综述：利用脂蛋白运输通路开发新型抗菌药物

《RSC Chemical Biology》：Leveraging the lipoprotein trafficking pathway for the development of novel antimicrobials

　　

随着抗菌药物耐药性不断加剧，针对铜绿假单胞菌（Acinetobacter baumannii）和大肠杆菌（Escherichia coli）等致命病原体的一线治疗药物正逐渐失效。因此，临床上开始广泛使用通常具有有害脱靶效应的广谱二线和三线治疗方案。据估计，到2050年，抗菌药物耐药性每年将导致超过1000万人死亡，并使美国每年平均损失超过550亿美元。过去几年，由于经济效益低，抗生素研发受到严重限制。这导致药物开发主要集中于制造现有抗生素类别的类似衍生物，而非探索新的作用机制和分子骨架。由于候选抗生素多样性不足，耐药机制能迅速适应并使这些衍生物失效。革兰氏阴性菌因其细胞结构（与革兰氏阳性菌不同，具有额外的外膜）导致药物进入细胞减少，成为最难治疗的细菌之一。革兰氏阴性菌中常见的几种耐药机制包括抗生素靶点突变、酶催化药物修饰以及外排泵活性增强。因此，迫切需要具有独特作用机制的新型抗菌疗法来遏制这场全球公共卫生危机。 发现小分子抗菌药物的挑战已通过多种途径解决，这些途径在命中化合物识别方法上大多不同。主要的命中识别方法包括全细胞筛选、药物再利用筛选以及人工智能或机器学习的应用（参见图1）。使用全细胞测定法是一种流行的识别方法，因为其环境与体内过程非常相似。此过程通常使用活细菌细胞进行，这些细胞接受来自各种小分子库的药物治疗。虽然全细胞筛选仍在广泛进行，但药物再利用技术的应用正在增加。在药物再利用技术中，对先前未报道具有抗菌活性的FDA批准药物库进行筛选，以发现对不同细菌病原体具有强效活性的命中化合物。这种识别方法通过跳过广泛的安全性和药代动力学试验，加速了药物开发过程。与全细胞和药物再利用技术不同，人工智能和机器学习可以利用数据库对先前已识别的细菌病原体抑制剂进行分类，以找出相似性并确保新识别命中化合物的新颖性。此外，它可以通过预测目标内的结合亲和力等属性来帮助确定化合物的作用机制。这些方法都是有价值的过程，可以帮助发现能够规避耐药途径的抗菌药物。 为克服药物渗透性和抗生素靶点多样性缺乏的问题，探索新通路已成为前沿课题。最近，在开发靶向位于周质空间的脂蛋白定位通路（Localization of lipoproteins pathway, Lol）的小分子抑制剂方面已取得多项进展。周质靶点在抗生素药物开发中具有吸引力，因为它消除了穿过内膜的需要。Lol通路由一个五组分蛋白质系统组成，负责将成熟的脂蛋白（酰化蛋白）从内膜转运到外膜。该通路已被证明对细菌细胞活力至关重要，并且可以被用来针对多种革兰氏阴性病原体。不同革兰氏阴性菌种中Lol通路的具体机制正在不断被探索，以指导和推动药物研发工作。 在过去的十年中，已发现了几种Lol通路抑制剂，它们显示出可规避耐药途径的作用机制，同时在大肠杆菌和鲍曼不动杆菌中表现出有效的抗菌活性。在本综述中，我们将概述脂蛋白在革兰氏阴性细菌细胞中的功能，同时概述脂蛋白运输通路的机制。之后，将描述几种已知Lol抑制剂的识别过程及其药物发现历程。Lol通路仍然是抗菌药物开发的一个有吸引力的靶点，该领域的未来研究可能继续为日益增长的抗菌药物耐药性危机提供解决方案。

论文主体内容总结

1. 引言

引言部分阐述了当前全球面临的严峻抗菌药物耐药性问题。以鲍曼不动杆菌和大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌，其一线治疗药物正逐渐失效，迫使临床转向可能具有有害副作用的广谱二、三线药物。鉴于耐药性问题预计将造成巨大的人力和经济损失，开发具有新颖作用机制（Mechanism of Action, MOA）的抗菌药物变得至关重要。论文指出，过去抗生素研发多聚焦于现有药物类别的类似物衍生物，导致药物多样性不足，细菌耐药性发展迅速。革兰氏阴性菌特有的双层膜结构（内膜和外膜）进一步阻碍了药物进入细胞，加之常见的靶点突变、药物修饰酶和外排泵等耐药机制，使得新药研发挑战重重。为应对这些挑战，研究采用了多种命中化合物识别策略，主要包括全细胞筛选、药物再利用筛选以及人工智能/机器学习（Artificial Intelligence/Machine Learning, AI/ML）辅助方法。全细胞筛选能模拟体内环境；药物再利用可利用已获批药物库，加速开发进程；AI/ML则能分析数据库，预测化合物活性与作用机制。所有这些方法旨在发现能够规避现有耐药通路的新型抗菌药物。最后，引言点明了本文的核心：鉴于周质靶点（如脂蛋白运输通路）无需穿透内膜的优势，以及脂蛋白对细菌生存的至关重要性，靶向脂蛋白定位（Lol）通路已成为开发新型抗菌药物，特别是对抗革兰氏阴性菌的一个极具前景的方向。

2. 脂蛋白 – 革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌

本节详细比较了革兰氏阴性与阳性菌中脂蛋白的异同。脂蛋白是一类从胞质分泌后，需经过酰化途径成熟定型的蛋白质，其N端具有特征性的“脂盒”（lipobox）信号序列，其中不变的半胱氨酸残基是酰化修饰的位点。在大肠杆菌等细菌中，Lgt、LspA和Lnt三个酶共同作用，产生成熟的三酰化脂蛋白结构，使其能够锚定在膜上。许多革兰氏阴性菌的脂蛋白对细胞存活至关重要，因此其成熟过程是潜在的治疗靶点，天然产物格洛博霉素（globomycin）就是已知的LspA抑制剂。在变形菌门（如大肠杆菌）中，脂蛋白结构保守，主要为三酰化形式。相比之下，一些革兰氏阳性菌能产生结构更多样化的脂蛋白，这可能有助于其逃避宿主的先天免疫识别，且其脂蛋白成熟通路对细菌生存并非必需。在革兰氏阴性菌中，成熟的脂蛋白可定位于内膜或外膜，其中绝大多数（如大肠杆菌中约110种脂蛋白）最终定位于外膜。外膜脂蛋白对于构建和维持外膜完整性、病原体致病过程等都至关重要。因此，负责将脂蛋白从内膜运输到外膜的Lol通路，不仅其功能本身对细胞至关重要，而且抑制该通路还会导致本该运往外膜的脂蛋白在内膜中积累，从而对细胞产生额外的致死毒性，这使其成为一个极具吸引力的新型抗菌药物靶点。

3. 脂蛋白定位（Lol）系统

本节深入解析了Lol系统的组成与工作机制。以研究最为透彻的大肠杆菌系统为范式，Lol系统由LolA、LolB、LolC、LolD、LolE五个蛋白质组成，共同负责识别、提取、运输并将外膜靶向脂蛋白插入外膜。其中，内膜复合体LolCD₂E是一个ATP结合盒（ATP-binding Cassette, ABC）型转运蛋白，由形成异源二聚体的LolC/LolE（具有大的周质结构域）和胞质侧的LolD₂ATP酶二聚体构成。LolA是周质中的分子伴侣，负责运输脂蛋白。LolB本身是一个外膜脂蛋白，接收来自LolA的货物并将其锚定在外膜脂双层中。

内膜转运蛋白LolCD₂E需完成多项任务：区分外膜靶向与内膜驻留脂蛋白；利用ATP水解释放的能量将脂蛋白从内膜中提取出来；招募LolA伴侣并完成脂蛋白的交接。其工作循环包括未结合、结合、转运和水解等多个状态。一个脂蛋白要通过Lol系统运往外膜需满足两个条件：1) 必须是三酰化形式；2) 必须具有正确的“分选信号”氨基酸序列。有趣的是，不同的变形菌门物种采用了截然不同的分选规则和机制。在大肠杆菌中，功能有明确分工：LolE负责结合脂蛋白，LolC负责招募LolA，LolD则提供ATP水解动力以驱动构象变化，完成脂蛋白的释放与交接。

然而，许多革兰氏阴性菌（包括鲍曼不动杆菌）使用的并非LolCD₂E系统，而是一种由LolF同源二聚体与LolD₂组成的LolF₂D₂转运蛋白。LolF在序列上兼具大肠杆菌LolC和LolE的特征，可能是一种更古老的形态。LolF₂D₂系统的独特之处在于其对脂蛋白货物的三酰化要求可能不如LolCD₂E系统严格。对于鲍曼不动杆菌而言，Lol系统及其LolF₂D₂转运蛋白对其广谱耐药性至关重要。构建其固有的低渗透性外膜需要多种必需的外膜脂蛋白，而这些脂蛋白都依赖Lol系统运输。此外，其多种抗生素外排泵（如AdeC、AdeH、AdeK）以及某些获得性耐药蛋白（如碳青霉烯酶OXA-23）本身也是外膜脂蛋白，因此抑制Lol通路可同时破坏细菌的多个防御机制。

4. 脂蛋白运输通路抑制剂

本节详述了近年来发现的四种靶向Lol通路的小分子抑制剂，它们通过不同的药物发现策略被识别，主要针对大肠杆菌和/或鲍曼不动杆菌，并大多显示出窄谱抗菌活性。

4.1. 阿鲍辛（Abaucin）

阿鲍辛由Stokes课题组于2023年通过人工智能/机器学习辅助的药物再利用筛选发现，是一种针对鲍曼不动杆菌的窄谱杀菌剂。其发现过程始于用小型分子库筛选抑制鲍曼不动杆菌生长的活性分子，用以训练机器学习模型。优化后的模型从一个药物再利用中心库中筛选出阿鲍辛。该化合物最初是CCR2趋化因子受体拮抗剂。其对鲍曼不动杆菌标准菌株的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）约为2 μg mL^-1，具有杀菌活性，且对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌无效，显示出对鲍曼不动杆菌的高度选择性，并能克服临床分离株的固有或获得性耐药机制。通过自发突变筛选和转录组学分析，确认其作用靶点为Lol通路，具体是LolF（在鲍曼不动杆菌中，相当于大肠杆菌的LolE）。其耐药频率在10^-8至10^-7之间。体内外研究表明，阿鲍辛在治疗小鼠伤口感染时能显著降低细菌负荷，且对多种人类共生菌生长无抑制，提示其可能具有保护肠道微生物群的潜力。

4.2. 肠洛林（Enterololin）

同样由Stokes课题组发现，但此次目标转向肠杆菌科，特别是侵袭性大肠杆菌。肠洛林是通过一个多步骤过滤流程从一个约11000个分子的库中筛选得到，其前体是Bub1激酶抑制剂。其对临床分离株的MIC为16 μg mL^-1，但在高渗透性、外排缺陷的工程菌株中活性提高1024倍，表明渗透性和外排是其主要限制。当与破坏外膜的佐剂SPR741联用时，其对临床分离株的MIC可降至0.03125 μg mL^-1。肠洛林对肠杆菌科（如肺炎克雷伯菌）显示出初步特异性，但对其他菌种活性较弱。分子对接预测其结合于LolCD₂E复合物的LolE亚基（脂蛋白结合位点），并通过筛选耐药突变（位于LolC或LolE）得以验证。其耐药频率与阿鲍辛相似。小鼠模型显示，与SPR741联用可有效杀灭细菌，且对共生菌影响小，可能保留肠道微生物组组成。

4.3. 洛拉霉素（Lolamicin）

Hergenrother课题组采用基因型筛选策略，在已知LolCD₂E是靶点的基础上，对已报道的抑制剂（吡啶吡唑类和吡啶咪唑类）进行结构优化，旨在改善细胞积累。通过叠加初始命中化合物结构和结构-活性关系（Structure-Activity Relationship, SAR）研究，他们发现针对周质靶点，细胞整体积累并非必需，并由此发现了洛拉霉素。该化合物对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌野生型菌株具有活性（MIC 1-4 μg mL^-1），在高渗透性菌株中活性大幅提高（MIC 0.008 μg mL^-1）。对多重耐药临床分离株也显示出良好活性。耐药突变同样出现在LolC或LolE基因，确认了靶点，其耐药频率在10^-7至10^-8。表型特征分析与LspA抑制剂格洛博霉素相似。分子对接预测其结合位点涉及LolC和LolE的疏水口袋。体内研究表明，无论是腹腔注射还是口服给药，洛拉霉素均能有效降低小鼠细菌负荷，治愈感染。更重要的是，与广谱抗生素相比，洛拉霉素治疗对健康小鼠的肠道微生物群多样性无显著影响，并能最大程度减少艰难梭菌的定植，展示了其“保护肠道菌群”的潜力。

4.4. 芬地林（Fendiline）

Wuest课题组及其合作者通过药物再利用筛选，旨在发现针对碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌（Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii, CRAB）的活性分子。他们利用OXA-23碳青霉烯酶过表达会增加细胞适应度成本的原理，筛选了3000多种FDA批准药物。先导化合物洛美利嗪在OXA-23过表达的菌株中活性增强，但无野生型活性。后续基于结构相似性的筛选发现了芬地林（一种钙通道阻滞剂）。芬地林对野生型菌株活性较弱（MIC >128 μg mL^-1），但在高渗透性、外排缺陷且过表达OXA-23的菌株中活性显著提高（MIC 4 μg mL^-1）。当与佐剂（如PMBN、多粘菌素B、PaβN）联用时，对鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌的活性提高，表明药物积累是瓶颈。对映体测试显示(R)-芬地林活性优于(S)-芬地林，提示其基于蛋白质的作用机制。通过亲和力蛋白质谱分析和CRISPRi基因敲低技术，确认芬地林的靶点是Lol通路，特别是LolF亚基。研究进一步阐明，OXA-23本身是脂蛋白，依赖Lol系统运往外膜。当OXA-23过表达且Lol通路被抑制时，该酶错误定位在内膜，从而对细胞产生毒性。这种效应具有特异性，其他β-内酰胺酶过表达无此效应。此发现揭示了抑制Lol通路可与特定的细菌耐药机制（如碳青霉烯酶产生）产生协同致死效应。

5. 未来方向与展望

总结指出，针对脂蛋白运输通路（LolCD₂E或LolF₂D₂）的药物研发展示了其新颖性和应用价值。作为周质靶点，Lol抑制剂只需穿透外膜，避开了内膜渗透和胞内积累的难题。已展示的多种抑制剂（阿鲍辛、肠洛林、洛拉霉素）均显示出窄谱活性，有望在治疗感染的同时保护肠道微生物群。芬地林的研究则揭示了抑制Lol通路可与特定耐药机制（如OXA-23过表达）产生协同作用，为联合治疗提供了新思路。未来研究方向包括：进一步阐明如鲍曼不动杆菌等病原体中Lol复合物的精细结构，以指导合理的药物设计；探索与佐剂（如SPR741）的联合用药方案，以克服外膜渗透屏障，扩大可用抑制剂的范围。总之，靶向Lol通路为开发能够规避现有耐药机制、且对宿主微生物组友好的新型革兰氏阴性菌抗生素带来了光明前景。