经过比率调节、采用绿光合方法制备的Ag–Fe双金属纳米粒子，被嵌入到电纺得到的明胶/壳聚糖纳米纤维支架中，用于抗菌应用

《RSC Advances》：Ratio-tuned green-synthesized Ag–Fe bimetallic nanoparticles embedded in electrospun gelatin/chitosan nanofibrous scaffolds for antibacterial applications

　　Nour Alhuda Asad | Fatih Erci | Fatma Bayram
化学工程系，科尼亚技术大学，科尼亚，土耳其
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由耐药微生物引起的伤口和设备相关感染是全球主要的健康问题，增加了发病率、死亡率和经济负担。因此，抗菌纳米纤维支架作为一种能够降低感染风险的敷料而受到了关注。在这项研究中，利用超果菊（Hypericum perforatum）叶提取物通过绿色合成路线制备了含有银铁双金属纳米颗粒（Ag–FeNPs）的明胶/壳聚糖（GEL/CTS）纳米纤维支架，作为潜在的抗菌伤口敷料材料。Ag–FeNPs在室温下制备，并通过不同的分析技术进行了表征。微观结构分析证实这些生物纳米颗粒呈球形，平均粒径为60.98 ± 18.09纳米，并均匀分布在GEL/CTS纤维中。随后将不同Ag:Fe比例的Ag–FeNPs嵌入聚合物基质中，以提高支架的润湿性和抗菌性能。FT-IR、XRD、FE-SEM和水接触角测量结果表明，加入CTS和Ag–FeNPs后纤维直径减小（171.47 ± 55.96纳米），亲水性增强，其中GEL/CTS/Ag–Fe（2:1）配方的WCA值最低（60.72°）。针对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）进行的抗菌测试显示，绿色合成的Ag–FeNPs对这两种菌株均具有活性，其中对大肠杆菌的抑制效果更强。在所有纳米纤维支架中，含有最高Ag成分的样品表现出最显著的细菌菌落形成减少效果。总体而言，这些发现表明，添加了Ag–FeNPs的GEL/CTS支架具有优异的结构和生物特性，显示出其作为伤口敷料等应用中有效抗菌材料的潜力。

1. 引言
纳米材料的尺寸在1到100纳米之间，由于其较大的表面积与体积比而在各种应用中占据重要地位。由于其独特的物理、化学和催化特性，纳米材料已成为现代纳米技术中最有趣和最重要的研究领域之一。

2. 金属纳米颗粒在各个应用领域中备受关注。绿色合成方法利用生物材料，尤其是植物提取物，最近作为传统物理和化学合成方法的替代方案而受到欢迎。与化学合成相比，生物方法减少了有毒物质的使用，提供了更为环境友好的选择。在纳米颗粒中，银纳米颗粒（AgNPs）由于具有强烈的抗菌、抗氧化和细胞毒性作用而被广泛研究。特别是通过绿色路线合成的AgNPs因其优异的生物相容性而在生物应用中具有显著优势。另一方面，铁纳米颗粒（FeNPs）因其生物相容性、低毒性和高催化效率而受到关注。新兴研究越来越关注双金属纳米颗粒（BMNPs）作为单金属纳米颗粒的先进替代品。虽然BMNPs是通过传统的自上而下的方法制备的，但它们通过协同效应提供了更优越的功能，包括增加的表面反应性、强大的稳定性和优化的生物相容性，从而拓宽了其应用范围。

近年来，纳米纤维因其优于传统纤维结构的独特性能而受到广泛关注。作为一类重要的纳米材料，纳米纤维具有高表面积与体积比、低密度、高达90%的独特孔隙率以及可化学功能化的特性，为许多生物医学应用（如组织工程、药物递送和生物传感器）带来了巨大潜力。尽管存在多种纳米纤维制备技术，但电纺法被认为是最通用、最直接且最具成本效益的方法。在标准电纺装置中，液体喷射通过电场从泰勒锥体中喷出，随后被拉伸并固化成纤维。纳米纤维生产效率受材料性质（如导电性和浓度）以及加工参数（如电压、流速和喷头至收集器距离）的显著影响。

基于生物的聚合物材料因其环境友好性、可再生性和固有的生物降解性而成为近期研究的重点。壳聚糖作为一种最常见的天然聚合物引起了广泛关注，主要来源于甲壳类动物、昆虫和真菌，经过化学或酶法脱乙酰化处理后得到壳聚糖，这种衍生物在生物医学领域得到广泛应用。基于壳聚糖的生物纳米复合材料因其生物相容性、无毒性及多功能性而在组织工程、药物递送和伤口/烧伤敷料中得到广泛应用。此外，壳聚糖在食品工业中还用作抗菌包装剂和乳化剂，这些功能归因于其分子结构中的亲水性和疏水性基团。

在本研究中，采用超果菊提取物作为还原剂和稳定剂，通过绿色化学方法合成了双金属Ag–FeNPs。超果菊是一种具有抗菌、抗氧化和抗炎活性的药用植物，这些活性与伤口愈合和感染控制应用密切相关。选择这种植物作为原料的理由在于其已建立的生物医学相关性和多功能性。使用不同Ag:Fe摩尔比的Ag–FeNPs制备的纳米颗粒随后被嵌入通过电纺法制备的GEL/CTS纳米纤维支架中。虽然之前已有关于单一Ag或FeNPs的抗菌活性的报道，但将不同Ag:Fe比例的双金属Ag–FeNPs加入GEL/CTS纤维中对抗菌性能的影响尚未得到充分探索。整合Ag–FeNPs的目的是为了提高支架的润湿性和协同抗菌效果。为了评估双金属组成对最终复合材料的影响，对纳米颗粒和负载纳米颗粒的纳米纤维垫进行了表征，使用多种分析技术系统分析了其结构、形态和物理化学性质，并评估了对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌效果，为生物聚合物纳米纤维支架的合理设计提供了新的见解。

2. 实验部分
2.1 材料
本研究使用的生物聚合物基质为B型明胶（来自牛皮，约75%缩水，Sigma-Aldrich，美国）和中等分子量的壳聚糖（Mw = 300,000 g mol^-1，脱乙酰化程度>75%，Sigma-Aldrich）。硝酸银（AgNO3，Sigma-Aldrich）和硝酸铁（Fe(NO3)3，Sigma-Aldrich）用于制备抗菌双金属纳米材料。醋酸（AC，Merck）和乙醇（Ethanol，Sigma-Aldrich）作为溶剂；柠檬酸（CA，Merck）作为交联剂。所有化学品均为分析级，按接收状态直接使用。

2.2 植物提取物的制备
新鲜风干的超果菊叶片用双蒸水多次冲洗以去除附着的灰尘和表面杂质，然后在室温下干燥直至完全蒸发水分。将干燥后的叶片研磨成均匀粉末，取6克粉末溶于240毫升热水中，在80°C下持续磁力搅拌2小时以有效提取植物成分。静置过夜以确保完全提取后，用Whatman No. 1滤纸过滤。所得滤液代表超果菊的水提取物，储存在4°C的暗处。

2.3 银铁双金属纳米颗粒的生物合成
首先，使用表1列出的特定摩尔比配制Ag–Fe前体溶液，所用原料为1 M AgNO3和1 M Fe(NO3)3。混合液在磁力搅拌下持续60分钟以确保均匀混合。随后逐渐加入60毫升新鲜制备的超果菊提取物，并在持续搅拌条件下维持约2小时以促进纳米颗粒的成核和生长。

2.4 生物聚合物纳米纤维的制备
首先制备15%（w/v）的纯明胶溶液，在50%（v/v）醋酸溶液中连续搅拌1小时，然后在室温下磁力搅拌24小时以获得均匀溶液。接下来分别配制GEL和CTS溶液：CTS溶液（0.01 g mL^-1）在45°C下用50%醋酸水溶液溶解4小时；GEL溶液（0.1 g mL^-1）在相同条件下配制。将两种溶液以1:1（v/v）的比例混合，并通过持续搅拌48小时以形成均匀的GEL/CTS前体混合物。为了制备GEL/CTS/Ag–Fe纳米纤维支架，将预配的GEL/CTS溶液与不同Ag和Fe含量的Ag–FeNPs（相对于总聚合物重量的5%）混合。Ag–FeNPs悬浮液先分散在AC-水二元溶剂系统中并超声处理60分钟以实现均匀分散并防止团聚。将这些纳米颗粒悬浮液加入GEL/CTS基质中并磁力搅拌48小时以确保完全混合。

2.5 纳米颗粒和纳米纤维支架的表征
使用先进的分析技术对合成的纳米颗粒和电纺纳米纤维支架的形态特征和化学成分进行了表征。傅里叶变换红外（FT-IR）光谱是使用岛津IR Prestige-21光谱仪获得的，而光学吸收分析则是利用岛津UV-1700 UV-vis分光光度计进行的。纳米纤维的表面形态和结构完整性通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM；Zeiss SEM 500）进行了检测。纳米颗粒的晶体相通过X射线衍射（XRD；PANalytical Empyrean）进行分析，该方法使用了Cu Kα射线（λ = 1.54 ?，40 kV），衍射角（2θ）范围为5°–80°。通过Ag(111)反射利用谢勒方程估算了银（Ag）域的平均晶粒尺寸。Ag–FeNPs的详细形态和粒径进一步通过透射电子显微镜（TEM；JEOL JEM-2100）进行了探讨。Ag–FeNPs的粒径分布以及GEL/CTS/Ag–Fe支架的纤维直径测量使用ImageJ软件进行了定量分析。为了评估电纺支架的润湿性能，使用接触角测量仪（Biolin Scientific Attension，Theta Lite）在室温下进行了静态水接触角（WCA）测量。对于每个样品，轻轻将4 μL蒸馏水滴在纳米纤维表面，并记录了六次重复测量以确定平均WCA值。

2.6. Ag–FeNPs和支架样品的抗菌活性测试
合成的纳米颗粒的抗菌效果通过琼脂孔扩散法进行了评估。使用了革兰氏阳性金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）和革兰氏阴性大肠杆菌（ATCC 25922）作为模型微生物。首先，将冻干培养物接种到含有20%甘醇的营养肉汤（Nutrient Broth，NB）中以制备储备培养物，并将其储存在-18°C下以保持活力。在实验中，将储备培养物中的菌落转移到新鲜的NB中并在35°C下孵育过夜。制备细菌悬浮液并将其调整至0.5 McFarland浊度标准。调整后，将这些培养物均匀涂抹在Mueller–Hinton琼脂（MHA）平板上。然后，在平板上精确切割出孔洞。随后，在每个孔洞中加入100 μL纳米颗粒悬浮液，并对其进行30分钟的超声处理以确保均匀分散。之后，将平板在37°C下孵育16小时以允许细菌生长。孵育期结束后，测量孔洞周围的抑菌圈直径（以毫米为单位）来确定抗菌活性。所有操作都重复三次。

2.7. 统计分析
定量数据的统计分析使用单因素方差分析（ANOVA）进行。所有值均以平均值±标准差的形式呈现，统计显著性在p < 0.05时被接受。

3. 结果与讨论
3.1. 使用H. perforatum提取物合成的绿色Ag–FeNPs的表征
使用H. perforatum提取物合成的绿色Ag–FeNPs通过多种分析技术进行了表征。使用UV-vis分光光度仪记录了Ag–FeNP溶液和H. perforatum提取物的吸收光谱，所有样品的结果如图3所示。对于合成的AgNPs，观察到一个在447 nm处有最大峰值的宽吸收带（图3a）。AgNPs的特征表面等离子体共振（SPR）峰的出现与早期研究结果一致，证实了银纳米颗粒的成功形成。在FeNPs和Ag–FeNPs的情况下，观察到356 nm和300 nm处有明显的吸收峰，分别对应于金属铁（图3a）。这些峰可能与Fe残留物和铁的集体表面等离子体振荡有关。在之前的研究中也报告了FeNPs中的此类SPR带在FT-IR光谱中的存在。

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图3. (a) AgNPs、FeNPs和Ag–FeNPs样品以及(b) H. perforatum叶提取物的UV-vis光谱。
如图所示，当单独分析Ag和Fe纳米颗粒时，每种颗粒都展示了其特征性的UV-vis吸收光谱。对于双金属纳米颗粒，虽然吸收轮廓与FeNPs相似，但随着银含量的减少，观察到明显的蓝移以及峰强度的增加。这种位移归因于Fe的散射效应，表明形成了银-铁核壳双金属纳米颗粒。在其他关于双金属纳米颗粒合成的研究中也有类似的观察结果。

图4展示了使用H. perforatum叶提取物合成的生物活性Ag、Fe和Ag–FeNPs的FT-IR光谱，以及提取物本身的光谱。FT-IR轮廓证实了从叶子中提取的生物活性化合物的存在，这些化合物负责还原Ag+和Fe3+离子并将它们附着在纳米颗粒表面。先前的研究报告指出，植物来源的黄酮类化合物和生物黄酮衍生物在O–H伸缩区域、脂肪族C–H振动和芳香环模式中显示出特征性的红外信号。在本研究中，纳米颗粒的FT-IR光谱显示了位于3293、2918、2858、2356、1727、1602、1022、670和594 cm?1的吸收带。3700–3000 cm?1区域的宽带对应于羟基的O–H伸缩振动。2918、2858和2356 cm?1处的峰归因于脂肪族C–H伸缩振动，而1727、1602和1022 cm?1的带与CO伸缩模式相关。最后，670 cm?1处的带归因于C–O伸缩。H. perforatum提取物的FT-IR光谱与先前报道的结果非常相似。

在Ag、Fe和Ag–FeNPs的生物合成后，与原始提取物相比，观察到吸收峰强度明显降低。这种衰减表明提取物对纳米颗粒进行了包覆，减少了金属离子，并在合成过程中稳定了纳米颗粒。根据多项研究，这些还原和稳定性质归因于H. perforatum提取物中存在的多酚类化合物，如黄酮类和酚酸。

X射线衍射（XRD）分析用于确定使用H. perforatum提取物合成的绿色纳米颗粒的晶体结构。使用H. perforatum提取物合成的Ag、Fe和Ag–FeNPs的XRD图案如图5所示。对于AgNPs，在2θ值为38.36°、44.34°、64.63°和77.52°处观察到强烈的衍射峰，分别对应于面心立方（fcc）Ag的（111）、（200）、（220）和（311）晶面（JCPDS卡片号04-0783）。利用谢勒方程从Ag(111)反射估算出Ag域的平均晶粒尺寸，约为9 nm，表明是纳米级连贯的晶态Ag域，而不是整体颗粒尺寸。

相比之下，FeNPs的XRD图案没有显示出明显的尖锐衍射峰，表明其结晶度较低或处于高度分散的结构状态，而不是明确的晶态相。这种行为与通过绿色途径合成的FeNPs的先前报道一致。在Ag–Fe（2?:?1）纳米颗粒系统中，仍然可以辨别出与Ag(111)平面对应的衍射特征；然而，其强度和信噪比显著降低，因此无法使用谢勒方程可靠地估算晶粒尺寸。从定量角度来看，Ag相关衍射信号的衰减表明随着Fe掺入Ag基系统，有效结晶度明显受到抑制。对于Fe含量较高的Ag–FeNPs（1?:?1和1?:?2比例），与Ag相关的衍射峰被严重抑制或几乎无法区分，表明随着Fe浓度的增加，晶态有序性进一步降低。对于任何Ag–Fe组成，均未检测到可归因于结晶Fe或氧化铁相的明显衍射峰，表明Fe物种以高度分散和/或低结晶度的状态存在。XRD结果表明，随着Fe含量的增加，结晶Ag相逐渐被抑制，导致有效结晶度降低，而不是双金属纳米颗粒系统中完全缺乏Ag。

使用H. perforatum叶提取物合成的生物活性Ag–FeNPs的透射电子显微镜（TEM）图像如图6所示。基于结构（XRD）和功能性能的总体评估，仅对表征最具代表性的Ag–Fe（2?:?1）纳米颗粒系统进行了TEM分析。对于每个纳米颗粒样品，测量了100个单个颗粒的直径，并将结果大小分布表示为直方图以显示平均颗粒尺寸（如图6所示）。AgNPs的TEM分析显示了具有均匀分布的球形形态，没有聚集的证据。Ag–FeNPs的平均颗粒尺寸确定为60.98 ± 18.09 nm。这些双金属纳米颗粒通常比之前报道的类似物更小，颗粒直径范围大约为20至110 nm。观察到的尺寸差异可能归因于在绿色合成过程中使用了植物叶提取物作为还原和稳定剂。在更高的放大倍数下，Ag–FeNPs的TEM图像显示出了莫尔干涉条纹和明显的形态，表明具有银核和铁壳的结构，这与文献报道一致。莫尔干涉条纹是由于重叠或略微旋转的晶体层之间的干涉造成的。TEM显微图中的此类条纹pattern确认了双金属Ag–FeNPs的结晶性。

3.2. GEL/CTS/Ag–Fe纳米纤维支架样品的化学组成和形态
进行了傅里叶变换红外（FT-IR）光谱分析，以确定GEL、GEL/CTS和GEL/CTS/Ag–Fe纳米纤维支架中存在的官能团，并评估各组分的掺入如何影响整个聚合物基质。制备的纳米纤维支架的FT-IR光谱如图7所示。纯GEL和GEL/CTS支架的光谱显示出几个相似的峰，这些峰归因于GEL和CTS中共有的官能团。大约3283 cm?1处的宽带归因于O–H伸缩振动。在大约3085 cm?1和2983 cm?1处观察到的弱信号分别对应于烯基C–H伸缩和CH2伸缩振动。在1632 cm?1附近的强吸收与酰胺键中的CO伸缩有关。其他特征性带包括1520 cm?1（N–H弯曲与C–N伸缩）、1445 cm?1（CH2弯曲）、1280 cm?1（N–H弯曲）和1078 cm?1（C–O伸缩）。GEL/CTS和负载Ag–FeNP的GEL/CTS纳米纤维之间的比较显示峰位没有显著变化。仅观察到峰强度的轻微降低和少量带位置的变化，这可能是由于纳米颗粒的负载量较低（相对于总聚合物重量为5 wt%）。重要的是，Ag–FeNPs的掺入没有引起任何官能团的破坏，表明纳米纤维支架在纳米颗粒整合后保持了稳定的化学结构。

X射线衍射（XRD）分析用于研究Ag–FeNPs对GEL/CTS纳米纤维支架晶体结构的影响。所得到的衍射图案如图8所示。纯GEL显示出非常宽且弱的衍射峰，这证实了其非晶态的本质。相比之下，GEL/CTS支架在2θ约为15°–28°之间显示出一个宽峰，且强度比纯GEL纳米纤维更高，表明这两种聚合物组分之间的相容性良好。负载了AgNPs的GEL/CTS纳米纤维在2θ值为38.23°、44.41°、64.63°和77.56°处显示出明显的衍射峰，分别对应于面心立方（fcc）Ag的（111）、（200）、（220）和（311）晶面（JCPDS卡片编号04-0783）。这些结果表明，尽管聚合物支架主要是非晶态的，但其中仍可检测到结晶Ag结构。

图8. 纯GEL、GEL/CTS和GEL/CTS/Ag–Fe纳米纤维支架的XRD光谱。与Ag相关的弱衍射特征根据JCPDS卡片编号04-0783被指数化为面心立方（fcc）Ag。在高角度观察到的次要低强度特征可能与来自绿色合成过程的表面结合的生物有机物种有关；然而，在以聚合物为主的衍射背景中，它们的贡献是有限的。

对于负载了不同组成的双金属Ag–Fe NPs的GEL/CTS支架，Fe含量的增加导致与Ag相关的衍射峰逐渐减弱。特别是对于Ag–Fe（2:1）组成的支架，仍然可以辨别出与Ag(111)相关的衍射特征，尽管其强度和信噪比显著降低。在含有FeNPs的纳米纤维支架中，没有观察到归属于结晶Fe或氧化铁相的明显衍射峰，这表明聚合物基质中的结晶度较低或Fe的状态高度分散。

从定量角度来看，Ag相关衍射特征在Ag–Fe负载支架中的减弱可归因于Fe掺入和聚合物限制效应导致的有效结晶度降低，而非金属成分的缺失。此外，相对较低的纳米颗粒负载水平（占总聚合物含量的5 wt%）本质上限制了XRD对分散金属相的敏感性。这些结果表明，纳米颗粒组成和聚合物限制共同决定了GEL/CTS纳米纤维支架中的结晶特性。

使用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）检查了GEL、GEL/CTS和GEL/CTS/Ag–Fe纳米纤维支架的形态。作为天然生物聚合物，GEL因其可生物降解性和生物相容性而广泛用于生物医学应用。先前的研究已经报道了使用极性有机溶剂（如2,2,2-三氟乙醇和六氟乙醇）通过静电纺丝法制备基于GEL的纳米纤维。在组织工程中，通过使用各种溶剂和溶剂混合物（包括甲酸、醋酸、异丙醇和水）增强了GEL溶液的静电纺丝性能。在本研究中，采用了一种完全绿色的静电纺丝策略用于生物医学应用，选择了醋酸-水混合物作为溶剂系统。获得了每个纳米纤维支架的FE-SEM图像，并使用ImageJ软件测量了每样本100根纤维的直径以确定平均纤维直径（表2）。CTS、GEL/CTS和GEL/CTS/Ag–Fe支架的FE-SEM图像、元素映射结果和纤维直径直方图显示在图9中。纳米纤维的形态和直径受多种参数影响，包括溶液性质和静电纺丝条件。在本研究中，所有样本的静电纺丝参数（如施加电压、工作距离和流速）保持不变。因此，纤维形态主要由聚合物粘度和添加的纳米颗粒的类型和浓度决定。

纯GEL纳米纤维显示出均匀、无珠状的结构，平均直径为206.97 ± 77.67 nm（图9a）。在GEL/CTS支架中，两种聚合物的高分子量和粘度加上不完全互溶性导致纤维分布不均，偶尔形成珠状结构（图9b）。CTS的加入将平均纤维直径降至102.86 ± 55.36 nm。对于负载了Ag–FeNPs的GEL/CTS支架，FE-SEM分析显示纤维均匀且无珠状结构，平均直径为171.47 ± 55.96 nm。与GEL/CTS纤维相比，Ag–FeNP的加入增加了纤维直径并提高了均匀性（图9c）。这种变化可以归因于来自H. perforatum提取物的绿色合成Ag–FeNPs的存在和封装，这些纳米颗粒影响了静电纺丝过程中的喷射拉伸行为和聚合物-纳米颗粒相互作用。当分析负载了不同Ag与Fe比例的Ag–FeNPs的纤维时，平均直径在150到180 nm之间变化，Ag含量较低时直径较小。这表明添加的纳米颗粒的组成变化影响了静电纺丝过程和所得纤维的形态。在静电纺丝过程中，喷射表面的较高电荷密度增加了电场力，可以克服重力并减小平均纤维直径。

元素分析（EDS）确认了所有支架样品中存在C、O、N、Ag和Fe。EDS光谱验证了Ag和Fe在纤维表面的存在。由于结构相似，GEL和CTS中的C、O和N含量相当。在负载了Ag–FeNP（2:1）的纤维中，Ag的含量大约是Fe的两倍，表明双金属纳米颗粒在复合纤维中均匀分散。

通过WCA测量评估了制备的纳米纤维支架的润湿性，如图10所示。每个支架样品的接触角值总结在表2中。通过分析水滴在纳米纤维表面形成的接触角来评估支架的亲水性。根据先前的报告，WCA低于90°表明支架具有高孔隙率和亲水性，适合生物医学应用；而WCA高于90°则表明表面疏水，孔隙率低，在组织工程中的应用性较差。

GEL/CTS支架的WCA为66.15°，反映了与生物聚合物中存在的官能团相关的亲水表面特性。在测试的支架中，负载了AgNPs的GEL/CTS纳米纤维显示出最低的WCA（49.27°），表明AgNPs的加入增强了支架的表面润湿性。这一发现与先前的研究报告一致。对于负载了双金属Ag–FeNPs的支架，Fe含量的增加导致表面亲水性降低，这可以归因于Fe掺入引起的表面组成变化和纳米颗粒-聚合物相互作用。结果表明，根据Ag与Fe的比例，从亲水行为转变为较不亲水的行为，2:1的比例提供了最佳的亲水性。文献也表明，添加Fe或Fe3O4纳米颗粒往往会降低纳米纤维垫的润湿性。

总体而言，负载了Ag–Fe NP的纳米纤维支架的WCA值范围大约在49°到89°之间，证实了它们的亲水性。这些支架的亲水表面特别有利于细胞附着、增殖和组织整合。在伤口愈合的背景下，亲水支架表面有助于细胞附着在敷料上，促进伤口更快闭合和愈合。因此，GEL/CTS/Ag–Fe纳米纤维支架的增强润湿性支持了它们在各种生物医学应用中的潜在用途，包括伤口敷料。

通过琼脂孔扩散试验评估了具有不同Ag与Fe摩尔比例的双金属Ag–Fe NP的抗菌潜力。通过测量生长抑制区的直径（mm）来确定有效性，如图11和12所示。在合成的纳米材料中，纯AgNPs表现出最强的抗菌活性，特别是在对抗革兰氏阴性大肠杆菌时，最大抑制区为14.34 ± 0.40 mm。在双金属组成中，Ag–FeNP（2:1）比例表现出最佳性能，尤其是在对抗大肠杆菌时，抑制区为13.61 ± 0.18 mm。相反，在含有银的样品中，Ag–FeNP（1:1）组成的抗菌活性最低，对抗大肠杆菌的抑制区为9.88 ± 0.14 mm。有趣的是，虽然双金属样品对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌表现出相对相似的结果，但在对抗大肠杆菌时观察到了明显的剂量-反应关系，其中Ag–FeNP（2:1）的表现显著优于Ag–FeNP（1:1）。这表明双金属结构中较高的银含量对于增强对抗革兰氏阴性菌的抗菌活性至关重要。值得注意的是，纯FeNP对这两种细菌均没有显示出可检测的抑制区，证实了双金属系统的抗菌特性主要由银的存在和协同整合驱动。我们的研究进一步表明Ag–Fe比例非常重要。为了保持高抗菌效果，双金属结构中需要更多的银来有效阻止细菌生长。

抗菌性能是通过6小时培养期后的光密度（O.D.）测量来评估的（图13）。结果表明，纳米纤维对金黄色葡萄球菌的抑制效果相对有限。在测试的组中，AgNPs和Ag–FeNPs（2:1）整合纤维样品对这种菌株的抑制水平最高。这些发现与孔扩散试验观察到的趋势高度相关。

综合分析结果表明，无论是裸露的双金属纳米颗粒还是它们的相应纳米纤维复合材料，都对革兰氏阴性大肠杆菌比革兰氏阳性金黄色葡萄球菌更有效。日益严重的全球抗生素耐药性危机，加上传统抗菌剂的高经济负担，迫切需要开发高效且成本效益高的配方。本研究的发现表明，银仍然是抗菌效果的主要驱动力。然而，考虑到银的固有毒性，将其作为与铁等更具生物相容性的金属组成的双金属系统具有战略优势。研究发现，这种整合并没有显著降低抗菌效果，纳米纤维垫的性能几乎保持不变。这些观察结果与现有文献中关于银-铁双金属系统的报道一致。24., 48.总体而言，这些发现表明了明确的成分依赖性抗菌行为，证实了精确调节Ag:Fe摩尔比是优化双金属纳米纤维系统抗菌性能的关键参数。与先前报道的基于聚合物的抗菌创可贴系统相比，大多数纳米纤维支架主要通过将单一金属银纳米颗粒结合到各种聚合物基质中来实现抗菌功能。49 虽然这种方法得益于银已建立的抗菌效果，但它们通常依赖于相对较高的银含量，并且在成分优化方面灵活性有限。在本研究中，将Ag-Fe双金属纳米颗粒整合到明胶/壳聚糖纳米纤维基质中代表了一种独特的设计策略，使得在可生物降解且生物相容的支架平台上实现成分调控成为可能。研究表明，Ag-Fe（2:1）配方能够在不增加过量银含量的情况下展现出增强的抗菌性能，同时保持良好的表面润湿性和均匀的纤维形态。这种效率表明铁成分提供了协同增强效果。虽然银被认为可以通过自由基途径诱导细胞内氧化应激，但其在较低浓度下的有效性表明铁作为膜不稳定的生化催化剂发挥作用。具体而言，铁针对细菌细胞壁蛋白中的半胱氨酸残基的巯基侧链。这种结构上的改变使得即使在亚最大剂量下银物种也能更容易穿透。24., 50., 51. 本研究中的GEL/CTS聚合物基质整合相比合成替代品具有明显的优势，特别是在潜在的细胞相容性和可降解性方面，这些都是功能性创可贴应用的关键参数。52 虽然传统上关于Ag/PVA纳米纤维的研究强调达到高抗菌率严格依赖于提高银的负载密度，但我们的基于GEL/CTS的Ag-Fe双金属系统通过协同机制实现了可比的效果，同时显著降低了银含量。53 这种协同效应不仅优化了抗菌性能，还提高了材料的安全性。事实上，已有报道指出包含壳聚糖和金属氧化物纳米颗粒的类似纳米纤维系统能够保持高细胞活力，这表明我们设计的具有降低银铁比例的GEL/CTS基质很可能为生物医学应用提供类似的无毒性特征。54 因此，通过利用铁的生化促进作用以及GEL/CTS支架的生物相容性，我们提供了一种更可持续、更安全的替代方案，无需使用高剂量的银基敷料，同时不降低杀菌效率。4. 结论在本研究中，使用H. perforatum叶提取物通过绿色方法合成了Ag-Fe双金属纳米颗粒，并将其整合到静电纺制的GEL/CTS纳米纤维支架中，用于潜在的创可贴应用。生物合成的纳米颗粒呈球形，平均直径为60.98 ± 18.09 nm，并在聚合物网络中均匀分布。将CTS加入GEL中减少了纤维直径，而添加Ag-FeNPs则由于纳米颗粒的包裹作用和溶液导电性的降低而增加了纤维直径。含有Ag-FeNPs（2:1 Ag:Fe比例）的支架呈现出有利的纤维尺寸（约150–185 nm），并保持了均匀且无珠状的结构。XRD分析确认了AgNPs的晶体特征，并表明FeNPs具有低结晶度或高度分散的结构状态；而Fe含量的增加导致复合纤维中与银相关的衍射强度逐渐降低。润湿性测量显示了明显的成分依赖性趋势。纯FeNP负载的支架表现出疏水性（WCA ≈ 108°），而银含量的增加逐渐降低了接触角，含银的支架显示出更高的亲水性。载银支架最具亲水性（WCA ≈ 49°），这有助于维持伤口相关应用所需的水分交换。富铁组成接近亲水阈值，而富银系统则保持较低的WCA值。抗菌结果显示，相对于金黄色葡萄球菌（S. aureus），银对大肠杆菌（E. coli）的抑制作用更强，且铁的添加并未显著降低基于银的系统的抗菌效率。这些发现表明，通过绿色路线合成的Ag-FeNPs可以在 potentially 减少高银浓度的同时提供有效的抗菌功能。总体而言，这里开发的Ag-Fe NPs增强的GEL/CTS支架作为一种环保、生物活性的抗菌材料，在潜在的创可贴应用中表现出良好的特性。结果强调，调节Ag:Fe比例可以在可持续的制造框架内控制表面润湿性和抗菌性能。未来的研究可以系统评估Ag:Fe比例与抗菌效率和细胞相容性之间的关系，包括体外细胞活力和增殖实验。此外，整合其他生物活性剂或探索替代的生物聚合物基质可能进一步增强这些支架的功能，支持其向先进的、可持续的生物医学应用发展。作者贡献Fatma Bayram：概念构思、监督、方法学、表征、数据分析、撰写——原始草稿。Fatih Erci：概念构思、监督、抗菌实验、撰写——审阅和编辑。Nour Alhuda Asad：实验工作、合成和数据收集支持。利益冲突作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报道的工作。数据可用性所有支持本研究发现的数据都包含在主文章中。