《Nature Communications》：Using rotational integration of oblique interferometric scattering to track axial spatiotemporal responses of tubular membrane protrusions
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管状膜凸起的三维时空动力学对于理解吞噬作用、细胞通讯和力学生物学至关重要。共聚焦显微镜尽管在膜凸起研究中广泛应用，但由于其固有的低轴向分辨率和高光毒性，显著阻碍了管状凸起沿轴向平面的活细胞成像。研究人员发现，旋转斜向干涉散射（RO-iSCAT）利用离轴照明，使
管状膜凸起的三维时空动力学对于理解吞噬作用、细胞通讯和力学生物学至关重要。共聚焦显微镜尽管在膜凸起研究中广泛应用，但由于其固有的低轴向分辨率和高光毒性，显著阻碍了管状凸起沿轴向平面的活细胞成像。研究人员发现，旋转斜向干涉散射（RO-iSCAT）利用离轴照明，使离焦的干涉散射信号比聚焦信号产生更大的横向位移。这一现象产生了无散斑的宽场干涉散射信号，其信噪比提升了10倍，且无需任何背景扣除。RO-iSCAT实现了多种纳米颗粒和管状膜凸起的实时、无标记成像，从而提供了跨多种细胞类型及复杂共培养体系中管状膜凸起的生物物理特征分析。RO-iSCAT使得能够在无需三维体积成像的情况下，对膜凸起在数十至数百纳米位移下的轴向时空复杂性进行快速定量剖析。
一、 研究背景、问题与研究意义
膜凸起（如片状伪足、丝状伪足、微绒毛、侵袭伪足、足小体等）是具有动态三维时空行为的关键细胞结构，介导了细胞与外界环境的多种相互作用，在细胞迁移、信号传导、吞噬及细胞间通讯等过程中发挥核心作用。然而，精确成像和定量分析这些管状膜凸起的三维动态行为面临重大技术挑战。目前，共聚焦荧光显微镜是常用工具，但其轴向分辨率低，且在活细胞长时间成像中易造成光毒性和光漂白。电子显微镜虽可提供高分辨率结构信息，但样本制备过程会改变膜凸起的脆弱形态，且无法进行活体动态观测。其他宽场成像技术（如明场、荧光）也存在分辨率不足或依赖标记等问题。干涉散射显微镜具有高轴向灵敏度，但传统方法通常需要背景扣除以去除散斑噪声，这在复杂的细胞培养环境中难以实现，阻碍了对多个管状膜凸起时空模式的追踪。因此，开发一种能够对活细胞中管状膜凸起进行高分辨率、低光毒性的实时三维成像与追踪技术，对于深入理解其生物物理特性和功能至关重要。
本研究发表在《Nature Communications》期刊，介绍了一种名为“旋转斜向干涉散射”（Rotational Oblique Interferometric Scattering, RO-iSCAT）的新型成像技术。该技术通过旋转整合斜向照明下的干涉散射信号，有效消除了离焦背景噪声，实现了无散斑、无需背景扣除的高对比度干涉散射成像。研究人员利用RO-iSCAT对多种纳米颗粒、细胞外囊泡以及活细胞中的管状膜凸起进行了实时成像和三维追踪，并成功区分了不同类型的膜凸起（如膜迹、系索、细胞间桥）及其动态行为。这项研究为细胞膜生物物理学、细胞间通讯和纳米尺度细胞动力学研究提供了一种强大的无标记成像工具，具有重要的科学意义。
二、 主要关键技术方法
为开展研究，研究人员主要使用了以下关键技术方法：首先，建立了RO-iSCAT成像系统，该系统使用488 nm激光，通过一对振镜扫描仪在物镜后焦面实现定制化的离轴斜向照明和方位角旋转，并利用高数值孔径物镜和sCMOS相机进行成像。其次，进行了数值模拟，通过边界元法平台模拟了RO-iSCAT的三维干涉点扩散函数，并合成了不同噪声水平下的干涉信号，验证了旋转积分对信噪比的提升和对散斑噪声的抑制效果。最后，应用了生物样本制备与成像，包括对多种细胞系（如CAF、KPC、HMVEC、HMEC-1、β细胞、L929）进行培养和成像，使用40 nm金纳米颗粒、100 nm聚苯乙烯微球和KPC细胞来源的细胞外囊泡作为校准和验证样本，并在共培养体系（如CAF与KPC细胞共培养）中研究细胞间相互作用。研究还通过长期激光照射实验评估了RO-iSCAT的光毒性。
三、 研究结果
1. 旋转积分消除离焦干涉散射信号
通过数值建模和实验验证，研究人员发现，在离轴照明下，离焦的干涉散射信号比聚焦信号经历更大的横向位移。旋转整合多个方位角的斜向照明干涉图像，能够选择性地增强聚焦平面的信号，同时有效抑制离焦背景，其效果类似于共焦配置。模拟显示，RO-iSCAT能够显著提高信噪比并抑制散斑噪声。
2. RO-iSCAT成像实现无散斑干涉散射且无需背景扣除
研究人员在自制RO-iSCAT系统上，对比了标准背景扣除的干涉散射成像与RO-iSCAT成像。在40 nm金纳米颗粒样本上，RO-iSCAT在相同曝光时间内获得了背景噪声和散斑显著更低的图像，能够分辨相距约280 nm的两个纳米颗粒，超过了阿贝衍射极限。在活细胞（CAF细胞）成像中，RO-iSCAT能够清晰地检测到细微的膜凸起，而标准方法则难以分辨。
3. RO-iSCAT实现活细胞的无标记、低光毒性三维追踪成像
利用RO-iSCAT，研究人员成功追踪了人肺微血管内皮细胞（HMVEC）内单个细胞外囊泡从细胞外自由扩散到被细胞内存的完整三维轨迹，并量化了其运动速度的变化。与仅基于散射的暗场旋转相干散射显微镜（ROCS）和高倾斜薄层照明荧光成像相比，RO-iSCAT在追踪细胞间膜桥的形成和扭曲动态方面显示出更优越的性能，能够揭示两个相邻膜凸起的初始接触、合并及扭转变形过程。长期成像实验表明，RO-iSCAT的照明功率引起的细胞光毒性极低，即使在连续照射22小时后，细胞活力和生长动力学也未受显著影响。
4. 膜迹、系索和细胞桥之间不同的时空动力学
通过对癌症相关成纤维细胞（CAF）的成像，研究人员根据干涉图样的特征（如条纹均匀性、明暗交替周期）和相对轴向位置，区分了三种主要的管状膜凸起类型：紧密贴附于基底面的“膜迹”、从细胞体伸出并向下倾斜的“系索”、以及连接两个细胞体且处于相似高度的“细胞间桥”。对六种不同细胞类型（CAF, HMEC-1, β细胞, HMVEC, KPC, L929）的统计分析表明，不同细胞类型形成的凸起数量存在显著差异，且系索是最常见的凸起类型。研究人员还引入了“轴向变化图”来量化膜凸起的轴向运动波动，结果显示细胞间桥的轴向运动幅度（平均138 nm）显著大于系索（81 nm）和膜迹（59 nm），表明其可能承受更大的物理张力。
5. 利用RO-iSCAT追踪共培养体系中细胞间膜连接的三维动态
在共培养实验中，研究人员首先将表达Lck10-GFP膜标记的CAF细胞与野生型CAF细胞共培养。RO-iSCAT能够清晰追踪到细胞间膜桥的动态形成和轴向运动，而荧光成像则因景深限制未能完全捕捉。在第二个实验中，研究人员将CAF细胞与胰腺导管腺癌KPC细胞在培养皿中分区共培养，观察了它们之间的相互作用。RO-iSCAT成像揭示了从独立的细胞-基底连接到细胞-细胞膜桥的转变过程，并捕捉到两个独立的膜凸起通过扭曲形态最终融合为单一连接的动态。轴向变化图分析表明，随着膜桥的形成，其轴向运动的波动范围显著增加，进一步证实了RO-iSCAT在解析细胞间连接动态方面的能力。
四、 讨论与结论总结
在讨论部分，研究人员阐述了RO-iSCAT技术的原理、优势、当前局限及未来展望。他们认为，旋转积分的作用类似于引入了部分相干探测，有效抑制了离焦干涉条纹。成像速度受限于旋转积分速率，未来可通过随机扫描等策略提升。高数值孔径物镜带来的像场弯曲限制了视场，计算像差校正方法或有帮助。轴向定量的准确性依赖于已知折射率校准样本，未来可通过微流控技术进行原位校准。细胞内复杂散射环境会影响干涉信号的定量，目前的数值模型基于单平面波照明简化，未来需开发适用于多重散射体的模型。本研究主要集中于定义明确的管状膜凸起，对于片状或球状凸起，其散射几何更复杂，产生的干涉图样也更复杂，需开发新的分析工具。虽然通过干涉散射特征对膜凸起进行了初步的生物物理鉴定，但缺乏细胞骨架成分和膜受体标记的共定位信息，未来可结合RO-iSCAT与分子标记技术，提供更全面的生物学解读。
研究结论：这项研究证明了利用旋转积分生成无散斑干涉散射图像的重要性。此外，通过识别和利用管状膜凸起的干涉特征与其各自潜在生物结构的关联，展示了RO-iSCAT作为生物物理分析工具的潜力。RO-iSCAT为在无需三维体积成像的情况下，快速定量剖析膜凸起在数十至数百纳米位移下的轴向时空复杂性提供了可能。
