基于单克隆抗体的方法开发，用于从复杂的粪便菌群中选择性富集目标长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）

《Gut Microbes Reports》：Development of a monoclonal antibody-based approach for selective enrichment of target Bifidobacterium longum from a complex fecal community

　　摘要：个体间肠道微生物群组成的差异凸显了需要开发能够从复杂的微生物群落中选择性富集宿主相关细菌的方法。传统的培养方法缺乏针对性富集所需的精度，限制了个性化微生物组研究的进展。在这里，我们建立了一种基于单克隆抗体的概念验证策略，用于选择性富集目标肠道细菌。我们生成了一种单克隆抗体（8H2），该抗体对人类来源的Bifidobacterium longum Jih1表现出优先反应性，并证明它可以从特定的细菌混合物和人类粪便样本中选择性富集活的Jih1细胞。蛋白质组和遗传分析表明，8H2识别谷氨酰胺合成酶（GS），这种酶通常定位于细胞内部，但在Jih1细胞表面也能检测到。这种表面结合使得抗体能够结合，并在复杂的微生物群落中实现选择性富集。这些数据支持了基于抗体的活细菌选择性富集的可行性，并暗示其在个性化营养和基于微生物组的干预中的潜在应用。

关键词：单克隆抗体；Bifidobacterium longum；微生物组；选择性富集；免疫磁分离

引言：大量微生物定植于人体肠道，总数量约为38万亿个细菌细胞。

尽管持续暴露于环境和饮食的干扰下，肠道微生物群通常仍能保持功能稳定性，这一特性通常被称为微生物的稳健性。然而，肠道微生物稳健性的破坏可能导致与肠道相关的疾病的发生，包括代谢性或系统性的疾病。与健康人肠道微生物群相比，改变的肠道微生物组成被广泛定义为菌群失调。已经提出了多种策略来恢复微生物平衡，包括益生菌补充。然而，所施用菌株的持续定植和长期维持仍不一致。越来越多的证据表明，不同个体间的定植模式存在显著差异，这表明宿主相关细菌可能对个性化的微生物稳定性和功能有所贡献。在这些努力中，使用选择性培养基的传统方法可能效率低下且耗时，因为它们无法区分非目标物种。此外，大约三分之一到三分之二的肠道细菌分类群仍然缺乏可培养的代表，许多培养策略依赖于对缺乏明显表型标记的细菌的随机回收，使得低丰度或表型不明显的细菌特别难以获得。为了克服这些限制，已经开发了几种基于抗体的细菌富集方法。原则上，抗体可以捕获目标细菌，无论其丰度或生长特性如何， recent研究已经证明了使用抗体介导的方法成功富集了无法培养的物种。2023年，一种覆盖有单克隆抗体的免疫磁珠方法使得从人工粪便样本中富集和培养Fusobacterium nucleatum成为可能。然而，多克隆抗体固有的抗原特异性有限且批次间存在变异性，这可能限制其可重复性和靶向性能。后来的研究报道了一种针对Bifidobacterium的单克隆抗体，但该抗体对该属内的多种物种表现出多反应性，突显了实现高度选择性富集的挑战。总的来说，这些发现表明，选择性培养基和现有的基于抗体的方法在实现复杂微生物群落中目标细菌的可靠和可重复富集方面仍有局限性，改进方法学可能会提高基于单克隆抗体的富集方法的性能。在这里，我们旨在建立一种基于单克隆抗体的选择性富集方法作为概念验证。与多克隆抗体相比，针对细菌的单克隆抗体具有明确的抗原结合特异性、低背景信号和可重复的性能。

我们使用最近开发的用于快速生成针对复杂微生物抗原的高亲和力单克隆抗体的二次淋巴器官移植（SLOT）技术，生成了一种对目标细菌具有优先反应性的单克隆抗体。我们使用Bifidobacterium longum Jih1作为这个概念的验证菌，这是一种研究广泛、具有已报道的益生菌功能（包括支持黏膜屏障完整性和减轻肠道炎症）的人类共生细菌。Jih1是一种具有完全测序基因组的人类来源细菌。因此，我们使用这种细菌来评估基于单克隆抗体的方法在复杂微生物群落中进行选择性富集的可行性和实用性。

结果：评估目标细菌B. longum Jih1
为了选择合适的单克隆抗体开发和选择性富集评估模型细菌，我们首先考虑了Bifidobacterium longum，这是一种众所周知的益生菌。有效的益生菌功能不仅取决于细菌的存活能力，还取决于其建立稳定定植和与宿主免疫系统相互作用的能力。在我们对候选细菌的初步表征过程中，我们观察到人类来源的B. longum Jih1在无菌小鼠中可重复地胜过JCM1217菌株（补充图1A），并且在测试条件下产生更高的MV（细菌膜囊泡）产量（补充图1B）。越来越多的证据表明，细菌膜囊泡可能有助于宿主定植过程，包括宿主免疫刺激和微生物适应性。基于其人类来源、完整的基因组序列以及作为实验易处理模型细菌的适用性，Jih1被选为评估基于SLOT的单克隆抗体生成和目标细菌选择性富集的模型细菌。

使用SLOT方法生成针对B. longum Jih1的单克隆抗体
为了生成针对Jih1的单克隆抗体，我们使用了二次淋巴器官移植（SLOT）方法，这是对先前开发的人工淋巴结基抗体生产系统的体内适应。首先，通过腹腔注射给BALB/c小鼠接种Jih1，然后将每只小鼠的脾脏移植到免疫缺陷的SCID小鼠的肾皮质下空间。移植后，通过静脉注射给SCID小鼠再次接种Jih1，并提取脾脏用于抗体生产。图1A显示了抗体生产方案。

评估目标细菌B. longum Jih1
为了选择适当的单克隆抗体开发模型细菌，我们首先考虑了Bifidobacterium longum，这是一种公认的益生菌。有效的益生菌功能不仅取决于细菌的存活能力，还取决于其建立稳定定植和与宿主免疫系统相互作用的能力。在对该候选细菌的初步表征过程中，我们观察到人类来源的B. longum Jih1在无菌小鼠中可重复地胜过JCM1217菌株（补充图1A），并在测试条件下产生更高的MV产量（补充图1B）。越来越多的证据表明，细菌膜囊泡可能有助于宿主定植过程，包括宿主免疫刺激和微生物适应性。基于其人类来源、完整的基因组序列以及作为实验易处理模型细菌的适用性，Jih1被选为评估基于SLOT的单克隆抗体生成和目标细菌选择性富集的模型细菌。

利用SLOT方法生成针对B. longum Jih1的单克隆抗体
为了生成针对Jih1的单克隆抗体，我们使用了二次淋巴器官移植（SLOT）方法，这是对先前开发的人工淋巴结基抗体生产系统的体内适应。首先，通过腹腔注射给BALB/c小鼠接种Jih1，然后将每只小鼠的脾脏移植到免疫缺陷的SCID小鼠的肾皮质下空间。移植后，通过静脉注射给SCID小鼠再次接种Jih1，并提取脾脏用于抗体生产。图1A显示了抗体生产方案。

为了测量单克隆抗体的抗原特异性，我们通过酶联免疫吸附测定（ELISA）筛选了Jih1和Bifidobacterium longum JCM1217的膜组分，并评估了它们对多种细菌（包括目标细菌Jih1）的反应性。对于杂交瘤筛选，我们选择了对Jih1表现出优先反应性并保持增殖能力的克隆，最终选择了杂交瘤克隆8H2。然后我们使用荧光激活细胞分选（FACS）分析了8H2单克隆抗体在培养上清液中的反应性。8H2对某些细菌的结合信号不到Jih1的三分之一，这与优先结合一致。因此，我们假设8H2可以选择性地结合Jih1细胞，从而支持从复杂微生物群落中的富集。此外，由于FACS分析显示强烈的信号（图1B），我们使用8H2对Jih1进行了免疫荧光染色。8H2成功染色了Jih1，但未染色IgG阴性对照（图1C）。这些发现表明8H2不仅可用于FACS，也可用于免疫荧光染色。为了进一步评估SLOT方法的应用范围，我们还生成了一种针对Phocaeicola dorei（先前称为Bacteroides dorei）的抗体，这是一种从人类粪便样本中分离出的革兰氏阴性细菌。使用相同的方法，我们成功生成了一种优先识别P. dorei的抗体，而对其他Bacteroides物种的反应性有限（补充图2）。这一结果表明SLOT可以生成具有选择性反应性的单克隆抗体，支持其在选择性细菌富集中的潜力。

使用8H2从复杂肠道细菌群落中选择性富集Jih1
接下来，我们旨在确定8H2是否可以支持从特定微生物混合物中选择性富集Jih1。为此，我们采用了磁激活细胞分选（MACS）作为分离方法。MACS是一种免疫磁分离技术，其中通过磁珠捕获抗体结合的目标细胞。MACS是一种多功能方法，可在有氧和厌氧条件下使用紧凑型仪器进行。在各种MACS平台中，我们选择了Mojo设备，这是一种适合处理多种细菌样本的简单无柱系统。为了评估性能和可重复性，我们使用独立的技术重复实验处理了六种细菌溶液，其中包括典型的肠道细菌物种和目标细菌Jih1（图2A）。MACS分别使用单独的磁珠、同型对照抗体或8H2进行（图2A）。在8H2结合的洗脱 Fraction中检测到的Jih1水平显著高于相应对照（图2B），表明即使在存在多种肠道细菌物种的情况下，也能实现Jih1的选择性和可重复富集。这种可重复性对于证明该富集方法的实际应用至关重要。为了进一步评估富集效果，我们进行了16S核糖体RNA（rRNA）基因分析，以确定Jih1是否在抗体结合的 Fraction中富集。从MACS分离的所有 Fraction中提取DNA，并通过16S rRNA基因测序分析每个溶液中细菌的组成。与IgG对照洗脱 Fraction相比，Jih1在8H2洗脱 Fraction中的丰度约高3.9倍（图2C），这与从特定细菌混合物中选择性地富集Jih1一致。接下来，我们检查了磁珠结合的细菌是否可培养。菌落形成单位（CFU）测定表明，磁珠-抗体-细菌复合物能够在琼脂平板上形成菌落（图2D）。因此，富集程序保持了细菌的存活能力，支持需要选择性富集后进行活细菌培养的后续应用。此外，为了鉴定洗脱 Fraction中的特征细菌，我们使用线性判别分析效应大小（LEfSe）分析了8H2结合洗脱 Fraction和流过 Fraction的细菌组成。分析显示，B. longum在8H2洗脱 Fraction中富集，而Phocaeicola（先前称为Bacteroides）和Segatella（先前称为Prevotella）在流过 Fraction中更丰富（补充图3）。最后，我们测试了8H2是否可以直接从未经预先添加的粪便样本中富集Jih1。使用8H2进行MACS后，Jih1的相对丰度增加，富集的细菌在选择性琼脂平板上形成了菌落（图2E和补充图4）。总之，这些结果表明8H2支持从特定的微生物群落和人类粪便样本中可重复地选择性富集活的Jih1细胞。

图2. 从含有Jih1的细菌混合物或添加了Jih1的粪便微生物群中选择性富集目标细菌。（A）MojoSort富集B. longum Jih1的示意图。（B）条形图显示了每个 Fraction中的B. longum细胞数量。NA表示仅用anti-APC磁珠孵育的样本。使用Tukey的多重比较测试计算了流过（Flow）和洗脱（Elu）之间的显著差异。***P<0.001。****P<0.0001。数据代表了使用相同细菌库中新鲜制备的混合物进行四次技术重复实验所得的平均值。（C）条形图显示了流穿和洗脱组分中前15个属级别的分类单元及其相对丰度。数据代表了来自三次技术重复实验的平均值，这些实验在一次16S rRNA基因测序中进行分析。（D）对Jih1进行磁珠分选后的重新培养。图表显示了分选前（之前）和分选后（流穿：Flow；洗脱：Elu）的菌落数量。组分之间的显著性通过Tukey多重比较检验显示。*P<0.05。***P<0.001。数据代表了六次技术重复实验的平均值。（E）使用细菌培养上清液进行的直接PCR。Isolation1-3，Iso.1–Iso.3；B. longum类型菌株1217，JCM1217；人源B. longum分离株F5，F5；NC，阴性对照。条形图显示了每种细菌培养24小时后的OD600值。数据代表了三次技术重复实验的平均值。

这个五部分的图表展示了细菌的富集过程。图a描述了MojoSort富集机制：抗APC磁珠与APC结合的 secondary 抗体结合，这些 secondary 抗体再与Jih1细菌结合。混合物通过磁铁分离成流穿和洗脱两部分。图b的条形图显示了Bifidobacterium longum的细胞数量（1x10^3至1x10^9），分别对应NA Beads、Isotype和8H2三个组，每个组都有流穿和洗脱组分。NA Beads组的流穿和Isotype组分含量较高，而8H2组的流穿组分含量较低。8H2组的洗脱组分含量较高。所有流穿与洗脱组分的比较都存在显著差异（4个星号）。图c的堆叠条形图显示了NA Beads、Isotype和8H2在15个属级别分类单元中的相对丰度（0-100%）。在NA Beads和Isotype组中，Bifidobacterium的比例较低，而在8H2组中比例较高。图d的条形图显示了Bifidobacterium longum的CFU/mL值（1x10^3至1x10^7），分别对应分选前、流穿和洗脱后的结果。分选前的值较高，流穿后的值较低，洗脱后的值较高。分选前与流穿之间有显著差异（3个星号），分选前与洗脱之间没有显著差异（ns），流穿与洗脱之间有1个星号。图e展示了两个凝胶电泳图像和一个条形图。上面的凝胶显示了Iso.1、Iso.2、Iso.3、Jih1、JCM1217和NC的Jih1特异性引物结果，只有这些样本有条带，而JCM1217、F5和NC没有条带。下面的凝胶显示了相同样本的Bifidobacterium物种引物结果，所有样本都有条带。

为了识别被SLOT抗体识别的Jih1抗原靶点，我们首先筛选了候选靶点分子。从Jih1中制备了细胞壁组分，并用8H2或同型对照抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀结果显示，在8H2结合的组分中富集了一种约55千道尔的蛋白质（图3A, B）。该蛋白质随后被分离、纯化，并通过质谱鉴定为I型谷氨酸-氨 ligase，也称为谷氨酰胺合成酶（GS）。GS由glnA编码，在氮代谢中起重要作用，并在不同细菌物种中保守。

我们假设GS结构和/或表达的差异可能会使某些细菌无法被8H2选择，因此我们继续分析GS蛋白以更好地理解其选择反应性的基础。

图3显示了GS作为8H2靶抗原的鉴定。（A）使用IgG3κ和8H2进行了目标蛋白的免疫沉淀（IP）。数据代表在相同条件下进行的三次技术重复实验的代表性图像。（B）免疫沉淀样品的银染色。箭头指向目标蛋白。数据代表在相同条件下进行的三次技术重复实验的代表性图像。（C）Bifidobacterium物种中GS的Western blot检测。B. l. Jih1：B. longum Jih1菌株；B.a.：B. adolescentis；B.br.：B. breve；B.l. 7054：B. longum JCM7054；B.l. 1217：B. longum JCM1217；B.i.：B. infantis；B.bi.：B. bifidum；B.p.：B. pseudocatenulatum。箭头指示谷氨酰胺合成酶（GS）。数据显示来自在相同条件下分析的所有细菌裂解物的一个实验。（D）在野生型大肠杆菌（E.c. WT）和glnA缺失大肠杆菌（E.c. ΔglnA）中检测GS的Western blot。数据来自一个技术实验。

这个四部分的图像展示了蛋白质的检测结果。图A是一个免疫沉淀凝胶，有两个条带，分别是IgG3 kappa洗脱和8H2洗脱。两个条带都显示了多个蛋白质条带，其中一个约55千道尔的条带被箭头标示为抗体靶点。图B是一个银染色的免疫沉淀凝胶，也有两个条带，分别是IgG3 kappa洗脱和8H2洗脱。两个条带都显示了多个蛋白质条带，其中一个约55千道尔的条带被标记为抗体靶点。图C是一个Western blot，检测了不同Bifidobacterium物种中的谷氨酰胺合成酶。它有八个条带，分别标记为B.l. Jih1、B.a.、B.br.、B.l. 7054、B.l. 1217、B.i.、B.bi.和B.p.。在多个Bifidobacterium物种中检测到与GS相关的条带，信号强度各不相同（箭头所示）。图D是一个Western blot，检测了E. coli WT和E. coli delta glnA中的谷氨酰胺合成酶。它有两个条带，分别是E.c. WT和E.c. ΔglnA。E.c. WT条带中有一个约60千道尔的条带，而E.c. ΔglnA条带中没有这个条带（箭头所示）。

我们通过Western blot检测了不同Bifidobacterium物种中的GS表达情况，发现尽管GS在所有测试物种中普遍表达，但表达水平各不相同（图3C）。有趣的是，序列分析表明，GS在密切相关的Bifidobacterium物种中高度保守，具有超过90%的序列一致性（补充图5），并与大肠杆菌GS有大约50%的氨基酸一致性（补充图5）。我们使用glnA缺失的大肠杆菌突变体进行Western blot实验，测试了8H2对大肠杆菌来源GS的反应性。对于野生型（WT）菌株，我们选择了E. coli BW25113，因为它的遗传背景明确且适合可重复的实验。Western blot分析显示，在glnA缺失的大肠杆菌中没有检测到信号，而在野生型大肠杆菌中检测到了信号（图3D），这支持了GS确实是8H2识别的抗原的结论（图3C,3D）。然而，尚不清楚这种广泛保守的细胞内酶如何成为8H2的靶点。进一步的调查显示，Jih1可以通过FACS检测到8H2的结合（图1B），这表明GS可能位于细胞表面；免疫荧光染色显示Jih1细胞表面确实表达了GS。值得注意的是，这种表面表达模式在其他人源B. longum中并不明显，这些细菌的细胞表面染色迹象也很有限（图4）。总体而言，这些发现表明Jih1可能表现出独特的GS定位模式，这可能有助于解释8H2的选择性反应性和在复杂微生物群中观察到的Jih1富集现象。

在这项研究中，我们使用SLOT生成了针对目标细菌具有选择性反应性的单克隆抗体（图1，补充图2）。由于SLOT之前从未被应用于整个细菌细胞作为靶点，我们的结果表明这种方法能够生成具有明确抗原结合特性和对选定细菌具有选择性反应性的单克隆抗体。值得注意的是，在筛选过程中排除了与Jih1以外的多个分类单元发生交叉反应的单克隆抗体。我们还获得了一种针对P. dorei的单克隆抗体，在测试条件下没有检测到其与密切相关的Bacteroides亚种或Parabacteroides distasonis的交叉反应性（补充图2）。在人工淋巴结移植的背景下，已经证明抗原特异性抗体形成细胞、生发中心B细胞和记忆B细胞会被富集。类似的免疫机制可能有助于本研究中观察到的选择性反应性抗体的产生。通过进一步应用SLOT，我们开发了一种使用具有选择性反应性的单克隆抗体来富集目标人源细菌的方法（图1A–C和2A–D）。8H2单克隆抗体能够优先与Jih1反应，而对其他测试细菌的反应性较低。值得注意的是，8H2对Bifidobacterium bifidum、Segatella copri和Lactobacillus gasseri的反应性约为20.7±2.9%（图1B），这表明8H2可能识别这些细菌膜表面共同的物理化学特征。然而，这些交叉反应的细菌物种并未在MACS洗脱组分中被检测到，这与从定义明确的细菌群落和人粪便样本中选择性富集目标细菌的结果一致（图2C,E）。因此，观察到的交叉反应性水平与本研究使用的富集程序相容。此外，富集的细菌仍然具有活力并可重新培养（图2D,E），表明这种方法可能支持从人类粪便微生物群中选择性地富集活细菌并进行培养。综上所述，这种方法可能通过从复杂微生物群中获取可培养的、选择性富集的个体相关细菌来支持个性化微生物组研究。

氨基酸序列的差异本身不太可能完全解释Jih1的细胞外定位，如我们比较Jih1的glnA序列与密切相关物种的序列所显示的（补充图5）。与野生型B. longum菌株不同，后者表现出内部和外部染色，Jih1主要表现出细胞外的GS定位（图4）。如图3D所示，在glnA缺失突变体中未检测到信号，这支持抗体在测试条件下识别了GS。尽管GS传统上被认为是细胞内必需的酶，用于催化谷氨酸和氨的缩合生成谷氨酰胺，但在Jih1中主要表现为表面定位。尽管GS具有这种传统的细胞内作用，但Jih1表现出明显的表面相关GS信号。尽管Jih1中GS暴露的机制尚不清楚，但这些观察结果支持GS表面定位可能是Jih1的表型特征，并表明GS是与SLOT衍生单克隆抗体的选择性反应性相关的抗原。先前的研究尚未报告在密切相关的细菌中鉴定出能够实现选择性富集的靶抗原。我们的研究确定GS是与Jih1中选择性抗体反应性相关的抗原，支持在测试条件下实现选择性富集的可行性。然而，必须指出的是，菌株水平的选择性尚未得到验证，结果可能会根据使用这些抗体的具体环境而有所不同。例如，我们基于GS的8H2抗体可能在包含其他表现出细胞表面GS细菌的环境中无法富集B. longum Jih1。我们假设我们的方法最适合用于个体内或纵向研究，因为在这些研究中可以情境性地验证抗体的选择性。这种具有选择性反应性的抗体可能为监测同一宿主体内相关细菌的持久性和动态提供有用的工具，从而支持对个体内微生物组变异的纵向分析。相比之下，我们的研究在Jih1中识别出一个独特的抗原和GS表达模式，为我们的方法选择性富集目标细菌提供了概念验证的支持。未来专注于表达表面相关或差异表达蛋白质的细菌的研究可能通过基于抗体的方法促进选择性富集。鉴于这种方法成功生成了一种针对P. dorei的选择性反应性单克隆抗体，它可能适用于更广泛的肠道细菌。然而，我们强调需要跨更多分类单元进行额外的研究，以充分定义其范围和局限性。总的来说，我们的研究为基于单克隆抗体的目标细菌选择性富集提供了一个实用的概念验证。这种方法可能通过实现相关细菌的选择性富集和监测，并促进下游的分子和功能分析，从而有助于个性化微生物组的研究。

**方法**

**动物实验**
动物从CLEA Japan购买，并在庆应义塾大学的动物设施中饲养。无菌小鼠在筑波大学的动物设施中的无菌隔离器中繁殖和饲养。动物实验协议得到了庆应义塾大学和筑波大学机构动物护理和使用委员会的批准。

**细菌培养**
本研究中使用的细菌列表见表1。Bifidobacterium longum Jih1（Jih1）、F5、Isolation 1、Isolation 2和Isolation 3菌株是从一名健康人身上分离出来的。其他类型的菌株从RIKEN BRC日本微生物收藏中心（JCM）购买。这些细胞在5.0 mL的Gifu厌氧培养基（GAM）（Nissui，日本）中于37°C下培养24-48小时，使用BACTRON 300厌氧室（Shel Lab，美国）。培养后的细菌通过4400 g离心15分钟在4°C下收集。细菌沉淀物用无菌1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，然后储存在-80°C直至实验使用。

**二次淋巴器官移植（SLOT）**
培养的Jih1通过4400 g离心15分钟在4°C下收集。细菌沉淀物用5.0 mL无菌PBS洗涤，然后再次用4400 g离心5分钟在4°C下收集。之后再进行两次洗涤。细菌沉淀物用VD-800R冻干机（TAITEC，日本）干燥24小时。8周大的BALB/cAJcl雌性小鼠从CLEA Japan购买。所有小鼠（n=5）每两周通过腹腔注射（i.p.）接受100 μg的全细菌（1.0 mg/mL）和完全弗劳德佐剂（Thermo Scientific，美国）两次免疫。从两只免疫小鼠中取出脾脏并切碎。将小块的脾脏移植到8周大的FOX CHASE SCID CB-17/1cr-scid（CLEA，日本）（SCID）小鼠（n=3）的纤维囊下。其他三只免疫的BALB/cAJcl（BALB/c）小鼠作为对照组，未接受SLOT处理。移植一周后，移植受体小鼠和对照组小鼠每两周通过静脉注射（i.v.）接受100 μg的全细菌稀释在无菌PBS中五次进一步免疫。杂交瘤的建立和抗体的纯化由BioGate Co., Ltd.完成。

**细菌荧光激活细胞分选（FACS）**
每种细菌菌株的甘油储备液在GAM液体培养基中于37°C下厌氧条件培养24小时。细菌悬浮液在4400 × g下离心5分钟在4°C下，然后去除上层清液。1×10^7个细菌用2.0%（w/v）BSA/PBS封闭30分钟在4°C下。悬浮液在17,800 g下离心5分钟在4°C下。这些细菌沉淀物样本用100.0 μL的杂交瘤细胞培养上清液在4°C下悬浮30分钟。使用小鼠抗IgG3同型对照（MG3-35，BioLegend）稀释在2.0% BSA/PBS中作为阴性对照。对于P. dorei的筛选，使用小鼠抗IgG2a同型对照（MG2a-53，BioLegend）。样品洗涤后与20 μg/ml山羊抗小鼠IgG二抗[FITC]（Abcam）在4°C下孵育30分钟。样品用400 μL无菌1×PBS重新悬浮后，在Accuri C6 Plus（BD Bioscience）上分析。根据FSC-SSC值选择细菌群体。这个门内FITC阳性细胞的比例定义为抗体反应率。同型对照染色的群体用作每次比较的背景。

**六种细菌混合物和人类微生物群 suspension 的制备**
六种细菌混合物包括Jih1、B. coccoides、L. gasseri、S. copri、P. distasonis和B. uniformis。这些细菌用含有2.0%（w/v）BSA（Jackson ImmunoResearch，美国）的无菌PBS调整至1.0×10^7个细胞，并以相等体积混合。六种细菌混合物的总量为6.0×10^7个细胞。为了制备定义的微生物群落，通过过滤人类粪便悬浮液中的固体物质来制备人类肠道微生物群溶液。目标细菌Jih1（OD=0.1）加入到肠道细菌溶液（OD=0.5）中，从而使Jih1占总溶液的大约16.7%。粪便悬浮液使用1000、500、100、40和20 μm过滤器（pluriStrainer，pluriSelect，德国）过滤以去除未消化的食物。人类微生物群悬浮在含有2.0%（w/v）BSA（Jackson ImmunoResearch，美国）的无菌PBS中。然后，向8.0×10^7个人类微生物群细胞中加入1.0×10^7个Jih1细胞。

**通过MojoSort富集目标细菌**
六种细菌混合物或加入Jih1的人类微生物群悬浮液用2.0% BSA/PBS在室温下封闭15分钟。样品与10 μg/mL的8H2抗体或纯化的小鼠IgG3同型对照抗体（BioLegend，美国）在2.0% BSA/PBS中孵育30分钟在4°C下，然后用无菌PBS洗涤三次。之后，样品与山羊抗小鼠IgG交联二抗（APC，2.0 μg/mL：Thermo Fisher Scientific，美国）在2.0% BSA/PBS中孵育30分钟，再用无菌PBS洗涤三次。细菌沉淀物用MojoSort缓冲液（BioLegend，美国）溶解，然后加入10.0 μL的MojoSort小鼠抗APC纳米珠（BioLegend，美国）并在4°C下孵育15分钟。样品用无菌PBS洗涤三次后重新悬浮在MojoSort缓冲液中。然后将它们放入MojoSort磁铁（BioLegend，美国）中5分钟在室温下，之后收集流过部分。这个过程重复两次，之后将管子从磁铁中取出。流过部分和洗脱部分都用17,800 g离心5分钟在4°C下。沉淀物用无菌水或PBS溶解。收集沉淀物后，使用相应的沉淀物提取DNA，并进行qPCR和16S rRNA基因测序。

**DNA提取**
DNA样本从细菌沉淀物中提取。DNA提取按照之前的研究方法进行，进行了一些修改。

**引文**

**定量PCR**
PCR混合物（20.0 μL）包含10.0 μL的SYBR Premix Ex Taq II（Takara，日本）、0.4 μL的ROX Reference Dye（50×）、0.8 μL的物种特异性引物（浓度为10.0 μM）、6.0 μL的超纯水和2.0 μL的模板DNA（浓度为10.0 ng/μL）。使用细菌特异性引物（表2）通过Step-One Real-Time PCR系统（Applied Biosystems，美国）估计Phocaeicola（以前称为Bacteroides）、Segatella（以前称为Prevotella）、P. distasonis和B. longum的丰度。使用的扩增程序如下：一个循环为95°C 30秒，接着是40个循环，每个循环包括95°C 5秒、60°C 60秒，最后三个循环分别为95°C 15秒、60°C 1分钟和95°C 15秒。B. longum的丰度通过16S rRNA基因（表2）的相对丰度计算得出。

**16S rRNA基因测序**
使用细菌通用引物27F-mod（5′-AGRGTTTGATYMTGGCTCAG-3′）和338R（5′-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′）和Tks Gflex DNA聚合酶（Takara，日本）扩增16S rRNA基因的V1–V2可变区域。扩增子DNA使用MiSeq（Illumina，美国）根据制造商的协议进行测序。测序读数使用Quantitative Insights into Microbial Ecology 2（QIIME 2，版本2019.7）和DADA2处理以生成扩增子序列变异（ASVs）。分类分配使用SILVA 132数据库完成。样本的最小读深度为每个样本10,568个读数。

**LDA分析**
使用线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）工具（http://huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/）识别洗脱部分和流过部分之间差异丰富的分类单元。非参数Kruskal-Wallis检验和未配对Wilcoxon秩和检验用于识别样本组间差异丰富的分类单元，LDA方法用于估计给定组内每个特征/分类单元的效应大小。

**从人类粪便样本中选择性富集Jih1**
使用肠道细菌溶液（OD=1.0）和8H2抗体进行MojoSort。目标部分接种到TOS丙酸琼脂培养基（Yakuruto Pharmaceutical Industry，日本）上并允许其形成菌落。收集菌落并在GAM液体培养基中培养，并进行OD600测量。通过离心收集细菌沉淀物并用PBS洗涤。沉淀物用水或PBS重新悬浮后用于PCR和革兰氏染色。使用Tks Gflex DNA聚合酶（Takara，日本）进行PCR，使用以下扩增程序：一个循环为95°C 5分钟，接着是25个循环，每个循环包括98°C 10秒、56°C 15秒和68°C 30秒，最后68°C 3分钟，之后样本保持在4°C。

**革兰氏染色**
细菌涂片在载玻片上热固定。加入结晶紫1分钟并用水冲洗。加入碘溶液30秒，然后用水冲洗。重复此过程一次。加入乙醇-丙酮进行脱色，然后用水冲洗。加入基于品红溶液1分钟，然后用水冲洗进行复染。载玻片在OLYMPUS BX53油浸显微镜下检查。

**免疫沉淀**
根据先前报道的方法（Candela M等人，J Bacteriol. 2007. PMID: 17557824）从90 mL的细菌培养沉淀物中提取Jih1细胞壁蛋白。简而言之，Jih1通过在4°C下以5000 rpm离心10分钟收集。细菌沉淀物用50 mM Tris-HCl（pH 7.6）洗涤两次。然后用含有50 mM Tris-HCl（pH 7.6）/1 M蔗糖/15 mg/mL Lysozyme/无EDTA的缓冲液（Roche，奥地利）重新悬浮，并在4°C下孵育90分钟。细胞壁蛋白在4°C下以4000 rpm离心3分钟收集。样品在-80°C下储存直至实验使用。细胞壁蛋白与Protein A Dynabeads和10 μg 8H2抗体在PBS-T中在4°C下孵育过夜。免疫沉淀物回收，洗涤后用NuPAGE 4%–12.0% Bis–Tris凝胶（Novex，美国）溶解，并用8H2抗体同型对照IgG进行免疫印迹。使用HRP偶联的二抗（Jackson ImmunoResearch，美国）可视化感兴趣的蛋白质，并用SuperSignal West Dura延长持续时间底物（Thermo Fisher，美国）增强。

**质谱**
免疫沉淀物样本蛋白在NuPAGE 4%–12.0% Bis–Tris凝胶中通过MOPS缓冲液（Invitrogen，美国）电泳。SDS凝胶中的蛋白质按照Kanto III银染剂（Kanto，日本）的制造商说明书进行染色。目标条带从凝胶中切割出来，并在日本IDEA咨询公司（IDEA consultants, Inc.）进行了质谱分析。

**Western blotting**
双歧杆菌和大肠杆菌在GAM培养基中厌氧条件下培养。将细菌置于含有完整蛋白酶抑制剂（无EDTA）的PBS中，通过超声处理（TOMY，日本）或玻璃珠机械破碎（Shakemaster，Bio Medical Science Inc.，日本）进行匀浆。蛋白质浓度使用BCA蛋白测定试剂（Takara，日本）测定，然后将蛋白质量标准化后，在6X SDS样品缓冲液中（Nacalaitesque，日本）于95°C下加热10分钟变性。2或10微克的细菌蛋白在NuPAGE 4%–12.0% Bis–Tris凝胶中电泳，凝胶运行在MOPS缓冲液中（Invitrogen，美国），之后转移到PVDF膜上，并用5%脱脂牛奶（Wako，日本）在PBS-T中封闭。膜与2微克/毫升的8H2或同型对照IgG在4°C下孵育过夜。用PBST洗过的膜在室温下与0.5微克/毫升的辣根过氧化物酶结合的二抗孵育1小时，然后洗涤并暴露于SuperSignal West Dura（Thermo Fisher Scientific，美国）的延长期底物中。目标蛋白质通过化学发光检测系统（BioTools MISVS II，BioTools，日本）检测。

**免疫荧光显微镜**
细菌用10%甲醛溶液（Wako）在室温下固定15分钟，然后用水冲洗三次。将样品放置在玻璃载玻片上（Matusnami，日本）并彻底干燥。进一步使用甲醇（Wako，日本）进行固定，之后用2.0% BSA/PBS封闭15分钟，并用PBS-T冲洗三次。接着，样品与5微克/毫升的8H2或纯化的小鼠IgG3同型对照抗体（BioLegend，美国）在2.0% BSA/PBS中孵育30分钟，然后用PBS冲洗。随后，样品与山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 488（2微克/毫升：Thermo Fisher Scientific，美国）在2.0% BSA/PBS中孵育30分钟，再用PBS冲洗。细菌用Hoechst 33342（Thermo Fisher Scientific，美国）进行复染。用PBS冲洗后，用盖玻片覆盖样本并在荧光显微镜下观察。荧光显微镜图像使用BX53（OLYMPUS，日本）和Mosaic 2.4软件（BioTools，日本）获取。图像分析使用ImageJ进行。

**体内竞争实验**
为了研究Jih1与B. longum JCM 1217之间的竞争，雌雄BALB/c GF小鼠在无菌隔离器中喂食正常饮食。Jih1和B. longum JCM 1217在37°C的GAM培养基中厌氧条件下一培养，稀释至OD=1.0/mL，然后以1:1的比例混合。将细菌悬浮液口服给予无菌小鼠。在第0天以及第1周、第2周、第3周和第5周收集小鼠的粪便。粪便样本在-80°C下保存直至实验进行。根据制造商的说明书，使用ISOPLANT II（NIPPON GENE，日本）从小鼠粪便中提取DNA。通过菌株特异性引物组（表2）使用qPCR测定每种B. longum菌株中的DNA含量。

**膜泡的纯化和定量**
Jih1和B. longum JCM 1217在25毫升的MRS（BD，美国）培养基中于37°C下厌氧条件培养24小时（MGC，日本）。培养上清液在4°C下以6000 g离心20分钟，然后通过0.45微米孔径的聚偏二氟乙烯（PVDF）滤膜（Millipore，德国）过滤。过滤后的上清液在4°C下以200,000 g超速离心1小时，沉淀物用PBS洗涤。样品再次以200,000 g超速离心1小时，然后用100.0微升纯水稀释。膜泡用2.5微摩尔的FM1-43（Invitrogen，美国）染色，并使用荧光板读数仪（Synergy H1 BioTek，Agilent，美国）进行定量。

**glnA同源性分析**
从双歧杆菌基因组中提取glnA1的氨基酸序列，包括B. animalis亚种ATCC 25527（NC_017834.1）、B. bifidum JCM 1255（NZ_AP012323.1）、B. breve JCM 1192（NZ_ACCG00000000.2）、B. longum亚种infantis JCM 1222（AP010889.1）、B. longum亚种longum JCM 1217（AP010888.1）、B. longum亚种longum JCM 7052（AP022379.1）和B. pseudolongum ATCC25526（NZ_CP093555.1）。从大肠杆菌BW25113（NZ_CP009273.1）中提取的glnA1序列和glnA用于MAFFT多序列比对程序（v7.490），该程序在Geneious Prime 2023.1.2中实现。

**统计分析**
统计分析使用R版本4.2.2或Prism软件版本8.4.3（GraphPad）进行。杂交瘤培养上清液和膜泡产生的反应性的显著性指标使用Welch校正的单侧t检验计算。不同组分（流经组分、洗脱组分和预富集组分）之间的显著差异使用Tukey多重比较检验计算。在本研究中，生物学重复指的是独立处理的动物，而技术重复指的是在同一实验条件下对同一样本进行的多次测量。除非另有说明，实验均使用技术重复进行。每个实验中使用的重复类型和数量在相应的图例中指定。

**伦理批准**
使用人类粪便样本的实验获得了神奈川工业科学技术研究所（KISTEC）的伦理委员会批准，批准编号为S-30-03、J-2020-03、S-2021-01和S-2022-04。动物实验方案获得了庆应义塾大学（批准编号14068-(1)）和筑波大学（批准编号23-184）的机构动物护理和使用委员会的批准。

**补充材料**
补充材料：下载MS Word文件（11.1 MB）：KGMR-2025-0062.R3 Supplemental_data.docx

**数据可用性声明**
本研究中生成的16S rRNA基因扩增子序列文件可在日本DNA数据库（DDBJ）中找到，文件编号为PRJDB17673。如需获取本研究的数据，可联系相应作者[S.F.]。

本文的补充数据可从以下网址获取：https://doi.org/10.1080/29933935.2026.2663732