结直肠癌中细菌脂多糖与免疫细胞的互作改变及其与配对癌旁肠组织的差异

《Gut Microbes》：Altered crosstalk of bacterial lipopolysaccharide with immune cells in colorectal cancer compared to paired adjacent intestinal tissue

　　

共生菌在调控肠道人类免疫反应中发挥关键作用。稳态条件下，肠道微生物组受黏膜免疫系统互作的严格调控。然而，结直肠癌(CRC)的特征是细菌组成失衡及细菌跨肠屏障易位，目前对CRC肿瘤内细菌的空间分布及其与免疫细胞互作的认识仍十分有限。研究人员通过对患者来源的CRC及癌旁肠组织联合应用三维光片成像、空间转录组学和成像质谱流式技术，实现了细菌脂多糖(LPS)与免疫细胞、血管的可视化。结果显示，区域性细菌LPS聚集并与特定免疫细胞亚群共定位。在CRC癌旁组织中，细菌LPS主要与CD11c+树突状细胞、CD15+中性粒细胞和CD163+巨噬细胞相关；而在配对的CRC组织中，CD163+巨噬细胞和CD11c+树突状细胞的数量及其与LPS的共定位均减少，CD15+中性粒细胞及其与LPS共定位则增加。值得注意的是，肿瘤与癌旁组织的免疫细胞组成及免疫细胞-细菌互作存在显著差异，这为宿主-微生物组动态关系及机制性互作提供了新的认识。

该研究发表于《Gut Microbes》，聚焦结直肠癌(CRC)中细菌与免疫系统的空间互作特征。当前研究已明确肠道微生物组及瘤内细菌参与癌症发生发展，稳态下肠道通过上皮屏障、先天与适应性免疫维持对共生菌的耐受并抵御病原体；CRC中存在细菌组成与功能异常、肠屏障破坏，部分菌种可在CRC组织中富集，但细菌在肿瘤中的空间定位、与免疫细胞的具体互作模式尚未得到系统性表征，限制了对其在CRC发病机制中作用的理解。为此，研究人员纳入配对的CRC组织与癌旁肠组织样本，整合多种空间分辨技术解析细菌脂多糖(LPS)的分布规律及与免疫细胞的互作差异，旨在阐明宿主-微生物组在肿瘤微环境(TME)中的动态变化，为CRC的菌群相关治疗策略提供依据。

研究采用的关键技术方法包括：对来自9例CRC患者的配对组织样本（含6例癌旁肠组织、5例匹配CRC组织，患者信息见补充表S1）进行处理，应用适配iDISCO的有机溶剂组织透明化与免疫标记技术结合三维光片成像，实现大体积组织中LPS、CD45（泛免疫细胞标志物）、PVALP（血管标志物）的三维可视化；采用空间转录组学分析3例患者配对组织的细胞类型组成；应用成像质谱流式(IMC)技术，基于31种免疫标志物及LPS抗体，对9例患者配对组织的免疫细胞亚群进行单细胞分辨率的空间表型分析；同时对患者样本的宏基因组数据（来自既往发表数据集，NCBI生物项目编号PRJNA1024674）进行再分析，验证细菌分类组成变化。

研究结果如下：

三维成像显示CRC组织中细菌LPS聚集并与免疫细胞共定位。对约5 mm3的组织样本进行三维染色发现，癌旁肠组织中LPS主要分布于上皮细胞层，源自富含细菌的黏液残留，仅3/6样本中观察到LPS向黏膜下层易位；CRC组织中LPS呈区域性聚集而非均匀分布，5例中4例单位体积LPS浓度高于癌旁组织，但患者间异质性显著。LPS与血管的共定位率极低（癌旁0.2%±0.07%，CRC 0.3%±0.05%），而与CD45⁺免疫细胞的共定位率达80%-90%。CRC组织单位体积血管数量（5817±2839）显著高于癌旁组织（2602±1163）。

空间转录组学检测到配对CRC组织中炎症上皮细胞增加。在3例患者配对样本中鉴定出10种细胞簇，CRC组织中炎症上皮细胞簇数量显著增加，该簇除表达上皮细胞标志物外，还高表达S100A8、S100A9、IL1B、MMP9及中性粒细胞趋化因子CXCL8；CRC组织中巨噬细胞丰度亦高于癌旁组织。

成像质谱流式检测到CRC组织中抗原呈递细胞减少、中性粒细胞增加。对9例患者配对组织的单细胞分析显示，CRC组织中CD163⁺巨噬细胞（组织驻留巨噬细胞标志物）比例（0.5%±0.1%）显著低于癌旁组织（3.6%±0.8%）；CD11c⁺树突状细胞在癌旁组织中占比1.6%±0.4%，CRC组织中因数量过少无法形成独立聚类；CD15⁺中性粒细胞在CRC组织中比例（7.7%±1.8%）显著高于癌旁组织（0.6%±0.1%），且该群共表达颗粒酶B。B细胞、αSMA⁺/CD31⁺基质细胞在CRC组织中比例显著降低，CD68⁺巨噬细胞、CD4⁺/CD8⁺T细胞比例无显著差异。两类技术检测的细胞群趋势一致。

CRC癌旁组织与CRC组织存在独特的细菌LPS-免疫细胞互作模式。以90百分位 cutoff 定义LPS⁺细胞，癌旁组织中LPS信号呈孤立点状，CRC组织中呈弥散状；癌旁组织LPS⁺细胞占总细胞比例（中位数~0.17）显著高于CRC组织（中位数~0.07），但绝对数量无显著差异。CRC组织中LPS⁺细胞比例与免疫细胞浸润比例呈正相关（rho=0.75，p=0.02），癌旁组织中无此关联。癌旁组织中74%±0.06%的树突状细胞、35%±0.06%的CD163⁺巨噬细胞、34%±0.08%的中性粒细胞为LPS⁺；CRC组织中CD163⁺巨噬细胞LPS⁺比例最高（21%±0.1%），其次为中性粒细胞（11%±0.02%）和上皮细胞（13%±0.02%）。LPS⁺细胞中，癌旁组织以树突状细胞、CD163⁺巨噬细胞为主，CRC组织以上皮细胞、中性粒细胞为主。宏基因组分析显示配对组织间总体菌属组成无显著差异，仅Lachnoclostridium sp. YL32在CRC组织中相对丰度显著升高，未观察到总革兰氏阴性/阳性菌丰度与IMC检测LPS量的显著相关性。

LPS⁺免疫细胞的空间背景在CRC癌旁组织与配对CRC组织中存在差异。癌旁组织中，LPS⁺CD15⁺中性粒细胞与LPS⁺CD4⁺T细胞、CD11c⁺树突状细胞、CD163⁺巨噬细胞空间邻近；CRC组织中，LPS⁺中性粒细胞还与LPS⁺CD8⁺T细胞、CD68⁺巨噬细胞邻近，且空间聚类更强。癌旁组织中LPS⁺CD163⁺巨噬细胞与T细胞空间邻近，CRC组织中该邻近消失，但LPS⁺中性粒细胞与T细胞的邻近频率更高。核心差异为CRC组织中LPS⁺CD163⁺巨噬细胞和树突状细胞与T细胞的空间邻近丢失，而LPS⁺中性粒细胞与T细胞的邻近更频繁。

讨论部分指出，该研究揭示了CRC中细菌LPS定位及菌群-免疫互作从癌旁组织向肿瘤微环境的转变：三维成像证实CRC组织存在区域性LPS聚集，单位体积细菌生物量高于癌旁，支持既往研究结论，同时提示LPS分布的异质性意味着小块2D组织学可能漏检细菌。LPS与免疫细胞的高共定位、CRC中LPS⁺细胞与免疫细胞浸润的正相关，与“细菌富集区上皮密度降低”的报道一致。免疫细胞组成变化表现为：CD11c⁺树突状细胞在癌旁组织中高频结合LPS，但在CRC中缺失，可能与肿瘤分泌因子抑制其发育有关；CD163⁺巨噬细胞在癌旁组织中高表达且与LPS结合，其在CRC中的减少与既往报道一致，该分子可作为细菌受体介导局部炎症。中性粒细胞在癌旁组织中已存在，反映肠屏障完整性受损，其共表达颗粒酶B提示可能为N1样抗肿瘤亚型，但也可能通过形成中性粒细胞胞外诱捕网(NET)发挥免疫抑制作用，其与T细胞的空间邻近提示可能存在功能调控。总体而言，CRC中并非单一菌种驱动免疫变化，而是易位细菌、LPS及其他产物共同塑造免疫景观。该研究为理解CRC发病机制提供了空间层面的菌群-免疫互作证据，也为开发基于菌群的治疗策略奠定了基础。