通过机器学习引导的组合诱变技术提高Anabaena sp. CH1 N-乙酰葡糖胺异构酶的活性

《Process Biochemistry》：Improving the activity of Anabaena sp. CH1 N-acetylglucosamine isomerase via machine learning guided combinatorial mutagenesis

　　

文青石|张捷|张冰云|张迪|刘东|英汉洁|郑成

南京工程学院生物技术与制药工程学院，中国南京浦珠南路30号，211816

摘要

由于N-乙酰神经胺酸（唾液酸，SA）的生产过程具有相对较高的效率以及环境友好、反应条件温和等优点，因此受到了广泛关注。然而，目前用于N-乙酰神经胺酸生产的工业双酶催化系统存在反应时间较长且需要较高底物浓度才能驱动反应的问题，这增加了整体成本。为了解决这些问题，本研究采用理性设计方法并结合机器学习技术，对Anabaena sp. CH1中的N-乙酰葡糖胺异构酶（anAGE）进行了改造，以提高其催化活性。对anAGE的171、172和198这三个关键位点进行了组合突变处理，并构建了一个包含317个变体的三位点组合饱和突变库。为了减轻库的筛选负担并进一步提高蛋白质工程的效果，开发了多种机器学习预测工具。最终选用了OPF_10bit-RandomForestMSE预测器（皮尔逊相关系数为0.702）来筛选组合突变体。最佳突变体A172G/A198D的活性提高了1.98倍，优于库中的其他所有组合突变体。本研究成功展示了利用机器学习指导组合突变的潜力，说明了该方法在简化筛选工作方面的优势。此外，该方法特别适合于从表现出强负上位性的突变库中筛选出有希望的突变体，而这正是传统蛋白质工程方法所面临的挑战。

引言

N-乙酰神经胺酸是一种带负电荷的单糖，具有广泛的应用前景[1]。它能够抑制细胞黏附[2]，具有抗病毒特性[3]，可以修饰药物载体[4]，促进大脑和骨骼发育，并增强神经功能[5]。酶催化的N-乙酰神经胺酸（NeuAc）生产过程是一种绿色、简单的工艺，产量高，具有显著的工业应用潜力[6]、[7]。目前的工业催化系统通常使用N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）在N-乙酰葡糖胺异构酶的作用下生成中间体N-乙酰甘露胺（ManNAc），随后N-乙酰甘露胺与丙酮酸进行醛糖缩合反应，在N-乙酰神经胺酸裂解酶的催化下游生成最终产品。然而，该系统存在反应时间较长和底物使用量过多的问题[8]。主要原因是N-乙酰葡糖胺异构酶更倾向于使用ManNAc作为底物，导致逆反应速率较高[9]，因此需要更多的GlcNAc来使平衡向NeuAc方向移动，从而延长了反应时间。此外，随着反应时间的延长，酶的稳定性也会下降，进一步降低了反应速率。因此，需要对AGE进行工程改造以提高其催化能力。

已经详细研究了Anabaena sp. CH1中的anAGE酶的结构和催化机制。Lee等人指出，该酶具有(α/α)6桶状折叠结构，形成了二聚体。研究发现，活性口袋周围的R57、H239、E308和H372氨基酸残基显著影响酶的催化活性，而E242和R375对催化过程至关重要。酶的催化功能由H239和H372介导，它们作为酸碱催化剂，不断提供氢离子并影响质子化与去质子化过程[9]。此外，激活剂ATP通过含有赖氨酸、精氨酸和甘氨酸残基的灵活环区域与anAGE结合，其中K160和K151在ATP结合中起关键作用[11]。虽然该酶的催化机制已得到充分理解，但成功的工程化研究仍较少[10]。一个可能的原因是anAGE的差向异构化效率受多个残基的影响，而负上位性效应增加了组合突变的筛选难度[9]。

随着突变位点数量的增加，可能的位点组合数量呈指数级增长，当组合位点超过三个时，传统方法很难获得理想的结果。幸运的是，蛋白质数据的可用性和计算算法的最新进展使得机器学习成为预测工具，有助于应对酶工程中组合突变的挑战。机器学习越来越多地被应用于蛋白质工程，从纯实验方法转向结合计算模拟和数据驱动策略的混合方法[11]、[12]、[13]、[14]。机器学习已成功应用于蛋白质功能注释、突变效应预测以及有利突变体的设计。例如，Koji Tsuda等人通过机器学习对sortase A中的五个关键残基进行了多轮突变预测，成功筛选出一种活性超过之前报道的最佳突变体两倍以上的细菌变体[15]。

在这项研究中，我们旨在通过基于机器学习的半理性设计策略来提高anAGE的催化活性。首先利用分子对接和PROSS预测方法确定了关键催化残基[16]、[17]，然后进行定向突变以构建一个聚焦的组合库。这个库作为各种机器学习模型的训练数据集，用于预测三位点序列空间内所有可能变体的适应性。通过结合计算模拟和数据驱动的建模方法，本研究旨在提供一种更有效的框架，以应对酶工程中常见的复杂突变景观和负上位性问题，从而促进N-乙酰神经胺酸的工业化生产。

节选

质粒构建与突变

本研究涉及的菌株和质粒详见表S1。N-乙酰葡糖胺异构酶的基因序列是从Anabaena sp. CH1的基因组中扩增获得的。N-乙酰神经胺酸醛糖酶的基因序列是从Corynebacterium glutamicum ATCC13032（cgNal）的基因组中扩增的。选择pET28a载体进行体外克隆。所有克隆的基因分别转入Escherichia coli Rosetta（DE3）中进行蛋白质表达。

定向突变过程

通过定向突变和电荷扫描改造anAGE

已经解析了anAGE的晶体结构，并对催化中心内的某些位点（R57A、H239A、H372A、E218A等）进行了丙氨酸替换突变，但均未观察到活性提升[9]。因此，在本研究中，我们采用半理性设计方法来识别额外的工程位点以改善催化活性。如图1所示，底物被对接到活性位点中，其选择标准是基于……

讨论

为了提高酶的催化效率，我们通过分子对接确定了171和172位点，并找到了几个能增强催化活性的有益突变体。此外，我们还利用PROSS方法修改了酶的表面氨基酸残基以提高稳定性，得到了A198D突变体，其活性比野生型高1.32倍。结构分析显示，位于酶表面的198位点距离活性中心较远，……

结论

在本研究中，我们通过机器学习方法提高了Anabaena sp. N-乙酰葡糖胺异构酶的催化活性。利用在组合突变数据集上训练的各种机器学习模型，预测了三个残基位置的组合突变结果，预测误差约为8%。预测得到的最佳突变体A172G/A198D的活性比野生型高出1.98倍

CRediT作者贡献声明

张迪：方法学研究。张冰云：方法学研究。英汉洁：项目监督、概念构思。刘东：撰写-审稿与编辑、项目管理、经费申请。文青石：方法学研究、数据管理。张捷：数据分析。郑成：初稿撰写、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号：2022YFC2105400）、江苏省自然科学基金（项目编号：BK 20202002）和江苏省杰出博士后计划的资助。

作者声明不存在利益冲突。