基于机理分析和DOE（设计实验）方法的HNMR-HPLC联用技术，用于研究高甲基化明胶B型（Gelatin Type B）中的取代模式

《Results in Engineering》：Mechanistic and DOE-Guided HNMR-HPLC Profiling of Substitution Patterns in Highly Methacrylated Gelatin Type B

　　拉米亚尔·侯赛因扎德（Ramyar Hosseinzadeh）、莫赫森·哈梅迪（Mohsen Hamedi）、萨马尔·巴巴恩扎德（Samal Babanzadeh）
伊朗德黑兰，卡加尔街1450号（Kargar St. N.），机械工程学院

**摘要**
生物可吸收支架正成为再生医学领域有前景的替代方案。明胶是许多人体组织的关键结构成分，其甲基丙烯酸化衍生物——明胶甲基丙烯酰（GelMA）具有可调的机械和生化特性，适用于组织工程。准确的表征和优化的功能化处理对其临床应用至关重要。本研究提出了一种基于线性代数的新方法，通过1H-NMR化学位移区域预测明胶的氨基酸组成，反之亦然。该模型通过实验验证，使用了牛源明胶B型的高效液相色谱（HPLC）和1H-NMR分析。通过改进的六步甲基丙烯酸酐（MAA）添加工艺，在CB缓冲液中合成了高甲基丙烯酸化的明胶，将MAA与游离胺（MAA/FAs）的摩尔比从1.86降低到1.2，取代度（DS）约为0.3 mmol/g。这种改性提高了甲基丙烯酸化效率，并实现了较高的DS水平。在1H-NMR谱中引入了新的内标，包括甲基和乙烯基质子信号，以增强DS测定的准确性。通过完全因子实验设计（DOE）和不同的MAA/FAs比例评估，确定S5区域（3.4-3.7 ppm）和甲基丙烯酸酯甲基信号是高甲基丙烯酸化GelMA最可靠的DS指标。二次回归分析显示，在较高DS值时甲基丙烯酸化效率下降。机理分析表明，在低DS时胺取代占主导地位，而在高DS时羟基取代变得更加显著。这些进展共同提升了GelMA支架的表征和功能化水平，为再生医学中开发机械性能优化的生物可吸收材料提供了支持。

**1. 引言**
组织工程领域的研究人员预计，支架将为传统再生医学方法提供有前景的替代方案，可能降低风险[[1], [2], [3]]。在这方面，模仿组织结构和天然组织成分的构建材料将在实现这一目标中发挥关键作用，主要是因为它们的生物相容性[[2,4,5]]。其中，胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的重要组成部分[[6], [7], [8]]。它负责组织的结构完整性和抗拉强度，由三条相互交织的基于明胶的生物大分子链组成，形成特征性的三螺旋结构[[7],[9],[10],[11]]。明胶生物大分子通过酸或碱水解获得，分别生成A型和B型明胶，由蛋白质生成氨基酸（主要是甘氨酸（Gly）和脯氨酸（Pro））以及一些非蛋白质生成氨基酸（主要是羟脯氨酸（Hyp）序列[[12],[13],[14]]组成。

明胶作为人体结构的基本材料，由于其生化组成和结构作用，被认为是构建各种身体组织支架的有希望的候选材料[[4],[14],[15],[16]]。尽管冷却明胶水溶液可以通过氢键和范德华相互作用形成凝胶状结构，但这些结合区域在约30°C时会发生熔化，导致凝胶失去结构完整性。因此，需要在明胶网络内进行化学交联[[12,18,19]]。一种提出的方法是修改生物聚合物侧链上的功能基团[[10,20]]。对于明胶，由于其低细胞毒性和与光聚合过程的兼容性，研究人员对其游离胺基团的甲基丙烯酸化进行了广泛研究[[21],[22],[23],[24],[25]]。通过优化反应参数（包括温度、时间、浓度、缓冲液类型和pH值[[21],[22],[23],[24],[26]]，明胶的甲基丙烯酸化过程得到了逐步改进[[27],[28],[29],[30],[31]]。例如，在一项关于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中牛明胶B型甲基丙烯酸化和丙烯酸化的比较研究中，使用HR-MAS NMR评估了功能化程度。该方法使用缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）和异亮氨酸（Ile）在1.15 ppm处的甲基质子峰作为内标来计算DS[[26]]。这一过程中的一个重要里程碑是用碳酸氢盐-碳酸盐（CB）缓冲液（碱性pH）替代PBS缓冲液[[30],[32],[33],[34]][[23,24]]。这种改性显著提高了水环境中明胶的甲基丙烯酸化效率。该方法的基础在于保持反应溶液的pH值高于明胶的等电点（IEP），并保持潜在功能基团（特别是游离胺基团，如赖氨酸（Lys）、羟赖氨酸（Hyl）和明胶末端胺基团）的中性，以便它们能有效参与取代反应[[11,23,24,35]]。尽管最初的研究集中在A型明胶上，但对B型明胶的后续分析显示，使用3-三甲硅丙基丙酸钠（TMSP）作为内标（δ1H = 0 ppm）通过1H-NMR测得的DS超过了可用游离胺基团的100%[[29]]。为澄清这一观察结果，分别使用了氟醛[[36]]或2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）[[29]]和Fe(III)-羟胺酸测定法[[29,36]]来区分甲基丙烯酰和甲基丙烯酸酯取代。在另一项研究中，他们使用 ninhydrin 测定法量化了GelMA的DS[[37]]。尽管这种方法准确，但耗时且需要专门的测定方法，可能限制其实际应用。从这个角度来看，理想的方法应能够仅基于NMR谱直接量化DS并区分明胶甲基丙烯酰（GelMA）中的甲基丙烯酰和甲基丙烯酸酯基团。最早尝试在pH 7的典型甲基丙烯酸化条件下量化A型明胶DS的研究基于高分辨率1H-NMR谱，并事先使用离子色谱法确定氨基酸组成[[38]]。在另一项研究中，提出使用DMSO作为单相系统中的溶剂，首先使用气相色谱-质谱（GC-MS）确定A型明胶的赖氨酸含量[[39]]。随后，使用1H-NMR光谱进行甲基丙烯酰和甲基丙烯酸酯基团的定量分析，以羟乙基甲基丙烯酸酯（HEMA）作为内标[[19]]。大多数关于GelMA的研究使用猪源明胶，主要是因为其分子量分布更优，因此比牛源明胶具有更高的Bloom强度[[11,13]]。然而，在特定宗教背景下，使用猪源明胶构建组织支架可能会遇到限制。因此，在本研究的第一个阶段，努力使用HPLC和1H-NMR获得的数据来量化牛源明胶，并建立两种方法之间的相关性。在后续阶段，研究不仅旨在评估明胶甲基丙烯酸化过程的可控性和重复性以及提取定量关系的可行性，还旨在提高光聚合后牛B型明胶的机械强度。DS的增加提高了潜在交联位点的数量，从而改善了支架的整体结构完整性。

**2. 材料与方法**
2.1. 材料
使用的材料包括无菌B型明胶（G9391，Sigma-Aldrich），源自牛皮，凝胶强度约为225 g Bloom；98%甲基丙烯酸酐（276685，Sigma-Alderich）；分子量截留值为12400 Da的纤维素透析管（D0530，Sigma-Alderich）；二氧化氘（D2O，151882，Sigma-Alderich）；氢氧化钠（NaOH）和盐酸（HCl）。新一代高截留（HR）透析膜在溶液纯化方面优于高通量（HF）膜，对中等大小分子的渗透性更强[[40]]。无缝纤维素管的设计可保留超过99.99%的分子，这些分子的分子量超过指定的分子量截止值（MWCO），确保目标分子的精确分离和浓缩，从而在实验和研究应用中提供更可靠的结果。

2.2. 高效液相色谱（HPLC）
总氨基酸的测定遵循ISO 13903:2005标准，并进行了轻微修改。为了测定含硫氨基酸（半胱氨酸和甲硫氨酸）的含量，一些样品在水解前先进行氧化处理。氧化和未氧化的样品随后根据ISO标准在氮气氛围下使用6 M盐酸在110°C下水解24小时。水解后，样品被中和、过滤并衍生化，然后进行注射。色谱分析使用配备荧光检测器的HPLC系统（Agilent 1100 Series，美国）进行，激发波长设置为450 nm，发射波长设置为348 nm。样品在C18反相柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm粒径）上分离，温度保持在25°C。注射体积为20 μL，流速为1.0 mL/min。洗脱使用由0.1 M醋酸钠缓冲液（pH 7.2）和甲醇组成的梯度流动相进行。数据采集和分析使用Agilent ChemStation软件完成。

2.3. 核磁共振（NMR）光谱
明胶粉末和冻干的GelMA样品在40°C的真空烘箱中处理8小时以去除残留水分，从而减少光谱中水信号的干扰[[41]]。对于使用1H-NMR光谱的定量分析，将20 mg样品溶解在1 mL二氧化氘（D?O）中。质子NMR光谱在室温下使用Varian INOVA 500 MHz光谱仪记录，进行128次扫描以提高分辨率（附加的采集参数见图4和图5）。为了评估反应的重复性和一致性，使用了来自四个不同来源的牛明胶B型。数据使用MestReNova软件进行分析。分析前，化学位移刻度参考了残留的D?O峰（7.49 ppm）。然后应用敏感的非线性迭代峰（SNIP）裁剪方法进行相位校正和基线调整[[42,43]]。为了提高信噪比（SNR）和光谱分辨率[[44]]，采用了指数（0.75 Hz）和高斯（0.5 Hz）衰减函数的组合。为了便于不同光谱之间的比较，所有NMR光谱均基于7.23 ppm处的芳香质子峰进行归一化。

2.4. 合成工艺
为了补偿牛源明胶较低的机械强度，本研究旨在实现更高的甲基丙烯酸化程度，从而在光聚合过程中增加潜在交联位点的数量，产生更硬的水凝胶支架。明胶的甲基丙烯酸化基于[24]提出的方法进行，该方法最初是为A型明胶设计的。然而，在本研究中，合成方法针对B型明胶进行了适当修改。尽管B型明胶的等电点（IEP，约pH 4.7–5.4[[45]]低于A型，但参与甲基丙烯酸化反应的游离胺基团在中性pH下仍基本保持中性。使用CB缓冲液的目的是探索提高pH值是否可以增强其他功能基团（特别是羟基基团）的活性，从而可能提高甲基丙烯酸化程度。合成在四个不同规模（2、10、25和50 g明胶）下进行，具体步骤如下：
简要来说，在0.25 M CB缓冲液（7.95 g Na2CO3和14.7 g NaHCO3，1 L去离子水）中制备10% w/v的明胶溶液，温度为50°C。使用5 M NaOH调节pH值后，分六次等量添加甲基丙烯酸酐（MAA），每次间隔30分钟，与一步法不同[[24]]。使用pH计（FiveGo F2，METTLER TOLEDO Co.）连续监测pH值和温度。当pH值降至8.5以下时，通过添加5 M NaOH调整pH值，因为较低的pH值会显著降低甲基丙烯酸化效率，特别是影响明胶结构的羟基功能基团。为了终止反应，加入5 M HCl以达到中性pH（约7），然后冷却至室温（图1a）。溶液温度也应严格控制，防止其低于47°C（图1b）。在反应过程中，以500 rpm的高速搅拌是必要的，但应避免湍流搅拌。建议在惰性气体保护下并在黑暗条件下进行整个反应，使用琥珀色或铝箔包裹的容器。

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**图1.**
a) 添加MAA、NaOH 5 M和HCl 5 M后，溶液pH值随反应时间的变化；
b) 甲基丙烯酸化反应过程中的溶液温度控制（明胶10% w/v，CB缓冲液，MAA/FAs = 2.4 mol/mol，规模大小 = 50 g）。

在本研究中，使用了一个无量纲参数（RMAA/amine）代替MAA的原始体积，以便将MAA与DS之间的关系推广到其他明胶样品。因此，所需的MAA量是根据目标取代度（DS）使用方程（2-1）计算得出的：(2-1) MAA = m·RMAA/amine·F·(MρP)MAA，其中MAA是添加的甲基丙烯酸酐的总体积（mL），m是明胶的重量（g），RMAA/amine是MAA与总游离胺基团的摩尔比（mol/mol），该比率后来用于回归模型的开发。F表示总游离胺含量（mol/g明胶），对于G9391来说大约为0.31±0.02 mmol/g。MMAA、ρMAA和PMAA分别表示甲基丙烯酸酐的分子量（154.165 g/mol）、密度（1.035 g/mL）和纯度。作为实验设计的一部分，使用了六个不同的RMAA/amine水平：1、1.2、2、2.4、4和8。例如，为了达到较高的甲基丙烯酸化程度，相对于总游离胺基团添加了8当量的MAA，相当于每克明胶大约2.5 mmol的MAA。反应后，溶液在3000 rpm下离心约10分钟。然后将上清液用去离子水稀释至原来的两倍体积，并转移到具有12.4 kDa MWCO的透析管中。通过透析去除杂质如甲基丙烯酸、盐和未反应的MAA，持续约3天。在DS较高的情况下，透析时间延长至5天或更长时间，以确保完全去除未反应的MAA和甲基丙烯酸。最后，溶液进行冻干48小时。对于小批量样品，使用Alpha 1-2 LSC基本冷冻干燥机（Christ Co.）在-60°C下进行冻干；对于大规模样品，使用Delta 2-24 LSC plus装置（Christ Co.），操作温度为-80°C，压力为0.0025 mbar。

2.5. 明胶中氨基酸的评估
用于根据HPLC获得的明胶氨基酸谱推导1HNMR光谱的线性方程的流程图，随后用于DS计算，以及通过实验1H-NMR和HPLC结果对提取的线性代数模型进行交叉验证的图形方法分别在图2a和b中展示。

众所周知，对于单一且结构简单的化合物，每个1H-NMR峰的积分与质子数成正比。然而，在存在两种或更多化合物或多个具有重叠信号的官能团的情况下，每个区域的积分计算公式为：(2-2) I = Σi=1^n HiCi，其中Hi表示第i个官能团在溶液中的质子数，Ci是该官能团的浓度，n是指具有重叠信号的官能团的数量。因此，同样的公式也可以用来确定明胶和GelMA等复杂结构中1H-NMR光谱中每个化学位移的积分。然而，建立每个方程的主要挑战在于识别NMR光谱中每个氨基酸质子的位置，因为给定质子的化学位移可能会受到邻近氨基酸的影响，从而导致信号重叠或移动。分析来自复杂结构的拥挤NMR光谱的一种简单方法是将它分解成更小的组成部分。例如，明胶可以分解为其21种组成氨基酸。

为了计算光谱区域的积分，第一步是确定每种氨基酸的哪些质子对该特定区域有贡献。这是通过模拟程序实现的：1）单独分析每种氨基酸；2）以肽的形式分析（见图S1-S21）；3）作为与其他氨基酸形成的肽键的一部分分析（见图S22-S34，补充信息），因为不同氨基酸之间的质子相互作用可能会导致一些化学位移变化，这主要影响靠近明胶主链的α-和β-质子。这些模拟使用ChemDraw和MestReNova软件进行，以预测由质子-质子相互作用引起的化学位移变化。使用这些软件对各种氨基酸的1H核进行了一维核磁共振（1D-NMR）预测，参数设置为频率499.23 Hz、线宽5.00 Hz和光谱范围0-12.00 ppm，溶剂为D2O。这些设置与Varian INOVA 500 MHz光谱仪的实验参数一致。模拟结果包括明胶结构中21种氨基酸的质子化学位移范围（ppm）和Hi系数（N_Int），总结在表S1中。

相反，为了建立HPLC和1H-NMR数据与模拟结果之间的相关性（见图2b），第一步是将明胶（图4）和GelMA（图5）的1H-NMR光谱分别划分为21个和27个不同的区域。每个区域的上下限是根据明胶1H-NMR光谱定义的（n=7，中位数标准偏差（STD）为0.015 ppm），不同批次的牛明胶B型的1H-NMR光谱见图S42-49，补充信息。使用具有不同MAA/FAs比例和放大重复次的GelMA光谱确定了GelMA特有的六个额外区域（见图S52-69，补充信息）。这些区域用于将21种氨基酸的质子化学位移分类为27个范围类别。这些类别也在表S1（补充信息）中用不同的颜色表示。这个模拟和映射过程对所有氨基酸重复进行。总共进行了63次模拟，最终使用方程（2-2）制定了21个描述明胶1H-NMR光谱的线性方程（总结在表S2，补充信息）。因此，方程（2-2）可以用矩阵形式表示如下：(2-3) [I1I2...In?1In]n×1 = [H1, H1,2...H1,m?1H1,m H2,1H2,2...H2,m?1H2,m.....................Hn?1,1Hn?1,2...Hn?1,m?1Hn,m Hn,1Hn,2...Hn,m?1Hn,m]n×m [Ala Arg...Tyr Val]m×1，其中[Ii]表示区域1H-NMR积分，[Hij]是从模拟中获得的质子数（表S1，补充信息），[Cj]代表不同化合物的浓度，即通过HPLC获得的氨基酸浓度，包括Ala、Arg、Asp等。下标n和m分别表示可检测的NMR信号数量和氨基酸数量。

实际上，建议使用内部参考物（如TMSP（δ1H = 0 ppm）[29,38]或其他在甲基丙烯酸化过程中保持不变的信号[26,38]来标准化1H-NMR光谱。在这项研究中，选择了Val、Leu和Ile（称为支链氨基酸，BCAAs）的化学位移进行标准化，因为它们的甲基（–CH?）基团在甲基丙烯酸化过程中化学稳定性较高。该区域的积分被标准化为30，作为这些残基中六个质子的倍数。因此，每个区域的标准化积分可以用方程（2-3）表示如下：(2-4) Ij = Σi=1^n HiCi×N，其中Hi是第i种氨基酸在生物分子中的质子数，N是标准化因子，m是用于标准化的NMR光谱的第j个区域。

最后，通过将HPLC获得的氨基酸组成（即Ci）输入方程（2-4），模型的预测（即Hi）与实验NMR数据（即Ij）进行验证，反之亦然。要从Ij计算Ci，需要求逆矩阵[Hij]，表示为[Hij]-1。因此，矩阵必须是方阵，这意味着方程的数量必须等于未知数的数量，在这里指的是浓度。其次，如果行列式等于零，则需要使用线性代数技术（如Moore-Penrose伪逆）来计算[Hij]-1，然后计算Ci。通过结合HPLC和1H-NMR实验结果（图2），可以对质子系数矩阵（[Hij]）进行误差分析，并验证模型的可靠性。牛明胶B型的交叉验证结果见表S2。

2.6. 在CB缓冲液中明胶甲基丙烯酸化的评估
明胶甲基丙烯酸化被归类为亲核取代反应[47,48]。在明胶结构中，Lys侧链（包括ε-胺（PKa = 10.5）即使在生理pH值下[30,[32],[33],[34]）也很可能是首先参与这种反应的官能团。由于它是一个强亲核试剂，其电子对也比其他官能团更易获得。如图3a所示，亲核试剂接近MAA分子时，会攻击MAA中的羰基，导致阴离子质子化，并通过形成新的C-C σ键形成一个短暂的不稳定中间体，同时破坏C=O π键。中间体分解后，一个甲基丙烯酰基团被添加到明胶结构中，同时有甲基丙烯酸离开结构[47,48]。

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图3. a) 明胶主链上Lys侧链的亲核取代反应机制示意图，强调了这些反应中可能形成的不稳定四面体中间体和作为离去基团的甲基丙烯酸。反应路径改编自[47,48]；b) 立体障碍对甲基丙烯酸化效率影响的示意图。Arg胍基团在水环境中立即质子化，很可能不参与甲基丙烯酸化。反应路径改编自[[46],[47],[48]]；c) 肽的甲基丙烯酸化反应示意图，强调了赖氨酸（Lys）、羟基赖氨酸（Hyl）、丝氨酸（Ser）和羟基脯氨酸（Hyp）残基上的潜在取代位点。反应路径改编自[24,29,36,38]。

然而，电子对的存在在反应机制中起着关键作用。如图3b所示，尽管Arg侧链（PKa = 12.5）包含一个ε-胺基团，但它在水环境中迅速质子化，形成胍阳离子。由于共振稳定作用[46],[47],[48]，这种阳离子的甲基丙烯酸化受到立体阻碍。因此，MAA水解为甲基丙烯酸，而不是参与反应，最终可能影响缓冲液的pH值。这与实验观察结果一致（图5），在高度甲基丙烯酸化的明胶的1H-NMR光谱中未观察到预期的化学位移（见图S35，补充信息）。因此，主要挑战是确定明胶中21种氨基酸中哪些侧链参与了甲基丙烯酸化反应，并确定它们的相对反应性顺序（见图3c）。潜在的候选者如下：
在低到中等程度的甲基丙烯酸化中，主要的反应位点是赖氨酸（Lys，pKa ≈ 10.5）和羟基赖氨酸（Hyl，ε-NH? pKa ≈ 10.1）的ε-胺基团。这些基团与甲基丙烯酰胺发生亲核取代，形成明胶甲基丙烯酰基，如图3c所示。反应速率随pH值增加而增加，特别是在pH≥9时，直到其他官能团开始参与[24]。
其次是丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和羟基脯氨酸（Hyp）侧链上的羟基（-OH）基团（pKa ≈ 13–14），它们是最可能的亲核位点。在pH ～9时，这些基团基本上保持中性，是比胺基团较弱的亲核试剂。然而，在长时间反应或高MAA浓度下，这些残基也可能参与反应。它们的反应性也可能受到相对丰度的影响。例如，Hyp是明胶中继甘氨酸（Gly）和脯氨酸（Pro）之后第三常见的氨基酸。酪氨酸（Tyr）具有酚基-OH基团（pKa ≈ 10.5），在pH 9时亲核性较低，但在强反应条件下也可能发生甲基丙烯酸化。这些含羟基的残基在反应过程中形成甲基丙烯酸酯，从而形成明胶甲基丙烯酸酯，如图3c所示。其他氨基酸，包括组氨酸（His，咪唑基团），在这些条件下要么保持不反应，要么由于亲核性较低而表现出极低的反应性。

根据前面的描述，甲基丙烯酸化取代反应的优先顺序是游离胺基团（Lys和Hyl），其次是羟基团（Ser、Thr、Hyp和Tyr）作为次要参与者。之前讨论的模拟技术同样用于确定甲基丙烯酸化反应引起的化学位移变化（见图S35-S41）。模拟结果，包括潜在氨基酸甲基化前后现有和新信号的位置变化及外观，均在表S3.2.7中呈现。为了根据1H-NMR光谱计算取代度（DS），第一步是选择一个合适的内部标准。选择内部标准的一个关键标准是所选峰在明胶改性前后必须保持不变。该峰应具有良好的分辨率，不与相邻峰重叠或相互作用，并且理想情况下对应于有限数量的氨基酸，以最小化计算误差。基于这些考虑和先前的研究结果，评估了四种内部标准（以及TMSP [29]）用于此目的：

1. 第一种内部标准基于Val、Ile和Leu的甲基的化学稳定性[26]，每种甲基贡献六个质子。这些甲基信号始终出现在0.68-1.09 ppm范围内，并且在甲基化前后保持不变。这个区域被标记为M21，在图4和图5中用蓝色突出显示。

2. 第二种是苯丙氨酸（Phe）的芳香质子峰[38]，通常位于7.17–7.47 ppm的化学位移范围内。然而，先前的研究经常忽略了组氨酸（His）和酪氨酸（Tyr）侧链的潜在干扰，因为它们也在芳香区域产生信号。如果基线没有得到适当校正，对应于His和Tyr的峰可能会被误表示或遗漏，从而导致积分不准确，进而导致DS值错误。为了解决这个问题，评估了两个扩展区域作为内部标准：7.17–7.75 ppm（包括Phe的5个质子和His的1个质子）和6.69–7.75 ppm（包括Phe的5个质子、His的2个质子和Tyr的2个质子）。

3. 第三种内部标准覆盖3.45–3.75 ppm的范围，其中出现了脯氨酸（Pro）的两个δ-CH?质子和酪氨酸（Tyr）的一个质子的信号。然而，由于酪氨酸在明胶中的相对含量较低，其贡献可以忽略不计。这使得该区域成为由单一氨基酸主导的理想内部标准。这个区域被标记为M10，在图4和图5中用灰色突出显示。

4. 第四种也是最不理想的内部标准位于δ (1.09–1.29) ppm，对应于苏氨酸（Thr）的甲基质子（γ-CH?）。不幸的是，它与丙氨酸（Ala）的β-CH?信号有轻微的重叠，这在某些情况下可能导致计算错误。这四个内部标准在表1中进行了总结。S1和S2之前已在文献中报道，而其余四个标准（S3–S6）是在本研究中提出的。

表1. 明胶和GeMA 1H-NMR光谱的内部标准。

接下来，根据未改性明胶的NMR光谱是否可用，可以应用不同的公式来计算DS。如果可以获得基础（未改性）明胶的光谱，则可以更准确地评估甲基化后的光谱变化。通过比较改性前后的明胶光谱，可以识别出特定区域中的显著位移，并将其作为精确计算DS的基础。根据图4和图5中显示的明胶和GelMA的1H-NMR光谱，可以观察到几个关键差异。因此，可以基于这些变化、前面提到的内部标准以及方程（2-2）来计算DS并检查结果：

- 在图5中用红色突出显示的是，在GelMA光谱中5.34–6.25 ppm范围内出现的一些新峰。这些峰对应于引入GelMA结构中的甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酰侧链的乙烯基质子（=CH?）。在明胶的自由胺基团发生甲基化时，甲基丙烯酰=CH?质子在1H-NMR光谱中产生两个不同的信号，分别出现在M23和M24区域。由于磁不等价性和双键的邻位耦合，这些峰表现为双峰。此外，在M25–M27区域出现的三个额外信号可以归因于羟基氨基酸上的甲基丙烯酸酯取代。如后文所述，将这些峰分配给特定的氨基酸残基是具有挑战性的，也可能不准确。然而，可以使用方程（2-5）和（2-6）分别计算每个区域Mj（mmol/g）的浓度和总取代度DStotal=CH2（mmol/g）：

(2-5) Mj = (H=CH2)j (IMj) (SiIsi) i=1?6 j=23?27
(2-6) (DStotal=CH2) i=0.5 (∑j=2327 IMj) (SiIsi) i=1?6

其中IMj和Isi分别是1H-NMR光谱中亚甲基（=CH2）和内部标准信号的积分，Si代表内部标准的质子当量浓度。Si（mmol/g）的值可以使用表1第三列提供的线性方程计算。这些方程的一个显著优点是它们不需要访问未改性的明胶及其相应的光谱。

- 在图4和图5中用紫色突出显示的区域（M12）显示与GelMA光谱中的Lys和Hyl侧链相关的峰强度降低。需要注意的是，这部分峰也可能部分归因于明胶中含量较低的半胱氨酸（Cys）和组氨酸（His）。因此，即使在高度甲基化的GelMA中，仍可能观察到M12区域中的小残余峰。此外，M12中对应于赖氨酸（Lys）的ε-CH?的信号并没有消失，而是略微向下移动到相邻的M11区域。明胶和GelMA光谱中M12区域的观察到的位移可以用来估计与Lys和Hyl残基相关的取代度：

(2-7) DSLys + Hyl = 0.5 ΔIM12(M12IM12)gelatin

其中ΔIM12=(IM12)gelatin ? (IM12)GelMA是取代反应前后M12区域的积分差异，M12可以定义为：

(2-8) M12 = 2(Lys + Hyl) + Cys + His

3- 字母符号表示每克明胶中每种氨基酸的含量（mmol/g）；所有在此上下文中报告的化学位移值（δ）的容忍度为±0.05 ppm；Tyr可以忽略。

最后，如果未改性明胶的NMR光谱可用，可以应用不同的公式来计算DS。如果可以获得基础（未改性）明胶的光谱，则可以更准确地评估甲基化后的光谱变化。通过比较改性前后的明胶光谱，可以识别出特定区域中的显著位移，并将其作为精确计算DS的基础。

2.8. 统计分析
采用实验设计（DOE）方法来评估与取代度（DS）相关的实验数据。使用Minitab软件进行了完整的因子设计和多项式回归分析。为了评估统计显著性，在95%的置信水平（P < 0.05）下进行了双侧Student’s t检验。为了无量纲化甲基丙烯酸酐（MAA）的量并得出一个通用模型，MAA含量表示为MAA与明胶中总自由胺含量（包括Lys、Hyl和N端残基）的摩尔比。这个比率称为MAA/FAs，并在六个水平（1、1.2、2、2.4、4和8 mol/mol）下进行了评估。每个实验条件重复三次（n = 3）。此外，新提出的内部标准（表1中的六个水平），以及GelMA上甲基（–CH?）和乙烯基（=CH?）质子的信号也被包括在DOE因素中，以评估本研究中开发的预测方程的稳健性和准确性。

还使用了二次回归模型来描述DS和MAA/FAs含量之间的关系。所有值均以平均值±标准偏差（STD）的形式呈现。

3. 结果与讨论
3.1. 牛明胶B型的氨基酸分布
根据HPLC分析的结果和先前的文献（表2），在B型牛皮明胶中鉴定出了21种不同的氨基酸。结果比较显示，即使来自同一来源的明胶，其氨基酸组成也可能因批次而异。这些变化可能是由于加工方法、处理方式、环境因素和其他变量的不同[[49], [50], [51], [52], [53]]。尽管如此，明胶中的整体氨基酸分布仍然一致，其中Gly、Pro和Hyp最为丰富，而Cys、Tyr和His最少[54]。值得注意的是，明胶中缺乏色氨酸（Trp）。因此，在甲基化之前确定每批明胶的具体氨基酸组成对于精确控制功能化过程至关重要。

表2. 基于HPLC结果和先前报道的文献[[49], [50], [51], [52], [53]]的B型牛皮明胶的氨基酸谱型。

3.2. 基于氨基酸的明胶和GelMA 1H NMR光谱预测模型
使用第2-5节描述的方法，通过预测每种氨基酸质子的化学位移来对B型牛明胶1H NMR光谱中的21个可区分的化学位移区域进行了建模。这些线性方程式列在表3中，通过使用HPLC获得的氨基酸组成（两个实验数据集）来预测21个NMR区域的积分值。然后，将这些预测的积分值与明胶样品的实验1H NMR数据（n=7）进行验证。这些模型稍后将用于估计GelMA中的取代度（DS）。这些模型的另一个预期用途是从其1H NMR谱中反计算明胶的氨基酸谱型。然而，有几个限制因素限制了这一应用。

表3. 基于明胶的氨基酸谱型开发的21个可区分化学位移区域的提取模型，并使用实验1H NMR数据的积分进行验证。

#CHNHOH SH 范围（ppm）模型 积分值 NMR 结果 错误百分比
Down Up
Test1 Test2 ISTDT1 T2
1 α-NH 几乎全部 7.90 8.80 1.65 0.57
2 His(1) Arg(1) Tyr 7.46 7.75 0.41 0.39 0.41 0.13 0.85 0.23
3 Phe(5) Asn(2) 7.16 7.46 5.55 5.93 5.83 0.25 4.81 1.7
4 His(1), Phe(5)* Arg(1), Asn(2) Tyr 7.16 7.75 5.96 6.32 6.24 0.38 4.4 1.3
5 His(1), Tyr(2) Arg(1) 6.95 7.16 0.80 0.94 0.48 0.27 4.4 9.1
6 His(2), Phe(5), Tyr(2) Arg(2), Asn(2) Tyr 6.95 7.75 6.76 7.26 6.64 0.57 1.8
7 Tyr(2) GLn(2) 6.60 6.95 0.39 0.55 0.60 0.25 34.4 7.36

α-CH (Asn, Asp, Hyp, His, Phe, Tyr), Hyp(1) Thr, Ser 4.51 4.68 21.19 22.55 25.05 1.39 15.41 0.07
α-CH (Cys, Thr, Leu, Lys, Hyl, Ala, Arg, Met, Ser) Hyp 4.24 4.51 33.73 33.91 32.14 0.44 4.75.28
α-CH (Glu, Gln, Ile, Val), Hyp(0.4) 4.10 4.23 10.58 11.19 10.18 0.87 3.89.0
α-CH面积（6、7和8的总和） 4.10 4.68 65.51 67.64 67.38 2.70 2.80.49
α-CH (Gly+H), Hyp(1.6), Thr(1), Hyl(1), Ser(2) 3.73 4.10 77.29 78.77 65.66 3.64 15.01 6.610
Pro(2), Tyr(1) 3.41 3.73 21.17 21.37 19.44 0.97 8.29.0
11 His(1), Phe(1), Tyr(1), Arg(1.8) Hyl 3.08 3.33 9.38 9.83 9.00 0.60 4.08.4
12 Arg(0.2), Cys(2), Hyl(2), His(1), Lys(2) Lys(2) 2.87 3.08 7.46 6.96 6.56 0.54 12.0 5.7
13 Asn, Asp(1.5), Met(2), Phe(1) Hyl(2) 2.54 2.87 7.02 7.24 6.95 0.64 0.93.9
14 Asn, Asp(0.5), Gln(2), Pro(1), Hyp(1) His(1) 2.20 2.54 27.46 29.03 28.43 3.18 3.4
15 Hyp(1), Glu, Gln(2), Met(4), Pro(1), Val(1) Cys 1.98 2.20 33.05 34.21 36.11 3.26 8.55.3
16 Ile(1), Pro(2) 1.83 1.98 22.09 22.18 21.39 1.11 3.13.5
17 Arg(1), Glu(1), Hyl(1), Lys(1), Met(1) 1.74 1.83 8.93 8.92 8.33 0.38 6.76.6

*His(1), Phe(5)*Arg(1), Asn(2)Tyr 和 His(1), Phe(5)*Arg(1), Asn(2)Tyr 的积分值相同，因为它们的氨基酸序列相同。

首先，由于不稳定的质子（NH和OH）引起的化学位移展宽会影响积分值。例如，包含大部分α-NH信号的M1区域的积分值显著低于预测值。在芳香区域（M2-M4）也观察到了类似的差异。因此，在计算中可以合理忽略NH和OH质子的贡献。

其次，低丰度氨基酸产生的信号较弱，如果基线校正不足或NMR分辨率低，这些信号可能会丢失。这在芳香区域（M2-M4）尤为明显，因为Tyr和His的信号较弱。如表3所示，M4区域的预测积分值（6.95-7.16 ppm）高于实验结果，这是误差最大的区域。

第三，重叠的信号给峰的分离带来了挑战。例如，M15到M17区域（见图4）高度纠缠，使得分离变得困难。尽管如此，这些区域的个别和总和积分值仍显示出可接受的误差范围。

因此，在最乐观的情况下，可以使用21个化学位移区域方程中的17个来求解21个未知氨基酸。然而，可以应用一些简化方法。首先，一些氨基酸（如Asp和Asn或Lys和Hyl）具有相似的化学位移，可以将其分组。此外，可以忽略低丰度氨基酸（如Cys、His和Tyr）的信号。因此，未知数的数量减少到16个。因此，可以使用基于线性代数的方法从明胶的1H NMR谱中合理预测其氨基酸组成。

对于GelMA谱，可以根据潜在氨基酸残基在甲基丙烯酰化后的化学位移变化得出几个关键结论，如第32-6节所述，并在表S3（补充信息）中总结。首先，GelMA上甲基丙烯酰基和甲基丙烯酸酯基团的甲基（-CH?）的δ（化学位移）出现在M16区域（1.85-1.99 ppm）[11,24,29,36,38]。相比之下，乙烯基（=CH?）质子的化学位移取决于明胶中被取代的具体氨基酸残基[36,38]。这些信号表现为一系列峰，包括M23（5.55-5.83 ppm）、M24（5.31-5.55 ppm）、M25（6.00-6.23 ppm）和M27（5.83-6.00 ppm），如图5和图6中红色标记的部分，这与模拟结果一致（表S3）。M23和M24的信号通常归因于自由胺基的取代[30,[32],[33],[34]，而M25仅在少数研究中被提及[36,38]。M26和M27的信号较微弱，可能是因为这些信号仅在高度甲基丙烯酰化的情况下出现，这可以通过使用CB缓冲液来实现。图6和图7分别展示了不同MAA/FAs比值（1, 2, 4, 8 mol/mol）下的堆叠1H-NMR谱及其相应积分值。在低到中等取代度（MAA/FAs = 1）下，主要反应位点是Lys和Hyl的胺基。此时，谱中只能识别出两个与甲基丙烯酰基取代相关的乙烯基质子信号（5.68和5.45 ppm）[30,[32],[33],[34]。然而，当自由胺基的取代程度超过约90%（本研究的目标）时，会出现其他官能团的额外信号，使得取代度（DS）分析变得复杂。

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图6. 纯明胶（底部）和甲基丙烯酸化明胶样品的堆叠1H-NMR谱，随着MAA与自由胺的摩尔比（MAA/FAs = 1, 2, 4, 8 mol/mol）的增加。

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图7. 条形图显示了四个甲基丙烯酰化程度（MAA/FAs = 1, 2, 4, 8 mol/mol）下选定化学位移区域的积分值：M4（7.11 ppm）、M5（6.80 ppm）、M26（6.34 ppm）、M25（6.13 ppm）、M27（5.89 ppm）和M24（5.45 ppm）（n = 3）。

具体来说，甲基丙烯酸酯在Hyp、Ser和Thr的羟基上的乙烯基信号出现在6.13 ppm（M25）和5.73 ppm（M23）。后者与甲基丙烯酰基的乙烯基信号重叠，但随着MAA/FAs比值的增加，5.73 ppm处的峰变得更加明显[38]。在MAA/FAs = 8时，两个乙烯基分支可以区分开来，M23和M24之间的积分差异增加（图6）。然而，这种差异仍然小于M25的积分，因为Hyp的γ-CH也贡献于M24。在更高的甲基丙烯酰化水平（MAA/FAs > 2）下，出现了两个额外的信号（6.34和5.89 ppm），这些信号归因于Tyr的酚-OH的取代。这得到了M4和M5积分值（Tyr的δ和ε-芳香CH）下降以及M26和M27信号增加的支持（图6，图7）。因此，M26对应于Tyr-甲基丙烯酸酯，M25对应于Ser-、Thr-和Hyp-甲基丙烯酸酯，M23反映了来自甲基丙烯酰基（Lys, Hyl）和甲基丙烯酸酯（Ser, Thr, Hyp）修饰的乙烯基质子的组合。因此，方程（2-6）可以简化并重写为：
(3-1) (DStotal = CH2)i = IM26(SiIsi) + IM23(SiIsi)i = 1?6
其中IM和Isi分别是1H-NMR谱中亚甲基（=CH2）和内标信号的积分值，Si代表内标的质子当量浓度。

3.3. 取代度模型
方差分析和DS结果呈现在图8中。根据帕累托图（图8a），所有因素都具有统计学意义（P < 0.05）。然而，内标（Si）和MAA/FAs*区域之间的交互作用效应很小（均< 0.4%），可以在回归模型中忽略。标准化残差与Si的散点图（图8b）显示S4的变异性最小，而S6的异常值最多。S6的波动可能是由于Ala（β-CH?）信号与Thr（γ-CH?）在M20区域的化学位移部分重叠所致。如DS的主效应图（图8c）所示，除了S4之外的所有内标都产生了一致的DS值。S4的DS（mmol/g）略高于平均值（P < 0.05），可能是因为它包含了His、Phe和Tyr的芳香质子信号。在甲基丙烯酰化过程中，Tyr的芳香质子（2×δ-CH_芳香）向场移动，可能导致S4的质子当量浓度被高估。

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图8. a) 基于取代度（DS，单位mmol/g）的标准化效应的帕累托图，显著性阈值α < 0.05，b) 标准残差与内标（Si）的图，c) 通过MAA/FAs、内标（Si）和GelMA上甲基（-CH?）和乙烯基（=CH?）质子信号的DS平均值（mmol/g）的图，d) MAA/FAs比率与化学位移区域的交互作用图对DS（mmol/g），e) 基于MAA/FAs比率的DS（mmol/g）的二次回归模型，f) 各种明胶衍生物的总DS（青色条形图）和归因于自由胺的DS（橙色条形图），基于所提出的模型。误差条代表标准偏差（n = 3）。

关于积分区域，从甲基信号（δ = 1.85-1.99 ppm）计算出的DS高于来自甲基丙烯酰基和甲基丙烯酸酯基团的乙烯基质子的DS。交互作用图（图8d）显示，随着MAA/FAs的增加，基于甲基与乙烯基信号的DS值之间的差距缩小，并最终在MAA/FAs = 8 mol/mol时趋于一致。这表明，在中等DS下，羟基的甲基丙烯酰化受到限制，导致1H NMR谱中甲基丙烯酸酯乙烯基信号较弱或无法检测到。因此，从乙烯基质子（=CH?）计算出的DS倾向于低于来自甲基质子（-CH?）的DS，后者同时存在于甲基丙烯酰基和甲基丙烯酸酯结构中，并具有相同的化学位移。基于这两个区域的DS（mmol/g）的二次回归模型比较见表4。

表4. 基于甲基δ = 1.85-1.99 ppm和GelMA上甲基丙烯酰基和甲基丙烯酸酯的乙烯基信号的DS（mmol/g）的二次回归模型比较。

区域 空单元格 = Ch2DS = 0.126 + 0.120 MAA/FAs - 0.006 MAA/FAs*
MAA/FAs - CH3DS = 0.167 + 0.120 MAA/FAs - 0.006 MAA/FAs*
拟合的二次回归模型和DS结果（图8e和图8f）表明，在某个阈值（DS ≈ 0.3 mmol/g）之前，甲基丙烯酰化主要通过自由胺基的取代发生，形成甲基丙烯酰基团。超过这一点后，主要机制转变为含羟基氨基酸（Hyp, Ser, Thr, 和 Tyr）的取代，导致明胶主链上形成甲基丙烯酸酯基团。然而，随着取代的进行，反应效率降低，需要更高的MAA/FAs比率才能实现更高的DS。

如图8e所示，DS随MAA/FAs线性增加，直到大约2.4 mol/mol；超过这一点后，回归曲线的斜率下降，反映了反应活性的降低。例如，要达到约0.71 mmol/g的DS——大约是MAA/FAs = 1 mol/mol时的三倍——需要将MAA增加八倍。这种效率降低的一个可能解释是甲基丙烯酸的积累，既作为GelMA合成的副产品，也通过水溶液中过量MAA的水解产生（图3）。物质的积累可能会影响CB缓冲液的缓冲能力，导致每次添加MAA时pH值突然下降，从而影响反应动力学，如pH控制结果（图1a）所示。在MAA添加的初始阶段，当自由胺取代占主导时，甲基丙烯酰化速率较高（图8e，pH下降较少）。随着MAA/FAs比率的增加，甲基丙烯酰化速率降低（图8e，pH下降更多），导致效率降低。因此，在第四次添加MAA后，应更频繁地添加NaOH 5 M来补偿pH下降，因为pH值低于8.5会妨碍羟基的取代。

此外，结果表明，分六次在3小时反应时间内逐步添加MAA显著提高了甲基丙烯酰化效率。具体来说，要达到约0.3 mmol/g的DS，所需的MAA/FAs比率从1.86 mol/mol（一步法[24]）降低到仅1.2 mol/mol。

4. 结论
在这项研究中，通过HPLC分析确定了牛皮来源的明胶B型的氨基酸组成，包括非蛋白质来源的氨基酸如羟脯氨酸（Hyp）和羟赖氨酸（Hyl）。然后使用这种组成来验证一种新的基于HNMR的预测模型。该模型通过模拟和本研究详细的方法开发，包含16个有效的线性方程，能够预测明胶样品的1H NMR谱或估计明胶大分子中16种丰富氨基酸的含量。使用这些模型，提出了几种内标来计算GelMA样品中的取代度（DS）。该方法被扩展应用于GelMA，以识别由于含有游离胺基（例如Lys、Hyl）或羟基（例如Hyp、Ser、Thr、Tyr）的氨基酸被甲基丙烯酰基或甲基丙烯酸酯基团取代所导致的化学位移变化。基于观察到的化学位移，提出了新的方程式来更准确地计算DS（交联度）。为了评估这些模型的一致性和可靠性，使用六种不同水平的MAA/FAs（甲基丙烯酸酐与游离胺的摩尔比）进行了全因子实验设计，该设计基于实验中的HNMR数据。结果表明，除了S6之外，所有提出的内部标准都提供了可靠的结果。尽管最初从甲基区域计算出的DS（δ = 1.85–1.99 ppm）高于从乙烯基质子区域得出的值，但在DS值较高时这种差异减小，表明高度甲基化的GelMA具有一致性更好的特点。开发了一个二次回归模型来描述DS与MAA/FAs比率之间的关系，发现随着DS水平的提高，甲基化效率下降。为了提高效率并增加DS，从而增强GelMA支架的交联密度和结构完整性，开发了一种改进的合成工艺，在3小时的反应时间内分六步逐步添加MAA。这种方法将达到约0.3 mmol/g DS所需的MAA/FAs比率从传统的一锅法中的1.86降低到了1.2。最后，对于高度甲基化的GelMA（DS > 0.3 mmol/g），主要反应机制转向了羟基的甲基化，导致甲基丙烯酸酯基团的引入。

**缩写说明：**

| 缩写 | 描述 |
| --- | --- |
| ECM | 外部细胞基质（External Cellar Matrix） |
| HR-MAS | 高分辨率魔角旋转（High-Resolution Magic Angle Spinning） |
| TMS | 2,2,3,3-d? (D, 98%) 磷酸钠三甲基硅丙酸酯（Sodium 3-trimethylsilylpropionate） |
| HR | 高保留（High-Retention） |
| ANOVA | 方差分析（Analysis of Variance） |
| HEMA | 羟乙基甲基丙烯酸酯（Hydroxyethyl Methacrylate） |
| BCA | 分支链氨基酸（Branched-Chain Amino Acids） |
| IEP | 等电点（Isoelectric Point） |
| CBC | 碳酸氢盐-碳酸氢盐（Carbonate-bicarbonate） |
| MAA | 甲基丙烯酸酐（Methacrylic Anhydride） |
| DSD | 交联度（Degree of Substitution） |
| MWCO | 分子量截止（Molecular Weight Cut-off） |
| DOE | 实验设计（Design of Experiments） |
| NMR | 核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance） |
| GC-MS | 气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry） |
| PBS | 磷酸盐缓冲盐水（Phosphate Buffered Saline） |
| GelMA | 明胶甲基丙烯酰化物（Gelatin methacryloyl） |
| SNIP | 敏感非线性迭代峰检测（Sensitive Nonlinear Iterative Peak Detection） |
| HF | 高通量（High-Flux） |
| SNR | 信噪比（Signal-to-Noise Ratio） |
| HPLC | 高效液相色谱（High-performance Liquid Chromatography） |
| STD | 标准偏差（Standard Deviation） |

**作者声明：**
作者声明在准备本手稿期间未收到任何资金、资助或其他形式的支持，也没有需要披露的财务或非财务利益关系。所有作者均参与了概念设计和实验过程。Ramyar Hosseinzadeh负责数据收集与分析，并撰写了初稿；所有作者对早期版本提供了反馈；最终稿件由所有作者共同审阅并批准。

**作者贡献声明：**
Ramyar Hosseinzadeh：概念构思、数据分析、软件应用、撰写初稿。
Mohsen Hamedi：实验实施、项目管理、资源协调、监督工作以及审阅和编辑。
Samal Babanzadeh：实验实施、项目管理、资源协调、监督工作以及审阅和编辑。