap4相比，观察到了ppGpp、ppGp和ppAp的显著更强荧光响应（图2b）。这一趋势表明，在3′或5′位置存在焦磷酸基团是探针高效激活的关键决定因素。相比之下，缺乏这些位置二磷酸基团的报警分子产生了较弱的响应，凸显了磷酸化状态和磷酸基团位置对于识别的重要性。我们进一步通过DFT计算研究了ppGpp与探针的相互作用。从水配位的复合物[Fe(salen)(H2O)2]开始，检查了ppGpp的配位。ppGpp与Fe(iii)中心的配位伴随着两个水配体的取代，形成了热力学上更受青睐的单ppGpp复合物[Fe(salen)(ppGpp)]5?。优化的高自旋结构（图3）显示了多磷酸链与铁的双齿配位。下载：下载高分辨率图像（360KB）下载：下载完整大小图像图3. 单ppGpp复合物[Fe(salene)(ppGpp)]5?（高自旋构型）的DFT优化结构。所有计算的Fe-Sal-ppGpp物种的相对吉布斯自由能见补充信息（SI）。总体而言，计算出的吉布斯自由能支持Fe-Sal复合物与ppGpp的 ligand交换具有强大的热力学驱动力，这与实验观察到的荧光激活一致。补充信息中提供了计算物种和相对ΔG值的完整概述。为了进一步支持所提出的解体机制，使用水溶性磺酸化的Fe-Sal复合物类似物（Fe-Sal-SO3）进行了1H NMR实验，这有助于在NMR所需的高浓度下进行测量。与ppGpp孵育后，出现了新的共振峰，约在10 ppm处，这与释放的水杨醛配体的醛基相关。这一观察为ppGpp通过竞争性配位到Fe(iii)中心引起复合物解体提供了额外证据（完整光谱和信号分配见补充信息，第6章）。为了评估探针检测酶促生成的ppGpp的适用性，我们使用S. aureus RelP合成酶进行了体外酶学测定（方案4）。反应混合物含有ATP（2 mM）、GDP（2 mM）和RelP（10 μM）在Tris-HCl缓冲液（20 mM，pH 8.0）中，以及MgCl2（15 mM）、KCl（15 mM）和β-巯基乙醇（1.5 mM）。使用1:1的ATP:GDP比例来减少过量ATP的干扰，因为探针的选择性有限。反应在37 °C下孵育1小时，HPLC分析确认ATP和GDP底物完全消耗，表明ppGpp的合成成功且具有选择性（图4a）。随后通过热变性使反应淬灭，并将反应混合物的分量加入到探针溶液（50 μM在Tris缓冲液，pH 7.4）中，得到相对于探针浓度分别为3.5、5.0、6.7和13.3的ppGpp当量。孵育45分钟后，荧光发射光谱显示出发射强度的显著增加，这与基于Fe的探针的解体一致（图4b）。这种荧光增强归因于酶促生成的ppGpp与铁中心的配位，导致配体的取代和荧光醛的释放。这种探针在ppGpp合成酶的抑制剂筛选中具有潜在应用，前提是保持这里描述的核苷酸比例（1:1 ATP:GDP）以最小化ATP/GDP的干扰，并且没有焦磷酸盐。值得注意的是，RSH酶包含单功能和双功能成员，其中RelA和小型报警酶合成酶缺乏水解活性，而双功能酶如SpoT可以生成PPi；在这种情况下，可能需要控制PPi的水平，例如通过酶促去除（例如，焦磷酸酶）。因此，探针的适用性仅限于此处描述的定义明确的体外系统。下载：下载高分辨率图像（487KB）下载：下载完整大小图像图4。(a) RelP的酶促反应的HPLC色谱图。(b) 在加入RelP反应混合物（E）后的探针（50 μM）的荧光发射光谱，相当于相对于探针浓度的3.5–13.3当量的ppGpp。作为对照，显示了没有RelP的对照反应（C）。条件：λex = 375 nm，Tris缓冲液（10 mM，pH 7.4）。荧光强度以任意单位（a.u.）表示。结论总之，开发了一种结合化学和分析策略来研究细菌报警核苷酸。可扩展的化学-酶法合成通过cPyPa介导的磷酸化、乙二胺诱导的环 opening、磷酸切除以及随后的RNase T2催化的水解，能够在克级别高效地获得天然MSN pppApp和pppGpp。此外，RNase T2对2′/3′-异构体ppNpp中间体的化学-酶法异构化允许生产定义明确的ppNp构建块。通过访问多样化的MSN和其他磷酸化代谢物，开发了一种基于Fe-salen解体的荧光探针，用于检测(p)ppGpp和(p)ppApp。MSN与Fe(iii)-salen复合物的配位导致脱金属化和通过释放水杨醛实现荧光淬灭。不同的方法（Job图、NMR、DFT）支持1:1化学计量比下的配体交换和解体作为传感机制。该探针对(p)ppGpp和(p)ppApp的选择性适中（相对于GDP和ADP大约两倍，对于GTP和ATP大约三倍），表明单独存在二磷酸或三磷酸酯单元在40分钟的研究时间范围内不足以实现完全激活。值得注意的是，5′-三磷酸化的报警分子（pppGpp & pppApp）引起的响应比其二磷酸对应物（ppGpp & ppApp）更强且更快。该系统还能在优化条件下检测来自S. aureus RelP的酶促形成的ppGpp。总之，合成和传感策略为访问、修改和功能分析MSN提供了一套有用的工具。这为化学生物学应用创造了新的机会，例如筛选MSN合成酶的抑制剂。作者贡献P. M.与M. H.一起合成了核苷酸，M. H.、P. M.和S. K. R.共同撰写了手稿的初稿。S. K. R.合成了传感器，评估了其光物理性质，并与F. W.一起进行了RelP检测，F. B.进行了DFT计算。B. B.监督了理论研究。H. J. J.构思了该项目并对手稿的初稿提供了反馈。所有作者共同完成了手稿的最终定稿。利益冲突没有需要声明的利益冲突。数据可用性数据可在补充信息（SI）中找到。补充信息包括实验程序、光谱数据（NMR、HPLC、HRMS）、光物理测量和DFT研究。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d6ob00328a。